NY∕T 4031-2021 动物源性食品中住肉孢子虫检测方法.pdf

ICS 11.220CCS B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T 40312021动物源性食品中住肉胞子虫检测方法Detection methods of Sarcocystis spp. in animal-derived foods20217275 发布 2022-06-01 实施、中华人民共和国农业农村部发布NY/T 40312021-XT. -A-刖 a本文件按照GB/T 1. 1- 2020标准化工作导则 第1部分;标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC 181)归口。本文件起草单位:中国农业科学院上海兽医研究所、云南大学生命科学学院。本文件主要起草人:陈兆国、米荣升、黄燕、龚海燕、张炜华、胡俊杰。INY/T 40312021动物源性食品中住肉抱子虫检测方法1范围本文件规定了动物肌肉中住肉抱子虫包囊检查和PCR检测方法的技术要求。本文件压片镜检法适用于牛、羊、猪、马等动物肌肉中住肉抱子虫的检测;PCR法适用于黄牛中寄生 的隆美尔住肉泡子虫（S.产生.F氏住肉胞子虫（S.皿或）、莱勺 hominis） ,S. buffalonis 犬住肉抱子虫（S.tenella ）、白羊犬住肉 W（S. de/ioge/is，s）,耗牛中寄生的枯 fusiformis、人住肉抱子虫（S.）,山羊中寄生的山羊 的柔嫩住肉抱子虫（S.）.猪中寄生的米氏住肉抱子虫（S. 42规范性引用下列文件仅该日期对哈GB/T 6*口:适用本文件可少的3 版本（包期的引用文件, 适用本文件。WS/T术语和本文件:缩略语下列缩略dcoxl :线粒DNA：脱氧” EB：澳化乙锭， PCR：聚合酶链思PBS：磷酸盐缓冲，D基因(Pol*l sphat eTAE： Tr is-乙酸电泳缓5样品的采集、保存和运输5. 1样品的采集根据不同动物肌肉的具体情况，每头动物采集胴体一个部位或多个部位肌肉，尤其注意采集这些肌肉 中有米粒状包囊的肌肉样品，记为一份肉样,其质量不少于50 g。5.2样品的保存和运输5.2.1 采集的样品,不超过24 h检测的，在2 c-8。条件下保存即可；1月以内检测的,存放温度不高 于一20 C；超过1个月检测的,存放于一80 以下冰柜，或浸泡在福尔马林溶液中。所有阳性样品，发出 检测报告30 d后方可无害化处理。5.2.2 样品应放在不透水、防泄漏的密封袋中,置于保温盒中，并加冰袋或冰块保持低温，尽快送到实验 室。所有样品应附有一份说明，内容包括样品提交人、样品采集地点（最好标明经度和纬度）、采样日期、联 系方式、动物种类、动物年龄（日龄）、动物部位、动物病史等。1NY/T 403120216检测方法6.1 压片镜检法6.1.1 主要仪器设备6.1.1.1 外科手术剪。6.1.1.2 不锈钢银子。6.1.1.3 不锈钢、铝合金或塑料肉样盘，内有格子并编号。6.1.1.4 载玻片。6.1. 1.5普通生物显微镜或倒置显微镜。6.1.2 试剂6.1.2.1 甘油（生化级）:市售产品。6.1.2.2 甘油透明液（见附录A中的A.1）。6.1.3 操作方法6.1.3 . 1 目检剔除肉样上附着的脂肪组织、结缔组织撕去肌膜，暴露出肌肉表面层后,在阳光下或日光灯下仔细观 察肌肉内、肌肉表面是否含有纺锤形、圆柱形、卵圆形、椭圆形、长形等形状，与肌纤维方向平行的灰白色或 乳白色包囊。6.1.3.2压片镜检取目检时剪取的包囊、疑似包囊,直接用2片载玻片压片镜检。目检未见包囊的肉样，按随机采样的 要求，用剪刀顺肌纤维方向剪取肉样，再沿肌纤维方向剪成铅笔芯大小的小条（约10 mmX3 mm X 3 mm）,每个部位至少4条。将剪取的肌肉放在载玻片上，每片放置4条6条。必要时，可添加适量甘 油透明液。另取一块载玻片重叠放在有肉条的载玻片上,用力挤压，使肉条压成半透明（能初步看清另一 块载玻片下面背景的字样）。把制好的压片放在低倍显微镜下（10倍X10倍）,从压片一端的边沿开始检 查，直到另一端为止。6. 1.4结果判定6. 1.4. 1不同种类的住肉抱子虫包囊大小、形态差异很大,部分种类肉眼可辨，如山羊的莫尔氏住肉抱子 虫（Sar wcy s出wwa/eW）和绵羊的巨住肉胞子虫（S. gigawt ea）的包囊。莫尔氏住肉抱子虫包囊呈暗白 色、卵圆形,长可达17 mm,宽可达7 mm,常见于食道;包囊内壁分枝，呈菜花状，包含13 15 Mm长 的缓殖子;有时可见2种大小的包囊:一种末端粗而圆,缓殖子大小为（11U/m（平均14.1 r m）X（3 6）Mm （平均4.5 pt m）,仅在食道肌肉中出现，另一种为薄壁包囊，小而细,所含缓殖子大小为（913）*m （平均12. 2 Mm）X（24）Mm （平均2. 9 /zm）,可见于膈肌和骨骼肌中。肉眼可见的巨住肉抱子虫包囊主 要存在于年龄较大的老羊，食道、喉和舌头常见,横膈膜和胴体的其他部位较少出现，其包囊长度可达 1 cm,呈暗白色，圆形、椭圆形或梨形，有时类似米粒。包囊壁薄（24!1）、光滑,常被结缔组织包围。但 多数家畜、家禽寄生的住肉抱子虫种类的包裹肉眼难以觉察,如猪的住肉抱子虫包囊长仅2 mm或更小. 因此，目检法若直接在肌肉内发现住肉抱子虫大型包囊,可判为疑似,继续进行显微镜观察;未发现住肉泡 子虫大型包囊,按显微镜观察结果判定。6.1.4. 2在显微镜下，若发现住肉抱子虫包囊，呈纺锤形、圆柱形、卵圆形、椭圆形、长形等形状，包囊壁光 滑或表面有横纹、短指状突起，压迫包囊溢出有大量直径10四m20 pt m,呈圆形、椭圆形或香蕉形、颜色 偏暗的缓殖子（如果虫体已经钙化，则呈黑色小团块）（见附录B）,即可确定为住肉抱子虫感染。一份肌肉 样品任一部位发现有住肉抱子虫包囊.即可判定该份肉样为住肉抱子虫阳性；若各部位肌肉均未发现住肉 独子虫包囊，则判定为阴性。6. 2 PCR 法6.2.1 仪器2ny/t 403120216.2.1.1 PCR基因扩增仪。6. 2. 1.2高速台式冷冻离心机:最大转速大于15 000 r /min。6. 2. 1.3低速大容量离心机:最大转速大于3 000 r /min。6.2. 1.4 微量可调移液器：2 *L、1O *L、2O /zL、200 000 fzLo6.2.1.5核酸电泳仪。6. 2. 1.6核酸电泳槽。6.2.1.7凝胶成像分析系统。6. 2.1.8组织研磨仪。6.2.1.9高压蒸汽灭菌器。水浴锅。6.2.2材料FUBL/s6.2.2.16.2. 2.26. 2. 2. 36. 2. 2. 46.2.2.56.2,2.6外科手术雪 不锈钢,烧杯；离“ ：一 200Wc.I试剂6. 2. 3. 1(PBS)(见6.2.3.26. 2. 3. 36. 2.3.46. 2. 3. 56. 2. 3. 6同类6. 2. 3. 7lOXPlR产品6. 2. 3. 86.2. 3.9引物(上、下6. 2, 3.106.2. 3. 11于质6.2. 3.12 DNA上样缓冲液:6.2. 3. 13蛋白酶K：市售产品。6.2.3.14 质控标准包囊，阳性质控标准住肉殉子虫包囊为窿美尔仔肉孜子比.德宏住肉抱子虫、宗山羊 犬住肉胞子虫、米氏住肉狗子虫、柏氏住肉抱子虫或其他种类的住肉抱子虫包囊，肉眼可见的大型包囊数 量在io个以上.肉眼无法分辨的包裹在104个以上。阴性质控对照为不含住肉抱子虫包囊的同种类 肌肉。6.2.4操作步骤6. 2. 4. 1 DNA 抽提取出新鲜或冻存肌肉，除去脂肪和结缔组织*按采集的样品体积大小,进行多点取样（至少3个点），每 个点取。.1 g左右。将所取样品混合在一起，用灭菌的剪刀将肌肉剪碎，置于无菌L 5 mL离心管中，加入 2颗3颗陶粒珠或不锈钢珠，用组织研磨仪研磨。研磨好的样品加入400 mL PBS和40 KL蛋白酶K,充 分混匀后,放置于56 X:水浴锅消化2 h3 h至溶液澄清*其间每30 min混匀1次。消化完成的肌肉悬浮 3NY/T 40312021液，按DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取。测定并记录DNA在260 n m和280 n m的吸光度，将 DNA适当稀释或浓缩，使其OD迎值在0.10. 8的区间内。以1个ODe。值相当于50 mg/L DNA浓度 来计算DNA的浓度;DNA溶液（）D26/（）D标值应为1.72. 0,或质量能符合检测要求。将提取的基因组 DNA置于一20 冰箱保存。6. 2. 4. 2 PCR 扩增采用PCR方法扩增住肉胞子虫coxl基因部分序列,PCR产物大小约为1 085 bp。PCR采用50匹 反应体系：10XPCR Buffer(含 MgCl2) dNTP Mixt ur eCZ. 5 mmol/L) SFK100 Mmol/L)SR9(100 pt mol/L)DNA 聚合酶(L0 U/rL) DNA模板PCR用水5. 0 jlL4.0 mL1. 0 piL1. 0 pt L1. 00.1 pig-1. 0 fig补足至50. 0 p.LPCR循环参数；95七预变性15 min；94 变性30 s,53 退火30 s,72 延伸90 s,45个循环;72 延伸10 min。弓|物SF1和SR9见附录B。阳性对照模板为6. 2. 3. 14节中所列的住肉抱子虫包囊加入 2 g不含住肉池子虫包囊的新鲜同种肌肉中，按6. 2. 4.1所列方法提取的、浓度为25 mg/L50 mg/L的 住肉基因组DNA样品；阴性对照模板为2 g不含住肉抱子虫包囊的新鲜同种肌肉按6. 2. 4.1所列方法提 取的DNA。6.2.4. 3琼脂糖凝胶电泳用1XTAE缓冲溶液配制1.0%琼脂糖凝胶，每100 mL凝胶中加入5 piLEB（见附录C）或同类核酸 染料。取PCR产物54一,添加适量的DNA上样缓冲液，在1.0%琼脂糖凝胶中以1 V/cm10 V/cm凝 胶的电压下进行电泳，采用凝胶成像分析系统观察电泳结果并拍照。6. 2.5结果判定6. 2, 5.1质控标准按6. 2. 4. 2方法扩增,阳性对照出现一条大小约为1 085 bp条带、阴性对照无条带时判定为试验 有效。6. 2. 5. 2结果判定阳性:被检样品扩增产物泳道出现一条大小约为1 085 bp条带时，判为住肉拖子虫核酸阳性。阴性：被检样品扩增产物泳道没有出现任何条带,经重复PCR检测仍未出现扩增条带时.判为住肉胞 子虫核酸阴性。7综合判定受检样本经压片镜检法和PCR法任一项检测出阳性,判为该样品阳性。4NY/T 40312021A. 1甘油透明液甘油加双蒸水至A. 2 0. 01 mol/L pHNaH=P() - Na2 Hpe)4 . NaCl 加入 800强下蒸汽灭菌HCI调节室温附录A （资料性） 试剂配制.034X105 Pa 压Tr is 碱 冰醋酸 EDTA（i 加蒸播2 成 IX TAE。242漠化乙锭, 加蒸储水定式1. 0 %琼脂糖凝琼脂糖加1XTAE定容至lOOM 5 rL.使浓度为0. 5 1退/1111,或3 固后移去样品梳.当天使用。波炉卜热加入10 mg/mL澳化乙锭 垓战达赳必胶灌制平台上，插上样品梳，凝5NY/T 40312021附录B （资料性） 参照图及PCR产物序列B. 1肌肉组织中及分离的住肉抱子虫包囊参照图黄牛、绵洋、猪、马肌肉组织中和/或从肌肉组织中分离的住肉抱子虫包囊见图B. 1图B. 4。标引序号说明：A 黄牛肌肉组织中的住肉胞子虫包囊（箭头所示）：B- 黄牛肌肉中分离出的住肉抱子虫包囊（箭头所示）。图B. 1黄牛肌肉组织中的住肉匏子虫包囊图B.2绵羊肌肉组织中的住肉抱子虫包囊（箭头所指）6NY/T 40312021图B.3猪肌肉中分离的米氏住肉瓶子虫包囊B.2住肉袍子虫DNAPCR阳性参照图标引序号说明；VP-绒毛突起。图B. 4马肌肉中分离的柏氏住肉瓶子虫包囊家山羊犬住肉胞子虫(Sar cocy就s hircicanis)DNA PCR检测阳性参照图见图B. 5OM P N标引序号说明：M - DNA分子量标准；P 住肉抱子虫DNA扩增结果；N 阴性对照。图B5家山羊犬住肉瓶子虫DNA的PCR扩增结果B.3家山羊犬住肉泡子虫PCR扩增片段参照序列家山羊犬住肉抱子虫DNA PCR扩增产物序列(登录号KU820976. D为：1 ATGGCGTACAACAATCATAAAG/IACTAGCCGTTATGTATCTACTTACGGCGGGTATCTTT61 AGCGTTGTTGGTACTTTAATATCGGATGTGGTTCGCTATGAACTAGCGGCTTCAGGCTCG121 AGGCTCTTTGCCGTAGATGCCCTGGGTACTTACAATGTGCTGTTTACGATCCACGGTCTG181 GCCATGATATTCATGTT(n TGATGCCAGCCCTGTTCTCCGGTTCGGTAACTACTTCATA241 CCGCTGTACTCAG(ATCCXCCGAGGTCGCCTTACCGAGGATCAACTCGATATCTTACTTC301 TTGCTGCCTCTCGGCTCGACACTCCTCCTICACTCGATAGTTGCGGAGTTCGGTGCGGCC361 ATCGGCTGGACTATGTATCCGCCTCTGAGCACTACCGGCGGGACTACGAATACGGAGGCC421 ATAGACTGGGTAGTICTTGGCCTGGGTATTCTAGGACTGAGTAGTGTGCTCGGGTCGGTC 7NY/T 403120214815416016617217818419019611 0211 081AACTTCCTAGGT/XCTGTACTGTTTGGCGCTTCAATGGCCTCGCTACGTCATGCTGCACTT CTGGTATGGGCAGTGATATTTACCGCCTIAATGTTGATCATCACCATACCGATCTTTACC GGAGCACTAGT/XATGCTCC：TAGCCGATCTAGAGTCvr AACTACGCX?TTCTACGACGGTGGC CTTGGT（；GAGACGCCATACTGTACCAGCACTTATTCTGGTTCTTCGGGCACCCTGAAGTA TATATCCTGArr TCTACCGGGGTTr GGGTAATATCGCAATGCCTGAGCAGCGTGAGCGGT AGAGCAGTATTCGGAAGTCAGGCCATGArTCTCGCTATGGGCTGCATATCGATACTCGGT ACCCTGGTATGGGCTCATCACATGATGACCACTGGCCTCGAAGCCGATACACGATCGTAC TTCTCTGCr GTGACTATCATGATAGCCATACCGACGGGC:ACTAAGATATTC：AACT（；GATA TGTACGGTAATGGCCTCACCACGTCACTGGATATCGACGGATCAATGGATCGCCATATCC TTCGCCGTGCTGTTCAGCCTGGGAGGCACGACAGGCGTAGTCATGGGCAATGGCGGTATG GATAT8ny/t 4031-2021附录C （资料性） 引物序列SF1 ： 5-ATG GCG TAC AAC AAT CAT AAA GAA-3；SR9：5-ATA TCC ATA CCR引物参考住肉抱子虫线粒体继列设计.扩增片段大小约耳廨蔻0. 1 mol/L 2. 0 。F U b 乙& /coxidase subun it I, coxl）基因序定程度差异。引物终浓度为9