T∕SXSL 09-2022 饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法.pdf

IICS 65.120CCS B46ICS 65.120CCS B46团体标准T/SXSL 09-2022饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定 液相色谱饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法串联质谱法Determination of nitroimidazole drugs and their metabolite residuesin feedsLiquid chromatography tandem mass spectrometry20220812 发布发布20220910 实施实施陕西省饲料协会陕西省饲料协会发布发布T/SXSL 09-2022前言前言本标准按照 GB/T 1.1-2020标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本标准某些内容可能涉及专利。本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由陕西省饲料协会提出并归口。本文件起草单位： 陕西秦云农产品检验检测股份有限公司， 黑龙江省农产品和兽药饲料技术鉴定站、陕西正能农牧科技有限公司、陕西鑫诚大唐畜牧有限公司、陕西艾丰唐农业科技有限公司。本标准主要起草人：李宏、雷浩、高云峰、贺习文、刘妩妍、张博、王义辉、马红军、李祯、赵柳、孙涛、许军红、李易轩、高勤叶、汪军明、李彦珍、赵娟、王璐。本标准为首次发布。本文件由陕西秦云农产品检验检测股份有限公司负责解释。单位：陕西秦云农产品检验检测股份有限公司。单位地址：陕西省渭南市经济技术开发区，永兴大道与建业路丁字口西南角。电话：[phone]邮编：714000T/SXSL 09-20221饲料中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法1范围本文件中规定了饲料中 2-甲硝咪唑、4-硝基咪唑、奥硝唑、苯硝咪唑、地美硝唑、甲硝唑、卡硝唑、氯甲硝咪唑、罗硝唑、羟甲基甲硝咪唑、羟基甲硝唑、羟基异丙硝唑、塞克硝唑、替硝唑、异丙硝唑的液相色谱-串联质谱法测定方法。本文件中适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中 2-甲硝咪唑、4-硝基咪唑、奥硝唑、苯硝咪唑、地美硝唑、甲硝唑、卡硝唑、氯甲硝咪唑、罗硝唑、羟甲基甲硝咪唑、羟基甲硝唑、羟基异丙硝唑、塞克硝唑、替硝唑、异丙硝唑含量的测定。本文件中 2-甲硝咪唑、4-硝基咪唑、奥硝唑、苯硝咪唑、地美硝唑、甲硝唑、卡硝唑、氯甲硝咪唑、罗硝唑、羟甲基甲硝咪唑、羟基甲硝唑、羟基异丙硝唑、塞克硝唑、替硝唑、异丙硝唑的检出限为 1.0 ug/kg，定量限为 3.0 ug/kg。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 20195动物饲料试样的制备3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4原理试样中的硝基咪唑类药物用乙酸乙酯提取，经 MCX 固相萃取柱净化后，用液相色谱-串联质谱仪测定，基质匹配标准曲线校准，外标法定量。5试剂或材料除非另有规定，仅使用色谱纯试剂。5.1水：GB/T 6682，一级。5.2乙腈。5.3甲醇。5.4乙酸乙酯。5.5正己烷。T/SXSL 09-202225.6氨水：分析纯。5.7甲酸。5.8甲酸溶液（0.2%）：移取 2 mL 甲酸于 1 000 mL 容量瓶中，用水稀释定容，混匀。5.9甲酸溶液（0.1%）：移取 1 mL 甲酸于 1 000 mL 容量瓶中，用水稀释定容，混匀。5.10氨化甲醇溶液（5%）：移取 5 mL 氨水于 100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释定容，混匀。5.11标准品：地美硝唑（CAS:551-92-8，纯度98%）、异丙硝唑（CAS: 14885-29-1，纯度均98%） 、甲硝唑 （CAS: 443-48-1， 纯度98%） 、 塞克硝唑 （CAS: 3366-95-8， 纯度98%） 、 罗硝唑 （CAS: 7681-76-7，纯度98%）、奥硝唑（CAS:16773-42-5，纯度98%）、卡硝唑（CAS: 42116-76-7，纯度98%）、替硝唑（CAS: 19387-91-8，纯度98%）、4-硝基咪唑（CAS: 3034-38-6，纯度98%）、羟基甲硝唑（CAS:4812-40-2，纯度98%）、2-甲硝咪唑（CAS: 696-23-1，纯度98%）、羟甲基甲硝咪唑（CAS:936-05-0，纯度98%）、氯甲硝咪唑（CAS: 4897-25-0，纯度98%）、苯硝咪唑（CAS: 94-52-0，纯度98%）、羟基异丙硝唑（CAS:35175-14-5，纯度98%）。5.12标准储备溶液(1 mg/mL)： 准确称取15种硝基咪唑类药物标准品(5.11)各10 mg (精确到0. 00001g)分别于 10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解，并稀释定容，混匀。贮存于棕色试剂瓶中，于-18以下保存，有效期为 6 个月。5.13混合标准溶液(10 ug/mL)：准确移取 15 种硝基咪唑类药物的标准储备液（5.12）各 0.1 mL 于 10mL 容量瓶中，用乙腈稀释定容，混匀。贮存于棕色试剂瓶中，于 -18保存，有效期为 3 个月。5.14混合标准系列溶液:准确移取适量硝基咪唑类药物混合标准溶液(5.13)于 10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释定容配制成浓度分别为 1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL 的标准工作溶液。临用现配。5.15强阳离子交换固相萃取小柱：规格为 200 mg/6 mL，或者性能相当者。5.16微孔滤膜：0.22 m，有机系。6仪器设备6.1液相色谱-串联质谱仪（配有电喷雾电离源）。6.2分析天平：感量 0.000 1 g 和 0.000 01 g。6.3涡旋混合器。6.4振荡器。6.5离心机：转速8 000 r/min。6.6固相萃取装置。6.7氮吹仪。6.8分析筛：0.42 mm。7样品按照GB/T 20195的规定制备样品，粉碎后过0.42 mm孔径分析筛，混匀，装入大磨口瓶中备用。选取与待测样品类型相同，均匀一致，且在待测物保留时间处仪器响应面积小于方法定量限30%的饲料样品，作为空白样品。8试验步骤8.1提取T/SXSL 09-20223称取试样 2 g（精确至 0.000 1 g）于 50 mL 离心管中，准确加入 10 mL 乙酸乙酯，涡旋 1 min，超声提取 10 min，冷却至室温，于 8 000 r/min 离心 5 min，上清液转入另一支洁净的离心管中，残渣用10 mL 乙酸乙酯复提取一次，合并提取液，于 40氮气吹干，加入 3 mL 0.2%甲酸溶液（5.8）溶解后，再加入 3 mL 正己烷，涡旋 1 min，弃去上层正己烷，下层溶液待净化。8.2净化强阳离子交换固相萃取小柱依次用 3 mL 甲醇、3mL 水活化，将提取液全部过柱，使其流速不大于 1 mL/min，用 3 mL 水淋洗，抽干 1 min，加入 3 mL 5%的氨化甲醇溶液洗脱（5.10） ，收集洗脱液于40氮气吹干，准确加入 1 mL 乙腈溶解，涡旋混匀。过膜后待测。8.3基质匹配标准系列溶液称取基质空白样品 6 份，按照 8.18.2 步骤操作处理至 40氮气吹干，分别准确加入 1 mL 混合标准系列溶液（5.14），配制成浓度分别为 1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL的基质匹配标准系列溶液，混匀。过膜后待测。8.4测定8.4.1液相色谱参考条件色谱柱：C18柱，柱长50 mm，内径2.1 mm，粒径1.9 m。或性能相当者。流动相：A相：0.1%甲酸溶液（5.9）；B相：乙腈，洗脱条件见表1。流速：0.2 mL/min。柱温：40。进样量：2 L。表 1梯度洗脱条件时间（min）A 相(%)B 相(%)0.0.090101.090105.010907.010907.190101090108.4.2质谱参考条件电离方式：电喷雾离子源（ESI+）；监测方式：多反应监测（MRM） ；毛细管电压：3.5kV；离子源温度：150；脱溶剂温度：350。硝基咪唑类药物的多反应监测（MRM）离子对、锥孔电压及碰撞能量见表 2。T/SXSL 09-20224表 2硝基咪唑类药物的定性离子对、定量离子对及质谱条件被测物名称定性离子对m/z定量离子对m/z锥孔电压V碰撞能量V保留时间min4-硝基咪唑114.168.1114.168.146172.00114.197.1162-甲硝咪唑128.142.2128.142.260312.26128.182.117地美硝唑142.181.1142.181.150253.70142.196.115羟甲基甲硝咪唑158.155.2158.155.245172.96158.1140.116氯甲硝咪唑162.1116.1162.1116.153175.20162.1145.115苯硝咪唑164.191.1164.191.154354.37164.1118.120异丙硝唑170.1109.1170.1109.158244.21170.1124.117甲硝唑172.182.1172.182.146242.31172.1128.114塞克硝唑186.1128.1186.1128.144132.84186.1168.110羟基异丙硝唑186.1128.1186.1128.145134.12186.1168.110羟基甲硝唑188.1123.1188.1123.147114.61188.1126.116罗硝唑201.1110.1201.1110.130163.63201.1140.110奥硝唑220.182.1220.182.155274.66220.1128.115卡硝唑245.175.1245.175.130295.11245.1118.110替硝唑248.1121.1248.1121.159154.36248.1128.120T/SXSL 09-202258.4.3基质匹配标准系列溶液和试样溶液的测定在仪器最佳工作条件下，分别取基质匹配标准系列溶液（8.3）和试样溶液（8.2）上机进行测定。基质匹配标准系列溶液中硝基咪唑类药物的串联质谱离子流图参见附录 A。8.4.4定性每一个化合物选择 1 个母离子和 2 个子离子，在相同试验条件下，试样溶液中待测化合物与基质匹配标准系列溶液中对应化合物的保留时间偏差在 2.5%之内，且待测化合物定性离子的相对丰度与基质匹配标准系列溶液中浓度接近对应化合物定性离子的相对丰度比较，若偏差不超过表 3 规定的范围时，则可判定样品中存在对应的化合物。表 3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差单位为 %相对离子丰度502050102010允许的最大偏差202530508.4.5定量以基质匹配标准系列溶液中化合物的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制工作曲线，相关系数应不小于 0.99。试样溶液中待测物化合物的响应值均在基质匹配标准曲线的线性范围之内。若超过线性范围，需用乙腈对试样溶液和基质匹配标准溶液做相应稀释后，重新测定。单点校准时，试样溶液中待测化合物面积响应与基质匹配标准系列溶液中对应化合物面积响应差异应在 30%之内。9试验数据处理试样中硝基咪唑类药物的含量i以质量分数计，单位为毫克每千克（mg/kg），多点校准按公式（1）计算；单点校准按公式（2）计算。（1）式中：P1由基质匹配曲线查得的试样溶液中硝基咪唑类药物的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL ）；V 提取溶液的总体积，单位为毫升（mL）；V2氮气吹干后复溶液的体积，单位为毫升（mL）；n 试样溶液浓度超出曲线后的稀释倍数；V1净化时所用试样提取溶液的体积，单位为毫升（mL）；m 试样质量，单位为克（g）。T/SXSL 09-20226（2）式中：Ai 试样溶液中硝基咪唑类药物的色谱峰面积；si基质匹配标准溶液中硝基咪唑类药物的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；V 试样提取溶液的总体积，单位为毫升（mL）；V2氮气吹干后复溶液的体积，单位为毫升（mL）；n 试样溶液浓度超出曲线后的稀释倍数；Asi基质匹配标准溶液中硝基咪唑类药物的峰面积；V1净化时所用试样溶液的体积，单位为毫升（mL）；m 试样质量，单位为克（g）。测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留 3 位有效数字。10精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该平均值的 10%。T/SXSL 09-20227附录 A(资料性附录)15 种硝基咪唑类药物的液相色谱串联质谱离子流色谱图附录 A(资料性附录)15 种硝基咪唑类药物的液相色谱串联质谱离子流色谱图15 种硝基咪唑类药物的液相色谱串联质谱定量离子色谱图见 A.1。T/SXSL 09-20228T/SXSL 09-20229T/SXSL 09-202210注：由上向下分别为 4-硝基咪唑、2-甲硝咪唑、地美硝唑、羟甲基甲硝咪唑、氯甲硝咪唑、苯硝咪唑、异丙硝唑、甲硝唑、塞克硝唑、羟基异丙硝唑、羟基甲硝唑、罗硝唑、奥硝唑、卡硝唑、替硝唑图A.1 基质匹配标准溶液中15种硝基咪唑类药物及其代谢物10 ng/mL定量离子色谱图