医学ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术ATPTCA的建立.pptx

答辩提纲答辩提纲l第一部分：第一部分：ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术概述生物荧光肿瘤体外药敏检测技术概述l第二部分：第二部分：ATP生物荧光肿瘤体外药敏检测技术及质量生物荧光肿瘤体外药敏检测技术及质量 l 标准的建立标准的建立l第三部分：第三部分：ATP-TCA技术的临床应用研究技术的临床应用研究第一部分ATPATP生物荧光肿瘤体外药敏检测生物荧光肿瘤体外药敏检测技术概述技术概述研究背景研究背景l 化化学学治治疗疗是是肿肿瘤瘤的的三三大大治治疗疗手手段段之之一一。近近3030年年来来，虽虽然然某某些些恶恶性性肿肿瘤瘤的的化化学学治治疗疗有有明明显显改改善善，但但多多数数肿肿瘤瘤，特特别别是是实实体体瘤瘤疗疗效效仍仍不不理理想想。这这与与肿肿瘤瘤存存在在个个体体差差异异性性，以以及多重耐药性等因素有关。及多重耐药性等因素有关。l 因因此此如如何何选选择择有有效效药药物物，进进行行有有的的放放矢矢的的治治疗疗早早已已成成为化疗界所关注的问题。为化疗界所关注的问题。1.主要的药敏检测方法及其主要的药敏检测方法及其存在的问题存在的问题药敏检测方法药敏检测方法存在问题存在问题 集落形成法集落形成法（HTCA）标本可评价率低，仅有4070。实验周期长，需要2周以上测试药物种类和数量有限操作繁琐，难以标准化阳性预测值较低，仅有4060四唑蓝比色法四唑蓝比色法(MTT)敏感性较差，最低仅能检测500个细胞量程较小，有效量程在2.0以内细胞毒性差异染细胞毒性差异染色法色法(DiSC)可适用标本类型不广，目前仅用于血液肿瘤人为判断因素较大，难以推广标本可评价率不高，仅有7080阳性预测值较低，仅有7080胸腺嘧啶核苷胸腺嘧啶核苷掺入法掺入法(3H-TdR)实验人员接触放射，不利于健康标本可评价率不高，仅有7080测试结果仅能反映少量处于增殖相的肿瘤细胞对某些药物的测试结果存在假阴性理想的药敏检测方法应该理想的药敏检测方法应该具备的条件具备的条件1.操作简便，可以标准化，便于推广操作简便，可以标准化，便于推广2.标本可评价率高标本可评价率高3.检测敏感、可靠、客观检测敏感、可靠、客观4.具备产业化条件具备产业化条件2.ATP生物荧光药敏检测技术的优点生物荧光药敏检测技术的优点:敏感性好敏感性好可检测最少可检测最少1010个细胞。而其他技术则一般需要个细胞。而其他技术则一般需要500500个细胞以上个细胞以上可评价率高可评价率高标本可评价率在标本可评价率在90%90%以上以上快速检测快速检测完成完成ATPATP检测仅需检测仅需3030分钟，而其它方法需分钟，而其它方法需1 14 4小时的孵育时间小时的孵育时间量程宽量程宽 检测线性范围为检测线性范围为1010100000100000个细胞个细胞/孔（孔（9696孔培养板）孔培养板）精密度好精密度好变异系数（变异系数（CVCV）小于小于10%10%，在国家标准（，在国家标准（10%10%）的范围内）的范围内结果准确结果准确整体预测值为整体预测值为86%86%检测效率高检测效率高同时动态检测评估化疗药物同时动态检测评估化疗药物6 6个剂量下对肿瘤的杀伤作用个剂量下对肿瘤的杀伤作用高通量检测高通量检测适合适合9696、384384、15361536孔板检测分析孔板检测分析自动化程度高自动化程度高实验数据计算机软件自动分析，分析结果直观可靠实验数据计算机软件自动分析，分析结果直观可靠稳定性好稳定性好 具备产业化条件具备产业化条件 3.ATP-TCA技术原理：技术原理：在在有有氧氧条条件件下下,荧荧光光酶酶（luciferaseluciferase）可可以以催催化化荧荧光光素素（luciferinluciferin）释释放放出出荧荧光光（波波长长为为562562nmnm），同同时时ATPATP转转变变成成AMPAMP。所所释释放放的的荧荧光光强强度度与与胞胞内内ATPATP含含量量呈呈正正相相关关。细细胞胞死死亡亡后后，胞胞内内ATPATP迅迅速速水水解解，而而活活细细胞胞的的ATPATP含含量量基基本本恒恒定定。因因此此所所测测得得的的荧荧光光强强度度反反映映了了活活细细胞胞的的数数量量。比比较较药药物物系系列列浓浓度度对对培培养养细细胞胞的的不不同同抑抑制制率率，参参照照相相应应判判断断指指标标，从从而而可可以以评评估估该该化化疗疗药药物物对对肿肿瘤瘤细细胞胞的的杀杀伤伤效果。效果。ATP+Luciferin+O2 AMP+2Pi+Photons+OxylaluciferinLuciferase荧光强度与活细胞数量的关系荧光强度与活细胞数量的关系4.技术技术流程流程TumorSingle Cell suspensionMechanical andenzymatical dissociationIncubationfor 5-7 daysAddition of drugs/mediumATP-LuminescenceATP extractionand stabilizationSoftware EvaluationConstruction of dose-response plots5.适用肿瘤类型适用肿瘤类型 6.适用肿瘤标本类型适用肿瘤标本类型 神经母细胞瘤神经母细胞瘤 黑色素瘤黑色素瘤 甲状腺癌甲状腺癌 结直肠癌结直肠癌 乳腺癌乳腺癌 卵巢癌卵巢癌 胰腺癌胰腺癌 肉瘤肉瘤 胃癌胃癌 肺癌肺癌实体瘤标本实体瘤标本胸腹水胸腹水活检淋巴结标本活检淋巴结标本7.国内外研究历史回顾国内外研究历史回顾1.1.1.1.1982198219821982年年年年，MoyerMoyerMoyerMoyer等等等等首首首首先先先先提提提提出出出出内内内内源源源源性性性性ATPATPATPATP的的的的含含含含量量量量可可可可以以以以反反反反映映映映细细细细胞胞胞胞活活活活性性性性;随随随随后后后后KangasKangasKangasKangas等等等等相相相相继继继继证证证证实实实实生生生生物物物物荧荧荧荧光光光光技技技技术术术术是是是是一一一一种种种种敏敏敏敏感感感感、可可可可靠靠靠靠的的的的确确确确定定定定各各各各种种种种细胞活性的检测方法。细胞活性的检测方法。细胞活性的检测方法。细胞活性的检测方法。2.2.2.2.自自自自1988198819881988年年年年，SevinSevinSevinSevin首首首首先先先先将将将将此此此此方方方方法法法法用用用用于于于于新新新新鲜鲜鲜鲜肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤组组组组织织织织的的的的药药药药敏敏敏敏检检检检测测测测，在在在在欧洲和美国已经进行了大量的临床应用研究。欧洲和美国已经进行了大量的临床应用研究。欧洲和美国已经进行了大量的临床应用研究。欧洲和美国已经进行了大量的临床应用研究。3.3.3.3.1998199819981998年年年年，KurbacherKurbacherKurbacherKurbacher等等等等人人人人报报报报道道道道了了了了ATP-TCAATP-TCAATP-TCAATP-TCA辅辅辅辅助助助助化化化化疗疗疗疗与与与与传传传传统统统统化化化化疗疗疗疗比比比比较较较较的的的的临临临临床床床床期期期期试试试试验验验验结结结结果果果果，试试试试验验验验结结结结果果果果表表表表明明明明，ATPATPATPATP-TCATCATCATCA指指指指导导导导的的的的化化化化疗疗疗疗治治治治疗疗疗疗复复复复发发发发性性性性卵卵卵卵巢巢巢巢癌癌癌癌较较较较传传传传统统统统化化化化疗疗疗疗模模模模式式式式更更更更能能能能提提提提高高高高临临临临床床床床疗疗疗疗效效效效，延延延延长长长长病病病病人人人人总总总总生生生生存存存存期和无进展生存期。期和无进展生存期。期和无进展生存期。期和无进展生存期。4.4.4.4.NIHNIHNIHNIH的的的的GOG GOG GOG GOG(Gynecologic(Gynecologic(Gynecologic(Gynecologic Oncology Oncology Oncology Oncology Group)Group)Group)Group)项项项项目目目目组组组组认认认认为为为为ATP-TCAATP-TCAATP-TCAATP-TCA是是是是最有发展前途的一种药敏试验方法，已纳入重点科研项目最有发展前途的一种药敏试验方法，已纳入重点科研项目最有发展前途的一种药敏试验方法，已纳入重点科研项目最有发展前途的一种药敏试验方法，已纳入重点科研项目(1998)(1998)(1998)(1998)。5.5.5.5.至今该技术的临床应用相关文献已有至今该技术的临床应用相关文献已有至今该技术的临床应用相关文献已有至今该技术的临床应用相关文献已有200200200200余篇。余篇。余篇。余篇。6.6.6.6.国内尚无该技术产业化的报道。国内尚无该技术产业化的报道。国内尚无该技术产业化的报道。国内尚无该技术产业化的报道。时间时间国家国家研究人研究人肿瘤类型肿瘤类型结论结论19881988年年美国美国Sevin BU,Sevin BU,Peng ZLPeng ZL卵巢癌卵巢癌阳性预测值：阳性预测值：92%92%，阴性预测值：，阴性预测值：90%90%整体预测精确值：整体预测精确值：86%86%19901990年年日本日本Jinushi K,Jinushi K,HirabayashiHirabayashi胃癌胃癌预测精确性为预测精确性为88.9%88.9%19931993年年瑞士瑞士Koechli OR,Koechli OR,Avner BPAvner BP乳腺癌乳腺癌阳性预测值：阳性预测值：90%90%，阴性预测值：，阴性预测值：86%86%整体预测精确值：整体预测精确值：85%85%19951995年年美、英、德美、英、德三国协作三国协作Andreotti PE Andreotti PE Cree IACree IA 顺铂耐受卵顺铂耐受卵巢癌巢癌整体预测精确值：整体预测精确值：92%92%19961996年年英国英国Cree IA,Cree IA,Kurbacher CMKurbacher CMIII/IVIII/IV期期乳腺癌乳腺癌整体预测精确值整体预测精确值：767619971997年年日本日本Kawamura H,Kawamura H,Ikeda KIkeda K胃肠道肿瘤胃肠道肿瘤阳性预测值：阳性预测值：64%64%，阴性预测值：，阴性预测值：100%100%整体预测精确值：整体预测精确值：84%84%20002000年年美国美国Konecny G,Konecny G,Crohns CCrohns CFIGO FIGO 期期卵巢癌卵巢癌阳性预测值阳性预测值：66%66%，阴性预测值阴性预测值：89%89%敏感性敏感性：95%95%，特异性特异性：44%44%20002000年年德国德国Mollgard L,Mollgard L,Tidefelt UTidefelt U急性非淋巴急性非淋巴细胞白血病细胞白血病阳性预测值阳性预测值：86%86%，阴性预测值阴性预测值：100%100%20012001年年美国美国OMeara AT,OMeara AT,Sevin BUSevin BU上皮性卵巢上皮性卵巢癌癌阳性预测值阳性预测值：83%83%，阴性预测值阴性预测值：56.5%56.5%ATP-TCA技术的临床相关性研究结果技术的临床相关性研究结果ATP-TCA与其它药敏检测方法的相关性与其它药敏检测方法的相关性ATP-TCAATP-TCA技术与技术与DiSCDiSC法的相关性法的相关性ATP-TCAATP-TCA技术与技术与MTTMTT法的相关性法的相关性8.目前先进国家对该技术的评价目前先进国家对该技术的评价1.1.1.1.1998199819981998年年年年德德德德国国国国DCSDCSDCSDCS公公公公司司司司将将将将该该该该技技技技术术术术产产产产业业业业化化化化，并并并并获获获获得得得得国国国国际际际际ISOISOISOISO质质质质量量量量评评评评估体系认证，估体系认证，估体系认证，估体系认证，在欧洲和北美市场获得准入在欧洲和北美市场获得准入在欧洲和北美市场获得准入在欧洲和北美市场获得准入。2.20012.20012.20012.2001年年年年，美美美美 国国国国 全全全全 国国国国 医医医医 疗疗疗疗 保保保保 险险险险 协协协协 会会会会(Health Health Health Health Maintenance Maintenance Maintenance Maintenance Organization)Organization)Organization)Organization)认认认认为为为为，该该该该技技技技术术术术是是是是一一一一项项项项精精精精确确确确和和和和可可可可靠靠靠靠的的的的并并并并能能能能指指指指导导导导医医医医生生生生选选选选择择择择用用用用药药药药的的的的先先先先进进进进技技技技术术术术，建建建建议议议议在在在在全全全全美美美美进进进进行行行行医医医医疗疗疗疗保保保保险险险险赔赔赔赔付付付付。目目目目前在加州等前在加州等前在加州等前在加州等6 6 6 6个州已获医疗保险赔付个州已获医疗保险赔付个州已获医疗保险赔付个州已获医疗保险赔付。3.3.3.3.2003200320032003年年年年日日日日本本本本厚厚厚厚生生生生省省省省和和和和保保保保险险险险联联联联合合合合会会会会也也也也认认认认为为为为，该该该该技技技技术术术术是是是是一一一一项项项项先先先先进进进进的的的的临临临临床床床床医医医医学学学学项项项项目目目目，该该该该技技技技术术术术指指指指导导导导的的的的肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤化化化化疗疗疗疗较较较较传传传传统统统统的的的的化化化化疗疗疗疗方方方方案案案案更更更更能能能能明明明明显显显显提提提提高高高高胃胃胃胃肠肠肠肠道道道道肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤的的的的治治治治愈愈愈愈率率率率，建建建建议议议议该该该该项项项项技技技技术术术术在在在在全全全全国国国国范范范范围围围围内获得医疗保险赔付。内获得医疗保险赔付。内获得医疗保险赔付。内获得医疗保险赔付。因此，ATP-TCA技术是目前最先进的体外药敏技术，该技术敏感，可靠，具有极大的临床应用价值第二部分 ATP-TCA药敏检测技术及药敏检测技术及质量标准的建立质量标准的建立lATP-TCA技术的核心试剂技术的核心试剂l1.荧光酶试剂荧光酶试剂l热稳定性和发光效率均好的重组酶试剂保证检测的敏感性和可热稳定性和发光效率均好的重组酶试剂保证检测的敏感性和可l靠性，满足临床实际工作的需要靠性，满足临床实际工作的需要l2.培养基培养基l肿瘤细胞选择性培养基支持肿瘤细胞生长增殖，促进正常细胞肿瘤细胞选择性培养基支持肿瘤细胞生长增殖，促进正常细胞死亡，从而保证药敏检测的肿瘤细胞特异性死亡，从而保证药敏检测的肿瘤细胞特异性下面我将就这两个核心试剂的研发汇报我所做的一些工作 荧光酶基因克隆、点突变、表达及纯化荧光酶基因克隆、点突变、表达及纯化(2001,4(2001,42001,10)2001,10)肿瘤细胞选择性培养基配方筛选及优化肿瘤细胞选择性培养基配方筛选及优化(2001,5(2001,52001,12)2001,12)检测技术核心试剂的质量标准的建立检测技术核心试剂的质量标准的建立(2002,1(2002,12002,3)2002,3)工作内容及进展工作内容及进展自荧火虫体内发光腺体提取荧光酶mRNA逆转录为cDNA,PCR扩增，克隆构建重组质粒PET22b-luc设计点突变引物，定点突变荧光酶第245和215位氨基酸序列将含点突变PET22b-luc导入原核高效表达系统Ecoli-BL21筛选高表达株，高效稳定表达重组荧光酶通过蛋白工作站，纯化生产重组荧光酶制备冻干荧光酶制剂重组荧光酶研发路线重组荧光酶研发路线荧光酶基因的克隆和鉴定荧光酶基因的克隆和鉴定PCRPCR产物电泳图产物电泳图重组质粒重组质粒PET22b-lucPET22b-luc鉴定图鉴定图野生型野生型荧光酶基因编码序列荧光酶基因编码序列(1653(1653bp)bp)M215：GCAGAlaLeuM245：CGHisGln atggaagacgccaaaaacataaagaaaggcccggcgccattctatcctctagaggatggaaccgctggagagcaactgcataaggctatgaagagatacgccctggttcctggaacaattgcttttacagatgcacatatcgaggtgaacatcacgtacgcggaatacttcgaaatgtccgttcggttggcagaagctatgaaacgatatgggctgaatacaaatcacagaatcgtcgtatgcagtgaaaactctcttcaattctttatgccggtgttgggcgcgttatttatcggagttgcagttgcgcccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacagtatgaacatttcgcagcctaccgtagtgtttgtttccaaaaaggggttgcaaaaaattttgaacgtgcaaaaaaaattaccaataatccagaaaattattatcatggattctaaaacggattaccagggatttcagtcgatgtacacgttcgtcacatctcatctacctcccggttttaatgaatacgattttgtaccagagtcctttgatcgtgacaaaacaattgcactgataatgaattcctctggatctactgggttacctaagggtgtggcccttccgcatagaactgc*ctgcgtcagattctcgcatgccagagatcctatttttggcaatcaaatcattccggatactgcgattttaagtgttgttccattccatcac*ggttttggaatgtttactacactcggatatttgatatgtggatttcgagtcgtcttaatgtatagatttgaagaagagctgtttttacgatcccttcaggattacaaaattcaaagtgcgttgctagtaccaaccctattttcattcttcgccaaaagcactctgattgacaaatacgatttatctaatttacacgaaattgcttctgggggcgcacctctttcgaaagaagtcggggaagcggttgcaaaacgcttccatcttccagggatacgacaaggatatgggctcactgagactacatcagctattctgattacacccgagggggatgataaaccgggcgcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaaacgctgggcgttaatcagagaggcgaattatgtgtcagaggacctatgattatgtccggttatgtaaacaatccggaagcgaccaacgccttgattgacaaggatggatggctacattctggagacatagcttactgggacgaagacgaacacttcttcatagttgaccgcttgaagtctttaattaaatacaaaggatatcaggtggcccccgctgaattggaatcgatattgttacaacaccccaacatcttcgacgcgggcgtggcaggtcttcccgacgatgacgccggtgaacttcccgccgccgttgttgttttggagcacggaaagacgatgacggaaaaagagatcgtggattacgtcgccagtcaagtaacaaccgcgaaaaagttgcgcggaggagttgtgtttgtggacgaagtaccgaaaggtcttaccggaaaactcgacgcaagaaaaatcagagagatcctcataaaggccaagaagggcggaaagtccaaattgtaa 荧光酶基因突变位点测序图荧光酶基因突变位点测序图G C,导致第245位氨基酸置换(HisGln)测序单位：上海生工GC AG,导致第215位氨基酸置换(AlaLeu)荧光酶表达荧光酶表达电泳图电泳图纯化后电泳图纯化后电泳图荧光酶蛋白质荧光酶蛋白质电泳图电泳图图图1：野生型和突变型荧光酶热稳定性比较：野生型和突变型荧光酶热稳定性比较野生型和突变型荧光酶活性比较野生型和突变型荧光酶活性比较图图2：野生型和突变型荧光酶发光效率及线：野生型和突变型荧光酶发光效率及线性关系比较性关系比较l重组重组荧光酶制剂稳定性研究荧光酶制剂稳定性研究放置放置温度温度活性半衰期活性半衰期液体保存液体保存冻干品冻干品-20-208080天天360360天天442020小时小时180180天天25253.83.8小时小时2121天天37370.80.8小时小时3 3天天因此，我们将热稳定性和发光效率均好的M245突变荧光酶冻干制剂作为药敏检测用酶制剂 *重组荧光酶为M245突变型荧光酶肿瘤细胞选择性培养基研究肿瘤细胞选择性培养基研究选择性培养基生长支持度及选择性研究选择性培养基生长支持度及选择性研究肿瘤细胞系生长曲线肿瘤细胞系生长曲线正常、良性卵巢及肿瘤组织培养生长曲线正常、良性卵巢及肿瘤组织培养生长曲线 新鲜瘤组织体外培养效果图新鲜瘤组织体外培养效果图Continued卵巢癌原代培养前后卵巢癌原代培养前后HE及免疫组及免疫组化染色化染色PAN-KERATIN染色正常卵巢上皮细胞及成纤维细胞正常卵巢上皮细胞及成纤维细胞培养结果培养结果正常上皮细胞培养抑制效果图正常上皮细胞培养抑制效果图成纤维细胞培养抑制效果图成纤维细胞培养抑制效果图培养前后细胞组成变化培养前细胞组成培养前细胞组成6天培养后细胞组成天培养后细胞组成淋巴上皮成纤维肿瘤淋巴上皮成纤维肿瘤细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞细胞40-50%10-25%5-10%10-20%1%10%75%选择性培养基的研究结果表明该培养基具有良好的选择性，适合肿瘤体外药敏检测的需要质量标准质量标准1、培养基对肿瘤细胞生长支持程度、培养基对肿瘤细胞生长支持程度以MCF-7细胞系作为标准细胞系，按2000个细胞/孔接种浓度接种至96孔培养板中，培养七天后，要求测定的RLU值400000。2、ATP标准曲线标准曲线将ATP标准品配成250ng/ml，倍比(3)稀释7次，做出ATP浓度与RLU（扣 除 本 底 吸 收 值）的 标 准 曲 线，要 求：r0.995，最 小 ATP浓 度（0.11ng/ml）的RLU400。3、精密度、精密度选MCF-7细胞系低、中、高（500、10000、40000个）数目的细胞，分别测定十组RLU值，要求：CV440RLU，同时本底值200RLU。第三部分第三部分ATP-TCAATP-TCA体外药敏检测技术的临体外药敏检测技术的临床应用研究床应用研究 ATP-TCA 药物测试方式药物测试方式评价标准评价标准强敏感(SS)：IC5025%及IC90100%PPC中度敏感(IS)：IC50100%PPC轻度敏感(MS)：IC5025%及IC9025%及IC90100%PPCIC90:抑制90%肿瘤细胞生长的血浆峰值浓度百分比IC50:抑制半数肿瘤细胞生长的血浆峰值浓度百分比PPC:一定临床用药剂量对应的血浆峰值浓度临床相关性研究病人资料临床相关性研究病人资料表表1：卵巢癌体外药敏检测与临床疗效的比较：卵巢癌体外药敏检测与临床疗效的比较临床相关性研究初步结果临床相关性研究初步结果例数体外检测体外检测敏感(SS+IS)耐药(WS+R)共计体内敏感（CR+PR）体内耐药（SD+PD）1822011112共计191332*34例卵巢癌中可评价标本为32例，标本可评价率为94.1%表表2：卵巢癌体外药敏检测真实性评价：卵巢癌体外药敏检测真实性评价阳性预测值阴性预测值灵敏度特异性90.6%94.7%84.6%90%91.7%整体预测值ATP-TCA药敏检测的临床应用药敏检测的临床应用1.设计个体化治疗方案设计个体化治疗方案2.研究新的联合化疗方案研究新的联合化疗方案3.化疗药物新适应症研究化疗药物新适应症研究一例经多重化疗复发的睾丸癌病人药敏检测结果一例经多重化疗复发的睾丸癌病人药敏检测结果一例经多重化疗复发的睾丸癌病人药敏检测结果一例经多重化疗复发的睾丸癌病人药敏检测结果1.1.设计个体化治疗方案设计个体化治疗方案检测结果分析检测结果分析药物名称药物名称IC50（PPC%）杀伤作用评估杀伤作用评估BLM+DDP+VCR12.69%部分敏感药物部分敏感药物BLM+DDP+5-FU18.59%轻度敏感药物轻度敏感药物BLM+CBP+VP1614.79%部分敏感药物部分敏感药物VP16+CBP28.16%轻度敏感药物轻度敏感药物THP+DDP+5-FU14.79%部分敏感药物部分敏感药物VP16+DDP+VCR6.32%较敏感药物较敏感药物IFO+VP16+ADM25.5%轻度敏感药物轻度敏感药物CTX+ADM+CBP32.4%耐药药物耐药药物NVB+EPI0.76%强敏感药物强敏感药物治疗效果治疗前治疗前 该患者经多重化疗方案复发，颈侧、右锁骨下、胸壁、纵隔淋巴结广泛转移，该患者经多重化疗方案复发，颈侧、右锁骨下、胸壁、纵隔淋巴结广泛转移，气管、食管压迫移位并伴有吞咽困难。胸水活检发现癌细胞，淋巴结病理活检气管、食管压迫移位并伴有吞咽困难。胸水活检发现癌细胞，淋巴结病理活检证实为绒毛膜上皮癌，证实为绒毛膜上皮癌，HCG激素水平为激素水平为600u/ml。治疗后治疗后（NVB+EPI方案一个半周期以后）方案一个半周期以后）胸水消失，颈侧、右锁骨下、胸壁、纵隔淋巴结病灶缓解或消失，可以进食，胸水消失，颈侧、右锁骨下、胸壁、纵隔淋巴结病灶缓解或消失，可以进食，HCG激素水平降至激素水平降至60u/ml。因此ATP-TCA技术对于开展肿瘤患者的个体化治疗极具指导意义2.卵巢癌新的联合用药方案研究卵巢癌新的联合用药方案研究肿瘤细胞对化疗药物的反应肿瘤细胞对化疗药物的反应强敏感强敏感SSSS中度敏感中度敏感MSMS轻度敏感轻度敏感LSLS耐药耐药 R R例例数数32614843261484体外有效率体外有效率(SS+MS)/n=(6+14)/32=62.5%SS+MS)/n=(6+14)/32=62.5%1.1.1.1.健择与顺铂的联合方案健择与顺铂的联合方案健择与顺铂的联合方案健择与顺铂的联合方案2.2.2.2.健择与表阿霉素的联合方案健择与表阿霉素的联合方案健择与表阿霉素的联合方案健择与表阿霉素的联合方案肿瘤细胞对化疗药物的反应肿瘤细胞对化疗药物的反应强敏感强敏感SSSS中度敏感中度敏感MSMS轻度敏感轻度敏感LSLS耐药耐药 R R例例数数102332102332体外有效率体外有效率(SS+MS)/n=(2+3)/10=50%SS+MS)/n=(2+3)/10=50%羟基喜树碱羟基喜树碱(Hydrocamptocin)Hydrocamptocin)原用途：消化道和泌尿系肿瘤原用途：消化道和泌尿系肿瘤例数例数强敏感强敏感SSSS中度敏感中度敏感MSMS轻度敏感轻度敏感LSLS耐药耐药 R R3245131032451310有效率有效率(SS+MS)/n=(4+5)/32=28.1%SS+MS)/n=(4+5)/32=28.1%肿瘤细胞对化疗药物的反应肿瘤细胞对化疗药物的反应 卵巢癌原代培养药敏测试结果卵巢癌原代培养药敏测试结果3.化疗药物新适应症研究化疗药物新适应症研究 长春瑞宾长春瑞宾(Vinorelbine,Navelbine)Vinorelbine,Navelbine)原用途：非小细胞肺癌、转移性乳腺癌原用途：非小细胞肺癌、转移性乳腺癌例数例数强敏感强敏感SSSS中度敏感中度敏感MSMS轻度敏感轻度敏感LSLS耐药耐药 R R肿瘤细胞对化疗药物的反应肿瘤细胞对化疗药物的反应体外有效率体外有效率(SS+MS)/n=(2+5)/32=21.9%SS+MS)/n=(2+5)/32=21.9%卵巢癌原代培养药敏测试结果：卵巢癌原代培养药敏测试结果：32259163225916因此ATP-TCA技术的建立为肿瘤新化疗方案的研究和临床应用建立了重要技术平台讨论讨论ATP-TCA检检测测技技术术是是一一种种先先进进的的药药敏敏检检测测技技术术，其其具具有有相相关关性性好好（r=0.9981）；量量程程宽宽，跨跨越越4个个数数量量级级（10-80000个个细细胞）；检测敏感程度高（最小检测胞）；检测敏感程度高（最小检测10个细胞）的优点。个细胞）的优点。34例例卵卵巢巢癌癌体体外外药药敏敏检检测测结结果果表表明明，ATP-TCA技技术术可可反反映映不不同同病病人人对对药药物物的的敏敏感感性性的的个个体体差差别别，标标本本可可评评价价率率高高，其其结结果果与与临临床床疗疗效效及及相相关关临临床床资资料料有有较较好好的的吻吻合合性性：整整体体预预测测值值90.6%，阳阳性性预预测测值值94.7%，阴阴性性预预测测值值84.6%，敏敏感感性性90%，特特异异性性91.7%。同同时时，该该技技术术对对抗抗肿肿瘤瘤药药物物筛筛选选和和应应用用、临临床床药药物物新新适适应应症症研研究究、化化疗疗方方案案筛筛选选和和评评估估以以及及推推广广个个体体化化治治疗疗具具有有实实际际指指导导意义。意义。本本研研究究为为该该技技术术的的初初步步临临床床应应用用研研究究，为为了了进进一一步步证证实实其其临临床应用价值，大样本的病例药敏研究是必要的。床应用价值，大样本的病例药敏研究是必要的。研究总结研究总结 1.1.通通通通过过过过基基基基因因因因工工工工程程程程技技技技术术术术克克克克隆隆隆隆、点点点点突突突突变变变变、表表表表达达达达和和和和纯纯纯纯化化化化出出出出具具具具有有有有较高热稳较高热稳较高热稳较高热稳 定性和发光效率的重组荧光酶制剂。定性和发光效率的重组荧光酶制剂。定性和发光效率的重组荧光酶制剂。定性和发光效率的重组荧光酶制剂。2.2.筛筛筛筛选选选选出出出出适适适适用用用用于于于于体体体体外外外外药药药药敏敏敏敏检检检检测测测测的的的的肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤细细细细胞胞胞胞选选选选择择择择性性性性培培培培养养养养基基基基，填补了国内在该领域的空白。填补了国内在该领域的空白。填补了国内在该领域的空白。填补了国内在该领域的空白。3.3.建建建建立立立立了了了了ATP-TCAATP-TCA技技技技术术术术核核核核心心心心试试试试剂剂剂剂的的的的质质质质量量量量控控控控制制制制标标标标准准准准，为为为为该该该该技术的产业化奠定了基础。技术的产业化奠定了基础。技术的产业化奠定了基础。技术的产业化奠定了基础。4.4.以以以以卵卵卵卵巢巢巢巢癌癌癌癌为为为为模模模模型型型型开开开开展展展展肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤体体体体外外外外药药药药敏敏敏敏检检检检测测测测，初初初初步步步步研研研研究究究究表表表表明明明明ATP-TCAATP-TCA是是是是一一一一种种种种较较较较为为为为可可可可靠靠靠靠的的的的药药药药敏敏敏敏检检检检测测测测方方方方法法法法，其其其其结结结结果与临床疗效及相关临床资料有较好的吻合性。果与临床疗效及相关临床资料有较好的吻合性。果与临床疗效及相关临床资料有较好的吻合性。果与临床疗效及相关临床资料有较好的吻合性。5 5.该该该该药药药药敏敏敏敏检检检检测测测测方方方方法法法法对对对对抗抗抗抗肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤药药药药物物物物筛筛筛筛选选选选和和和和应应应应用用用用、临临临临床床床床药药药药物物物物新新新新适适适适应应应应症症症症研研研研究究究究、化化化化疗疗疗疗方方方方案案案案筛筛筛筛选选选选和和和和评评评评估估估估以以以以及及及及推推推推广广广广个个个个体体体体化化化化治疗具有实际指导意义。治疗具有实际指导意义。治疗具有实际指导意义。治疗具有实际指导意义。发表论文发表论文 已发表已发表 1.王燕，傅军等.脂肪酸合成酶在非小细胞肺癌诊断及预后的临床意义.中华外科 杂志.2001,14（5）45-47.2.Xu M,Jin Y-L,Fu J,The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta,p53 and Ki67 protein in normal,premalignant and malignant esophageal tissues.World J Gastroenterol.2002,8(2):200-2.待发表待发表 3.Jun Fu,Ping Qu,Mo Li,et al.Expression of plant associated human cancer antigen in normal,premalignant,and malignant esophageal tissues.World J Gastroenterol.4.傅军，田海梅等.植物相关人肿瘤抗原在乳腺癌中的表达及其临床意义.中华肿瘤杂志。5.田海梅，傅军等.人乳腺癌细胞异质性及其生物学行为研究.中华肿瘤杂志。致谢衷心感谢我的导师张伟研究员三年来对我的辛勤教诲和培养。本文是在他的悉心关怀和指导下完成的。三年来导师在科学上的远见卓识、严谨的工作作风、虚怀若谷的胸怀和正直的人品一直是我学习的楷模并使我受益终身。本论文是在肿瘤研究所肿瘤生物学检测中心完成的，在这里得到了田海梅老师的极大支持和指导。实验室刘毅、曲平、刘朝阳老师都给予我热情的帮助、支持和指导，我的师弟黄泓，王小兵也参与了部分研究工作，在此表示最衷心的感谢。本课题系由肿瘤医院妇瘤科与肿瘤生物学检测中心合作进行，肿瘤标本由妇瘤科提供，在这里得到了吴令英主任和张凯主治医师的热情指导和帮助，在此向他们表示衷心的感谢。教育处林赛荣老师和王珑珑老师在我的学习和生活上给予许多关怀、帮助和照顾，令我感激不尽。谨在此向所有关心和帮助过我的老师和同学致以衷心的感谢。Enjoy the flashes sparkling the nightThank you for your attention!各种体外药敏检测方法与临床疗效的相关性各种体外药敏检测方法与临床疗效的相关性adapted from:DeVita VT,Hellman S,Rosenberg SA:Cancer:Principles and Practice of Oncology,1997AssayHTCA3H-TDISCMTTATP 传统化疗 ATP-TCA指导化疗6.ATP-TCA辅助治疗复发性卵巢癌的临床辅助治疗复发性卵巢癌的临床期试验结果（期试验结果（1998）050100150200250020406080100ATP-TCAATP-TCA指导的化疗指导的化疗(n=39)传统化疗传统化疗(n=17)p=0,0009Weeks%Patients050100150200250020406080100ATP-TCAATP-TCA指导的化疗指导的化疗(n=39)传统化疗传统化疗(n=17)p=0,0016Weeks%PatientsOverall SurvivalProgression free Survival引自引自KurbacherCM,CreeIA,Brucker.AnticancerDrugs.1998,9:51-57传统化疗和传统化疗和ATP-TCAATP-TCA指导的化疗的指导的化疗的生存率比较生存率比较卵巢癌原发部位、大网膜转移及腹水药敏卵巢癌原发部位、大网膜转移及腹水药敏检测结果检测结果大大网网膜膜转转移移腹水腹水原发原发灶灶结果评价结果评价PTX+CBPCTX+ADM+CBPGEM+DDPTPT+PTX+CBP原发灶原发灶耐药耐药轻度敏感轻度敏感部分敏感部分敏感较敏感较敏感大网膜转移大网