分子生物学实验-质粒的提取和酶切鉴定.ppt

The extraction andendonuclease cleavage of plasmid质粒的提取和酶切鉴定huang chunhong掌握质粒掌握质粒DNA提取的原理与方法提取的原理与方法 了解了解DNA限制性核酸内切酶酶切限制性核酸内切酶酶切鉴定原理鉴定原理 质粒为环状双链质粒为环状双链DNA，它是染色体，它是染色体DNA之外之外的单独复制单元。质粒一般存在于细菌细胞中，并的单独复制单元。质粒一般存在于细菌细胞中，并常用于常用于DNA重组，用于外源基因的克隆和表达。重组，用于外源基因的克隆和表达。质粒的分类与构成质粒的分类与构成克隆载体；表达载体克隆载体；表达载体原核质粒；真核质粒原核质粒；真核质粒质粒的构成质粒的构成 -复制起始位点复制起始位点 -多克隆位点（含多个内切酶位点，用于外源基因插入）多克隆位点（含多个内切酶位点，用于外源基因插入）-选择性标记（抗性基因）选择性标记（抗性基因）1.氨苄青霉素抗性，氨苄青霉素抗性，新霉素抗性。新霉素抗性。2.多克隆位点多克隆位点C端含有端含有myc表位表位标签和标签和His6标签。标签。Myc标签和标签和His6标签与外源蛋白融合表达，标签与外源蛋白融合表达，可以用以亲和层析分离和可以用以亲和层析分离和western blot3.Pcmv 巨细胞疱疹病毒启动子巨细胞疱疹病毒启动子4.BGHpA,牛生长因子牛生长因子polyA5.SV40 猴空泡病毒猴空泡病毒 SV40pA 猴空泡病毒猴空泡病毒polyA7.核糖体结合核糖体结合位点：位点：5300-5304bp6.pUC ori复制起始位点复制起始位点 f1 ori 噬菌体复制位点，能产噬菌体复制位点，能产生单链生单链DNA，可用于测序，可用于测序 T7启动子，比大启动子，比大肠杆菌肠杆菌RNA聚合聚合酶启动子强酶启动子强5倍倍pCDNA3.1/myc-His-IFT57重组质粒:6475bppCDNA3.1/myc-His：5497bp(讲义上错误)IFT57基因（intraflagellar transport 57，鞭毛内运输蛋白)：1270bp酶切位点：BamHI:GGATCC 920bp EcoRI:GAATTC 941bp质粒提取：碱裂解法 基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。染色体DNA：氢键断裂变性。质粒DNA：大部分氢键断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。（不完全变性）质粒质粒DNA：复性复性，溶于溶液中，溶于溶液中染色体染色体DNA：不能复性不能复性；形成缠连；形成缠连的网状结构。的网状结构。pH=12.6（碱性）NaAc溶液（pH4.8）pH=中性染色体染色体DNA与不稳定的大分子与不稳定的大分子RNA、蛋白质蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来复合物等一起沉淀下来离心溶菌酶可破坏菌体细胞壁，十二烷基硫酸钠（Sodium dodecyl sulfate,SDS）可使细胞壁裂解。细菌经溶菌酶和阴离子去污剂（SDS）处理后，细菌DNA缠绕附着在细胞壁碎片上，离心时易被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。再经酒精沉淀、洗涤处理，可得到质粒DNA。提取的质粒可有三种结构：线形、开环、闭环超螺旋。溶液溶液溶菌液：50mM 葡萄糖，25mM Tris-Cl(pH8.0)，10mM EDTA，2mg/ml 溶菌酶溶菌酶。溶液溶液 NaOH-SDS液：0.2N NaOH，1%SDS。溶液溶液 3mol/L NaAc（pH4.8）溶液：5M KAC 10ml，冰醋酸 11.5ml，水 28.5ml。质粒抽提：即去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，去除蛋白质及其它杂质，以得到相对纯净的质粒。如何去除 RNA使用 RNase 消化(抽提中或者抽提后)。经过 RNase 消化后，RNA 变得比较小了，其残留对酶切反应几乎没有影响。The principles of plasmid extraction如何将质粒与细菌基因组DNA分开利用 NaOH/SDS 完全裂解细菌，让质粒和细菌基因组 DNA 都从细菌中出来，再利用质粒和基因组 DNA 在变性/复性过程中的不同表现，将质粒与基因组 DNA 分开。去除蛋白质及其它杂质基本上是与去除细菌基因组同时实现的。但是，依据不同的细菌，不同的培养条件，以及操作时的精细程度等，杂质的残留量会不同。所以，通常需要使用苯酚做更进一步的纯化。提取步骤10000g离离心心1min1.5ml菌液菌液重复重复3次次沉淀沉淀250ulP1吹打吹打250ulP2350ulP3溶液清亮粘稠溶液清亮粘稠白色沉淀白色沉淀12000g离离心心10min上清上清500ul平衡液平衡液BL12000g离心离心1minCP3柱柱600ulPW12000g离心离心1min重复重复1次次PWCP3柱开盖2-5min50ulEB静置静置2min12000g离心离心2minpcDNA3.1/myc-His质粒的提取（预先过夜摇好菌液）1、吸取、吸取1.5ml过过夜培养的夜培养的细细菌于菌于Ep管中，管中，10,000rpm离心离心1分分钟钟，小心吸弃上清，小心吸弃上清 重复重复两次操作，共次操作，共获获得得4.5ml过过夜培养的夜培养的细细菌。菌。2、加入、加入250ul溶液溶液P1（含（含RNase A）于）于Ep管中，移液管中，移液枪枪吹打吹打悬悬浮浮细细菌。菌。3、加入、加入250ul溶液溶液P2，温和地上下翻，温和地上下翻转转混合混合6次次（2-5分分钟钟）。）。4、加入、加入350ul溶液溶液P3，轻轻轻轻混合混合6次，室温静置次，室温静置2分分钟钟。5、12,000rpm离心离心10分分钟钟，小心吸取上清加入吸附，小心吸取上清加入吸附柱中。柱中。(可可选选步步骤骤：吸附柱：吸附柱实验实验前加前加500ulBL平衡液，平衡液，12,000rpm离心离心1分分钟钟后倒弃收集管内液体后倒弃收集管内液体)pcDNA3.1/myc-His质粒的提取（预先过夜摇好菌液）6、12,000rpm离心离心1分分钟钟，弃流出液。，弃流出液。7、加入、加入600ul溶液溶液PW，12,000rpm离心离心1分分钟钟，弃，弃流出液。流出液。(重复重复1次次)8、12,000rpm离心离心2分分钟钟，彻彻底去除残留的底去除残留的PW。9、将吸附柱置于一干、将吸附柱置于一干净净的的1.5ml Ep管中，在柱的管中，在柱的中央加入中央加入30-50ulEB（pH7.0），室温静置），室温静置1分分钟钟。（。（EB在在60-70 水浴水浴预热预热，使用效果更好，使用效果更好10、10,000rpm离心离心1分分钟钟，洗脱，洗脱质质粒粒DNA待用。待用。The concentration and purity of PlasmidPlasmid/dsDNA:1 OD260=50ug/ml 100%DNA:OD260/OD280=1.8 100%RNA:OD260/OD280=2.0 Question:OD260/OD280 1.8?DL5Kb Marker A B CA:cleavage plasmid5000bp3000bp2000bp1500bp1000bp750bpPlasmid conformation variation leads to different migrationB:linear plasmidC:superhelix plasmid反应物 体积（l)bufferMC 2质粒DNA 15.8(l)BamH I 1EcoR I 1BSA 0.2在一个洁净的0.2 ml离心管中混匀下列反应物：混合后37 水浴1h质粒DNA的酶切分析操作三三、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳胶浓度（）胶浓度（）线性线性DNA分子大小分子大小（kb）0.35600.61200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.13本次电泳使用本次电泳使用1.0%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶浓度与琼脂糖凝胶浓度与DNA分子的有效分离范围分子的有效分离范围Marker A B C D6000bp5000bp2000bp1000bp750bp Agarose gel electrophoresis identificationBamH IEcoR IpcDNA3.1/myc-His A 5.5kbInsert fragment:1270bp琼脂糖凝胶电泳上样1：DNA Marker（10 l）2：提取的质粒DNA（10 l）3：质粒DNA酶切产物（20l）+-1234每组上2个样品Loading Buffer上样缓冲液EDTA甘油 增大溶液密度 溴酚蓝指示剂二甲苯胺蓝指示剂组成0.5TBE,0.5-1.4%浓度的胶中，迁移率 溴酚蓝=300bp 二甲苯胺蓝=4kbp 结果分析结果分析M123456M：1kbDNA Mark 1:酶切前质粒DNA 2-6：酶切后产物NCBI PUBMED