念珠菌病及实验室诊断.ppt

念珠菌病及实验室诊断念珠菌病及实验室诊断山东省立医院临床微生物学检验科山东省立医院临床微生物学检验科王盛华王盛华概述概述n念珠菌属（Candida）属于子囊菌亚门子囊菌纲酵母菌目酵母菌科念珠菌属n共同特征为细胞呈球形、椭圆形、圆桶形、长条形，有时为不规则形n芽殖，除光滑念珠菌外，所有菌种及变种的全部或多数可形成假菌丝，少数可形成厚膜孢子及真菌丝n无关节孢子、子囊孢子、冬孢子或掷孢子概述概述nLodder于1970年把念珠菌分成81种及7个变种，此后又陆续发现许多新种，目前至少已达270余种 n临床上常见的致病念珠菌有10余种，其中以白念珠菌最为多见，致病力也最强，但其他念珠菌引起深部感染的比例在上升n该属能引起从皮肤黏膜甲板到系统内脏血液的广谱病变，是迄今最重要的人类病原真菌 念珠菌病广谱病变念珠菌病广谱病变n最多见的深部真菌感染 n从皮肤粘膜到内脏血液的广谱病变 n口腔念珠菌病常是HIV感染的首发症状 念珠菌病来龙去脉念珠菌病来龙去脉内源性感染：内源性感染：n消化道3050 n阴道20 n咽部14 n皮肤2 外源性感染：外源性感染：n寄生于水果、奶制品等 n性伴传染，母婴传染 n院内爆发性传染念珠菌感染的流行病学念珠菌感染的流行病学n易感因素：易感因素：n医源性：广谱抗生素、皮质类固醇激素、免疫抑制剂的普遍应用，放疗、化疗、透析技术的广泛开展，器官移植、导管插管、高营养支持、大型手术等新方法推广普及 n恶性病：恶性肿瘤、恶性血液病、艾滋病、烧伤、吸毒、糖尿病等 n老龄化：人口老龄化的速度在加快 念珠菌感染的流行病学念珠菌感染的流行病学 n病原菌和分离率：病原菌和分离率：n过去20年间大量文献报道引起医院真菌感染的主要致病菌为念珠菌属、曲霉属、毛霉属和酵母属 n在美国，由念珠菌引起的院内血行感染的发病率1980-1992上升了500%n美国CDC发现医院里最具威胁性的病菌是念珠菌，占医院真菌感染的80%；国内报告为74.5%，亦有报道为96.09%n在念珠菌中，白念所占的比重逐渐下降，近平滑、热带、光滑和克柔的感染率在较快上升 念珠菌病的临床表现念珠菌病的临床表现n浅部念珠菌病浅部念珠菌病 n皮肤念珠菌病 n粘膜念珠菌病 n甲念珠菌病 n慢性皮肤粘膜念珠菌病 n特殊宿主浅部念珠菌病n深部念珠菌病深部念珠菌病 n内脏念珠菌病 n中枢念珠菌病 n播散性念珠菌病皮肤念珠菌病皮肤念珠菌病皮肤念珠菌病皮肤念珠菌病粘膜念珠菌病粘膜念珠菌病甲念珠菌病甲念珠菌病慢性皮肤粘膜念珠菌病慢性皮肤粘膜念珠菌病特殊宿主的浅部念珠菌病特殊宿主的浅部念珠菌病n80%以上HIV阳性的患者在整个疾病过程中的某个阶段会出现口腔念珠菌病，念珠菌感染是机会真菌病中最常见的一种 n在AIDS中显得优为突出，除了合并皮肤、口腔浅部念珠菌感染外，还可引起食道念珠菌病 n可出现体重减少，倦怠感，非特异的消化系统症状主要有咽下困难，胸骨后疼痛 n诊断可进行白念珠菌分离。AIDS早期诊断依据中，本症占很重要的位置 特殊宿主的浅部念珠菌病特殊宿主的浅部念珠菌病n据国际研究和临床经验，在艾滋病发病前14年内，大多数艾滋病患者都会单独出现口腔症状 n与HIV感染密切相关的口腔病变有以下几种：n发生于上腭及舌背，在红色区域上有时可见白色斑点或斑块 n或者发生在口腔的任何部位，表现为白色或黄色斑点或斑块，斑块可以擦去，留下红色区域并伴有出血 n有人认为口腔念珠菌感染和毛状白斑可作为艾滋病的预测性指标内脏念珠菌病内脏念珠菌病n念珠菌性肠炎 n念珠菌性支气管炎 n念珠菌性肺炎 n念珠菌性泌尿道炎 n其他 n食道炎、心内膜炎、脑膜炎、败血症等 n亦可侵犯肝、脾等其它内脏 中枢念珠菌病中枢念珠菌病念珠菌脑膜炎念珠菌脑膜炎n儿童比较多见，常继消化道或呼吸道感染经血循环或通过静脉插管引起 n临床有脑膜刺激症，但视乳头水肿及颅压增高现象不明显，脑脊液细胞计数不高，糖稍低或正常，但蛋白升高 n除白念珠菌外，热带、克柔和近平滑念珠菌也可引起播散性念珠菌病播散性念珠菌病n念珠菌血症 n急性播散性念珠菌病 n慢性播散性念珠菌病 念珠菌败血症念珠菌败血症n在重症患者中，肠道念珠菌可进入血循环引起血行播散，最常引起肺或肾念珠菌病。患者可有畏寒发热，血培养阳性，特别在感染后2448小时，但数日后转为阴性；如持续阳性，预后不佳 n患者可并发内眼炎，两眼疼痛，视力模糊，眼底显示棉球状改变。致病菌多为白念珠菌，少数（25）为热带念珠菌 n临床上有时表现多系统病变，但血培养阴性（阳性期已过），尿阳性，可借以诊断为播散性念珠菌病 念珠菌菌血症和其他念珠菌菌血症和其他n由于长时间静脉补液，尤其是超过20天者易引起念珠菌菌血症，血培养可以阳性，但24小时后转阴，症状较轻，可自愈，亦可恶化，视机体抵抗力而定 n其他：如局灶性肝念珠菌病、骨和关节念珠菌病、念珠菌甲状腺炎、腹膜炎、前列腺炎等都有报告 播散性念珠菌病的皮肤表现播散性念珠菌病的皮肤表现播散性念珠菌病内眼炎播散性念珠菌病内眼炎念珠菌病的实验室诊断念珠菌病的实验室诊断n直接镜检n培养鉴定n免疫学技术n分子生物学技术直接镜检直接镜检培养鉴定培养鉴定n培养基：沙氏培养基n温度：25-30n24-48小时n显色培养基：CHROMagar培养鉴定培养鉴定1.白念珠菌白念珠菌n菌落菌落nSDA 25中等速度生长n酵母样菌落n奶油样、光滑、闪光，老后有皱褶n显微镜显微镜n真菌丝和假菌丝n芽生孢子n假菌丝连接处：簇状、葡萄状小分生孢子n顶端或侧枝：厚壁孢子n显色培养基：显色培养基：蓝绿色、翠绿色培养鉴定培养鉴定2.热带念珠菌热带念珠菌n菌落菌落nSDA 25中等速度生长n光滑、乳白色奶油样菌落n陈旧菌落有皱褶n显微镜显微镜n假菌丝n孢子稍长n假菌丝连接处：小分生孢子n显色培养基：显色培养基：蓝灰色、暗蓝色培养鉴定培养鉴定3.近平滑念珠菌近平滑念珠菌n菌落菌落nSDA 25中等速度生长n光滑、柔软n陈旧菌落奶油样、白色、闪光、有时黄色、平滑或有皱褶n显微镜显微镜n假菌丝n孢子卵圆形或长倒卵形n假菌丝连接处：小分生孢子n显色培养基：显色培养基：淡粉色、白色培养鉴定培养鉴定4.克柔念珠菌克柔念珠菌n菌落菌落nSDA 25中等速度生长n扁平、柔软、光滑n陈旧菌落污黄色，可有皱褶n显微镜显微镜n假菌丝n孢子卵圆形，有的较长n假菌丝连接处：小分生孢子n显色培养基：显色培养基：淡粉色、紫色培养鉴定培养鉴定5.光滑念珠菌光滑念珠菌n菌落菌落nSDA 25中等速度生长n光滑、柔软、闪光、奶油样菌落n显微镜显微镜nCMA 25 无假菌丝n孢子卵圆形n显色培养基：显色培养基：白色、粉紫色快速鉴定工具快速鉴定工具免疫学技术免疫学技术n念珠菌抗体的检测对诊断深部念珠菌病有一定作用 n所有怀疑念珠菌深部感染的病例均应做血清学检查，但对结果要有合理解释 n单独一次沉淀试验阳性结果并不能建立诊断，因为用表面抗原和菌体抗原不能区分是深部感染产生的抗体还是黏膜寄生或感染产生的抗体；n一次沉淀试验阴性结果并不能除外免疫低下患者念珠菌感染的诊断，因为这种患者常不能产生可检出的免疫学应答 n因此，血清学检测在定期、间隔、连续进行时最有价值免疫学技术免疫学技术-(1-3)-D-葡聚糖检测（葡聚糖检测（G试验试验）n真菌细胞壁成分，占50%以上；具真菌特异性 n只能用于检测有无真菌成分而不能确定是哪种真菌 n除隐球菌和某些接合菌外大多数真菌共有成分，主要用于念珠菌和曲霉感染的诊断 n敏感性及特异性在78100%之间，阳性预测值较低，阴性预测值高 n与GM试验联合应用可提高阳性率 n连续2次阳性才能作为诊断依据，具体的判定界值尚不统一（50pg/ml？)n尚需要进一步的多中心前瞻性研究免疫学技术免疫学技术-(1-3)-D-葡聚糖检测（葡聚糖检测（G试验试验）G试验的假阳性问题试验的假阳性问题n以下情况可出现假阳性：n使用纤维素膜进行血透，标本或患者暴露于纱布或其他含有葡聚糖的材料 n静脉输注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品 n链球菌血症 n操作者处理标本时存在污染 n另外，使用多糖类抗癌药物、放化疗造成的粘膜损伤导致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌经胃肠道进入血液等也可能造成假阳性 免疫学技术免疫学技术半乳甘露聚糖半乳甘露聚糖(GM)检测检测nGM试验检测的是半乳甘露聚糖，主要适于侵袭性曲霉菌感染的早期诊断，也可用于念珠菌等感染的辅助诊断 nGM释放量与菌量成正比，可以反映感染程度。连续检测GM可作为治疗疗效的监测 n在造血干细胞移植患者中的诊断敏感性高 n以下情况可出现假阳性：以下情况可出现假阳性：使用使用半合成青霉素尤其是哌拉西林/他唑巴坦；新生儿和儿童；血液透析；自身免疫性肝炎等；食用可能含有GM的牛奶等高蛋白食物和污染的大米等 n以下情况可出现假阴性：以下情况可出现假阴性：释放入血循环中的曲霉GM（包括甘露聚糖）并不持续存在而是会很快清除；以前使用了抗真菌药物；病情不严重；非粒细胞缺乏的患者n连续2次0.5或单次0.7判为阳性 分子生物学技术分子生物学技术 分子生物学技术分子生物学技术分子生物学技术分子生物学技术DNA序列数据处理序列数据处理n序列片段联接和正反链校正 n常用软件 nLasergene(DNAStar)(http:/ n多序列比对(align)n常用软件 Clustal W或Clustal X(免费软件)(http:/www-igbmc.u-strasbg.fr/BioInfo/ClustalX/Top.html)参考：参考：n王端礼.医学真菌学实验室检验指南M（北京大学第一医院皮肤科）n刘维达.念珠菌感染及其诊断.ppt（中国医学科学院皮肤病研究所）n白逢彦.深部念珠菌病实验诊断.ppt（中国科学院微生物研究所，真菌学国家重点实验室）