合肥市原发性肉碱缺乏症新生儿筛查及基因变异分析.pdf

680 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 10 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.10 Oct.2023合肥市原发性肉碱缺乏症新生儿筛查及基因变异分析胡海利1,2 李卫东1 王 燕1 宋旺生1 马庆庆11.合肥市妇女儿童保健中心（安徽合肥 230092）；2.安徽省妇幼保健院（安徽合肥 230001）摘要：目的 分析合肥市新生儿原发性肉碱缺乏症（PCD）的筛查情况及基因变异特征。方法 应用串联质谱技术对2016年1月至2021年12月合肥市新生儿疾病筛查中心筛查的631 839份新生儿筛查样本进行检测，初筛阳性者召回新生儿及其母亲进行复筛，复筛结果仍低于临界参考值者，进行高通量二代基因测序。结果 共确诊PCD新生儿32例（总体发病率为1/19745）。在32例新生儿中，31例进行高通量测序联合Sanger验证，1例未检出基因变异，30例检出基因变异（男18例、女12例），其中复合杂合变异25例，纯合变异5例，基因确诊率为96.8%。在基因检测阳性30例患儿SLC22A5基因的60个变异中，变异比例最高的为c.1400CG，占48.3%（29/60），其次为c.51CG，占15.0%（9/60）。结论 合肥市新生儿PCD总体发病率与国内其他地区差异不明显。c.1400CG和c.51CG是合肥市新生儿PCD基因变异的常见位点。关键词：原发性肉碱缺乏症；基因变异；新生儿筛查Neonatal screening and gene variation analysis of primary carnitine deficiency in Hefei City HU Haili1,2,LI Weidong1,WANG Yan1,SONG Wangsheng1,MA Qingqing1(1.The Health Center of Women and Children in Hefei,Hefei 230092,Anhui,China;2.Anhui Maternal and Child Health Hospital,Hefei 230001,Anhui,China)Abstract:Objective To analyze the screening status and genetic variation characteristics of primary carnitine deficiency(PCD)in neonates in Hefei.Methods A total of 631839 newborn screening samples screened by Hefei Neonatal Disease Screening Center from January 2016 to December 2021 were detected by tandem mass spectrometry.Newborns and their mothers with positive initial screening were recalled for re-screening.If the re-screening results were still lower than the critical reference value,high-throughput second-generation gene sequencing was performed.Results A total of 32 neonates were diagnosed with PCD(overall incidence:1/19745).Among 32 neonates,31 underwent high-throughput sequencing combined with Sanger validation,1 had no genetic variation and 30 had genetic variation(18 boys and 12 girls).There were 25 cases of complex heterozygous variation and 5 cases of homozygous variation,and the gene diagnosis rate was 96.8%.Among the 60 variants of SLC22A5 gene in 30 positive children,c.1400CG had the highest variation ratio,accounting for 48.3%(29/60),followed by c.51CG,accounting for 15.0%(9/60).Conclusions The overall incidence of neonatal PCD in Hefei was not significantly different from that in other areas of China.c.1400CG and c.51CG were the common sites of PCD gene variation in newborns in Hefei City.Key words:primary carnitine deficiency;genetic variation;newborn screeningdoi:10.12372/jcp.2023.22e1344 论 著 基金项目：合肥市卫健委2016年应用医学研究项目（No.hwk2016yb016）通信作者：李卫东 电子信箱：原发性肉碱缺乏症（primary carnitine deficiency，PCD）是脂肪酸代谢障碍类疾病之一，是由于肉碱转运蛋白SLC22A5基因变异引起的一种脂肪酸氧化代谢病，由于转运蛋白活性降低，导致由肠道摄入的肉碱不足，体内游离肉碱（free carnitine，C0）降低，脂肪酸氧化代谢障碍，引起能量代谢障碍和低血糖，又称为肉碱摄取障碍或肉碱转运障碍1。在目前可查及的文献中，该病的检出率国内外差异较大，法罗群岛的检出率最高，达1/4002，澳大利亚检出率最低（1/120000）3。国内的检出率为1/34517 681 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 10 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.10 Oct.20231/111894-5。随着串联质谱技术在新生儿遗传代谢病筛查（以下简称“新筛”）中的广泛应用，越来越多的PCD新生儿患者获得早期筛查和确诊。该病早期诊断的重要意义在于早防早治、避免功能损害和猝死，特别是学龄期患儿在学校体育课要尽量避免长跑或其他高强度运动，从而避免意外发生。确诊患儿还可以通过早期服用左卡尼汀避免该病对身体器官功能的长期损害。现对合肥市新生儿疾病筛查中心近6年串联质谱检测结果进行分析，探讨本地区PCD检出情况，分析本地区PCD检出率与其他地区的差异、确诊患儿基因变异类型及常见位点。1 对象与方法1.1 研究对象 2016年1月至2021年12月在合肥市各级助产机构分娩的新生儿共631 839例。本研究已获得医院医学伦理委员会批准（批号：2016-003），患儿家长均知情同意并签署知情同意书。1.2 方法 1.2.1 新生儿筛查方法 按照 新生儿疾病筛查技术规范2010年版 的要求，由分娩机构产科护理人员采集新生儿足底血，制成干血滤纸片，由新筛物流系统统一递送至合肥市新筛中心。采用美国Waters公司生产的Waters TQD串联质谱仪进行高效液相串联质谱检测，实验试剂采用由芬兰PE公司生产的非衍生化多种氨基酸、肉碱和琥珀酰丙酮测定试剂盒。C0参考值范围1055mol/L，如初筛血值10mol/L者，召回新生儿及其母亲进行串联质谱检查，结果仍然偏低者进行基因检测。1.2.2 基因变异检测方法 抽取患儿及父母静脉全血3mL，乙二胺四乙酸二钾抗凝处理后，快递至北京迈基诺医学检验所，采用北京天根DP318-03分离试剂盒提取DNA，20保存备用。靶向外显子捕获后，进行二代测序（NGS），测序范围包括10个外显子和外显子上下游200个碱基对的内含子，对患儿及其父母SLC22A5基因可疑变异位点进行一代测序验证，可疑大片段缺失重复进行多重连接探针扩增技术验证。所有变异位点的筛选分析依据美国医学遗传学与基因组学学会（ACMG）2015指南。1.2.3 干预与随访 对确诊的PCD患儿，按照 原发性肉碱缺乏症筛查与诊治共识6及时给予左卡尼汀100300 mg/(kgd)，婴儿期C0浓度监测1 3个月1次，儿童期每年23次，根据血浆C0浓度适当调整药量。每年监测1次肝肾功能、血糖、血红蛋白、肌酸激酶等，每半年进行1次体格发育评价。做好家长宣教工作，避免患儿停药、饥饿、剧烈运动等应激状态。1.3 统计学分析 采用SPSS23.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布的以均数标准差表示，两组间比较采用两独立样本t检验；非正态分布的以中位数（M）（P25P75）表示，组间比较采用秩和检验。计数资料以例数（百分比）表示。以PG，占48.3%（29/60），其次为c.51CG，占15.0%（9/60）。有24例患儿至少携带1个c.1400CG，携带率为80.0%（24/30）。有8例患儿检出c.51CG/c.1400CG基因型（26.7%，8/30），5例检出c.1400CG/c.1400CG基因型（16.7%，5/30）。见表2。表1 20162021年合肥市新生儿串联质谱筛查及PCD检出情况年度活产数筛查数筛查率/%PCD确诊数PCD检出总数发病率临床+基因确诊临床确诊2016年94 31178 96383.7221/394822017年136 528130 94095.9881/163682018年120 156115 88196.45271/165542019年118 594116 65798.4551/233112020年103 799102 15998.4441/255402021年87 78487 23999.4661/14540合 计661 172631 83995.6302321/19745表2 PCD确诊患儿C0筛查血值、等位基因变异来源及分布编号性别初筛血值/molL-1复筛血值/molL-1父源母源位置核苷酸变化位置核苷酸变化1女8.757.60exon8c.1400CGexon8c.1400CG2男6.014.01exon8c.1400CGexon1c.51CG3女5.344.15exon1c.51CGexon8c.1400CG4男6.296.33exon8c.1400CGexon8c.1400CG5男4.263.39exon5c.845GAexon6c.976_977insAGCAGT6女7.853.39exon1c.51CGexon8c.1400CG7女7.165.29exon8c.1400CGexon2c.428CT8女2.202.20exon8c.1400CGexon1c.51CG9男6.206.09exon8c.1400CGexon2c.428CT10女5.253.08exon2c.428CTexon4c.760CT11男5.285.89exon4c.797CTexon8c.1400CG12男5.862.87exon8c.1400CGexon3c.505CT13女8.645.35exon8c.1400CGexon1c.338GA14男8.405.23exon7c.1252CTexon8c.1400CG15男2.902.14exon1c.51CGexon4c.760CT16男6.229.30exon8c.1400CGexon1c.51CG17女6.565.74exon4c.760CTexon8c.1400CG18男4.877.75exon8c.1400CGexon1c.51CG 19男5.233.87exon8c.1400CGexon5c.865CT 20男8.055.26exon8c.1400CGexon8c.1400CG21男3.062.99exon7c.1196GAexon5c.865CT22男5.736.46exon7c.1093ACexon4c.679CA23女6.327.47exon5c.865CTexon8c.1400CG24女5.194.78exon8c.1400CGexon7c.1093AC25男5.494.49exon8c.1400CGexon4c.760CT26男5.274.88exon1c.51CGexon8c.1400CG27女5.534.06exon8c.1400CGexon8c.1400CG28男8.165.92exon8c.1400CGexon8c.1400CG29女3.534.23exon8c.1400CG exon1c.51CG30男8.656.10exon7c.1195CTexon4c.797CT 683 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 10 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.10 Oct.2023基因确诊的30例患儿中男18例、女12例。复筛血值低于初筛血值24例，复筛血值高于初筛血值6例。在6例复筛血值增高的患儿中有5例携带c.1400CG变异。见表2。2.4 C0血值与c.1400CG变异关系 根据是否携带c.1400CG变异，将患儿分为携带组和不携带组，其中携带组24例。携带组的初筛C0值、确诊C0值均高于不携带组，差异有统计学意义（P0.05）。见表3。的调查结果（1/17785）8，与南京2013年至2018年新生儿筛查检出率（1/19607）相近9。从目前可查及的文献来看，由于PCD为罕见病，且国内各地区的检出率均在1/20000上下波动，显示PCD的检出率在中国地区间的差异不明显。本研究PCD患儿的基因诊断率为96.8%，高于相关研究对95例成纤维细胞肉碱转运体低下患者的调查结果（70.5%）10以及 40例初筛阳性PCD患儿的基因诊断率（35.0%）11。本研究的基因诊断率明显高于其他相关调查结果，可能与基因检测方法不同有关，也可能与合肥市PCD患儿的基因变异种类及分布有关。本研究有1例临床确诊患儿做了基因检测，但未查及变异，可能是由于目前高通量测序方法主要对外显子区域及其侧翼序列上下游50bp深度的内含子进行测序，理论上可能会遗漏深度内含子区域及启动子区域变异，也可能是SLC22A5基因甲基化修饰的原因。这需要在今后的工作中进一步加强基因诊断方法的研究，以提高检测技术水平以及基因诊断率。本研究发现 SLC 22 A 5 c.1400 CG 基因变异是本地 PCD 患儿的热点变异，占 48.3%。其次为 c.51 CG 基因变异（15.0%）。相关研究表明，c.51CG和c.1400CG变异分别占泉州地区SLC22A5基因变异的第2位和第3位4，与本研究相近。有研究对2 093例正常新生儿进行SLC22A5基因测序发现，柳州地区的热点变异为c.51CG（56.5%）12。另有研究对12例PCD患儿进行基因分析发现，c.760CT和c.1400CG变异占比最高，分别为37.5%和29.2%13。本研究发现，携带 SLC22A5 c.1400CG基因变异的患儿，初筛和确诊C0血值均显著高于不携带此变异的患儿，而且该基因变异相对于SLC22A5其他类型的基因变异对血值下降的影响较小。这与相关研究发现SLC22A5 c.1400 CG 变异会减少肉碱转运，使血值下降，但其能保留较高活性的残余肉碱转运活性的结论 相符14。综上，串联质谱筛查技术能够有效筛查出C0偏低的新生儿，通过对SLC22A5基因的二代测序技术对其进行检测，从分子层面对其进行确诊，从而验证表3 是否携带c.1400CG变异在初筛和确诊时C0值比较(molL-1)分组例数初筛C0值确诊C0值初筛C0值确诊C0值携带组246.301.53 5.331.651.08(-0.302.18)不携带组64.141.16 3.471.520.81(0.101.85)统计量t=3.21t=2.49Z=0.39 P0.0030.0190.6953 讨论合肥市新生儿串联质谱筛查起步于2015年7月，2016年开始在全市范围内针对常住人口实行部分免费新生儿串联质谱筛查，2018年实行全免费，近几年串联质谱筛查率不断提高。针对PCD的筛查指标合肥市主要应用C0，从确诊的32例PCD患儿来看，所有患儿的C0均低于切值（10 mol/L），提示串联质谱技术对于PCD的筛查灵敏度较高，但目前的筛查评估方法可能导致首次筛查血值略高于切值的患儿漏筛，尤其是初筛血值在1015 mol/L同时伴有其他种类酰基肉碱的降低，在今后的工作中应予关注。从统计结果来看，不同年度PCD的筛查检出率差异较大，这可能与PCD是罕见病，某一年度由于筛查量的制约不能很好地反映PCD的真实疾病检出情况有关。从6年60多万例筛查总量看，合肥市PCD总体检出率为1/19745，高于河南省2013年至2017年72万多例新生儿的检出结果（1/34317）5，低于泉州54万多例新生儿的检出结果（1/11189）4、广州市2015年至2019年20万多例新生儿筛查检出结果（1/13345）7以及石家庄地区16万多例新生儿 684 临床儿科杂志 2023 年 第 41 卷第 10 期 J Clin Pediatr Vol.41 No.10 Oct.2023临床诊断。这为PCD患儿的早期治疗干预、再生育遗传咨询、产前诊断等都提供了重要的参考信息。参考文献：1 Chen Y,Lin Q,Zeng Y,et al.Gene spectrum and clinical traits of 10 patients with primary carnitine deficiency J.Mol Genet Genomic Med,2021,9(2):e1583.2 Rasmussen J,Nielsen OW,Janzen N,et al.Carnitine levels in 26,462 individuals from the nationwide screening program for primary carnitine deficiency in the Faroe Islands J.J Inherit Metab Dis,2014,37(2):215-222.3 Wilcken B,Wiley V,Hammond J,et al.Screening 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