KJ 202101 食品中赭曲霉毒素A的快速检测 胶体金免疫层析法.pdf

书 书 书食 品 快 速 检 验 方 法犓犑 食品中赭曲霉毒素犃的快速检测胶体金免疫层析法 发布国家市场监督管理总局发 布书 书 书食品中赭曲霉毒素犃的快速检测胶体金免疫层析法范围本方法规定了食品中赭曲霉毒素的快速检测胶体金免疫层析法。本方法适用于谷物（燕麦除外） 、葡萄酒、烘焙咖啡豆、研磨咖啡（烘焙咖啡）和速溶咖啡中赭曲霉毒素的快速测定。原理本方法采用竞争抑制免疫层析原理，样品中的赭曲霉毒素经提取与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制了抗体和试纸条中检测线（线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线（线）与控制线（线）颜色深浅比较，对样品中赭曲霉毒素进行定性判定。试剂与材料 试剂除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，实验用水为 规定的二级水。 甲醇。 乙腈。 无水乙醇。 盐酸。 三羟甲基氨基甲烷（ 碱） 。 氯化钠。 氯化钾。 磷酸氢二钠。 磷酸二氢钾。 试剂配制 甲醇乙腈（ ） ：分别量取 甲醇（ ） 、 乙腈（ ） ，混合均匀。 盐酸溶液（） ：量取 盐酸（ ）缓慢倒入 水中，定容至 ，混匀。 谷物稀释液：称取 碱（ ） ，加入 水，充分搅拌溶解后用盐酸溶液（ ）将值调节至 ，向溶液中加入氯化钠 （ ）充分搅拌至溶解，加水定容至，或使用胶体金免疫层析检测试剂盒配套稀释液。 葡萄酒稀释液：称取 碱（ ） ，加入 的水，充分搅拌溶解后，用盐酸溶液（ ）将值调节至 ，向溶液中加入氯化钠（ ） ，充分搅拌至溶解，加水定容至。或使用胶体金免疫层析检测试剂盒配套稀释液。 咖啡复溶液：分别称取氯化钠（ ） 、氯化钾（ ） 、磷酸氢二钠（ ） 、磷犓犑 酸二氢钾（ ） 于 烧杯中，加水充分搅拌溶解后转移至 容量瓶中定容。取上述溶液 加入 水混合均匀，即为咖啡复溶液。或使用胶体金免疫层析检测试剂盒配套复溶液。 标准品赭曲霉毒素标准品：纯度 ，或经国家认证并授予有证标准物质证书的标准物质。其中文名称、英文名称、号、分子式、相对分子质量见表。表赭曲霉毒素犃的中文名称、英文名称、犆犃犛号、分子式、相对分子质量中文名称英文名称号分子式相对分子质量赭曲霉毒素 标准溶液配制 赭曲霉毒素标准储备溶液（ ） ：准确称取适量的赭曲霉毒素标准品（ ）于烧杯中溶解后转移至 容量瓶中，用甲醇乙腈（ ） （ ）溶解并稀释至刻度，摇匀，配成 的赭曲霉毒素标准储备液。在 保存，可使用个月。 赭曲霉毒素标准工作液（） ：准确量取赭曲霉毒素标准储备溶液（ ）（ ），置于 容量瓶中，用甲醇乙腈（ ） （ ）稀释至刻度，摇匀。于避光保存，可使用天。 赭曲霉毒素标准工作液（ ） ：准确量取赭曲霉毒素标准工作液（）（ ） ，置于 容量瓶中，用甲醇乙腈（ ） （ ）稀释至刻度，摇匀。临用现配。 材料赭曲霉毒素胶体金免疫层析试剂盒：金标微孔（含胶体金标记的特异性抗体） 、试纸条。需在阴凉、干燥、避光条件下保存。设备与仪器 电子天平：感量分别为 和 。 粉碎机。 涡漩混合器。 离心机： 。 移液器： 、 、。 氮吹仪。 计。 筛网： 孔径。环境条件环境温度： ；相对湿度： 。犓犑 分析步骤 试样制备谷物、烘焙咖啡豆：取具有代表性样品约 ，用高速粉碎机将其粉碎，全部通过 孔径试验筛，过筛，混合均匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记。焙烤咖啡、速溶咖啡：取具有代表性样品约 ，混合均匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记。葡萄酒：取代表性样品混合均匀。 试样提取 谷物准确称取试样（精确至 ） ，置于 离心管中，依次加入 水，谷物稀释液（ ） ，涡漩混匀 后静置 ， 离心 ，上清液即为待测液。 葡萄酒吸取 试样于离心管中，依次加入 水， 葡萄酒稀释液（ ） ，涡漩混匀 后静置 ，混匀后的液体即为待测液。 烘焙咖啡豆、焙烤咖啡、速溶咖啡准确称取试样（精确至 ） ，置于 离心管中，加入无水乙醇（ ） ，涡漩混匀 后静置 ， 离心 。取上清液，于 水浴中氮气吹干。烘焙咖啡豆、焙烤咖啡加入 咖啡复溶液（ ） ，速溶咖啡加入咖啡复溶液（ ） ，涡漩混匀 ，作为待测液。注：试样提取（ ）过程可按照试剂盒说明书操作。 测定步骤吸取 上述待测液于金标微孔中，抽吸至孔底颗粒完全溶解，室温条件下进行孵育：谷物孵育 ，葡萄酒孵育 ，烘焙咖啡豆、焙烤咖啡、速溶咖啡孵育 。将试纸条吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中，室温条件下谷物反应 ，葡萄酒反应 ，烘焙咖啡豆、焙烤咖啡、速溶咖啡反应 。从微孔中取出试纸条，弃去试纸条下端的样品垫，观察显色情况，进行结果判定。若试剂盒冷藏保存，使用前需恢复至实验环境温度。注：测定步骤（ ）也可按照试剂盒说明书进行。 质控试验每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。 空白试验称取空白试样，按照 和 步骤与样品同法操作。 加标质控试验谷物样品：准确称取空白样品（精确至 ）置于 具塞离心管中，加入 赭曲霉毒犓犑 素标准中间液（ ） （ ） ，使谷物中赭曲霉毒素浓度为 ，按照 和 步骤与样品同法操作。烘焙咖啡豆、焙烤咖啡样品：准确称取空白样品（精确至 ）置于 具塞离心管中，加入 赭曲霉毒素标准中间液（ ） （ ） ，使焙烤咖啡豆、焙烤咖啡中赭曲霉毒素浓度为 ，按照 和 步骤与样品同法操作。速溶咖啡样品：准确称取空白样品 （精确至 ）置于 具塞离心管中，加入 赭曲霉毒素标准中间液（ ） （ ） ，使速溶咖啡中赭曲霉毒素浓度为 ，按照 和 步骤与样品同法操作。结果判定通过对比质控线（线）和检测线（线）的颜色深浅进行结果判定，见图目视判定示意图。 无效控制线（线）不显色，无论检测线（线）是否显色，表明操作不正确或试纸条已失效，检测结果无效。 阳性结果控制线（线）显色，检测线（线）不显色或颜色浅于控制线（线） ，表明样品中赭曲霉毒素高于方法检测限，判为阳性。 阴性结果控制线（线）显色，检测线（线）颜色深于控制线（线）或与控制线（线）颜色基本一致，表明样品中赭曲霉毒素低于方法检测限，判为阴性。图目视判定示意图犓犑 质控试验要求空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。结论本方法筛查出的阳性样品应按照 指定方法标准进行确证。性能指标 检出限谷物为 ；葡萄酒为 ；烘焙咖啡豆、焙烤咖啡为 ；速溶咖啡为 。 灵敏度灵敏度 。 特异性特异性 。 假阴性率假阴性率。 假阳性率假阳性率。注：性能指标计算方法见附录。 其他本方法分析步骤和结果判定可以根据厂家试剂盒的说明书进行，但应符合或优于本方法规定的性能指标。本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为了方便方法使用者，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标时方可使用。本方法参比标准为 食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素的测定 （包括所有的修改单） 。犓犑 附录犃（规范性）定性方法性能指标计算表定性方法各个性能指标计算见表 。表犃 定性方法性能指标计算表样品情况检测结果阳性阴性总数阳性犖 犖 犖犖 犖 阴性犖 犖 犖犖 犖 总数犖 犖 犖 犖 犖 犖 犖犖犖或犖 犖 显著性差异（）（犖 犖 ）（犖 犖 ） ，自由度（犱犳）灵敏度（狆） 狆犖 犖 特异性（狆） 狆犖 犖 假阴性率（狆犳） 狆犳犖 犖 灵敏度假阳性率（狆犳） 狆犳犖 犖 特异性相对准确度（犖 犖 ） （犖犖） 注：犖：任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：犖 表示第一行，第一列；犖表示所有的第一行，犖 表示所有的第二列；犖 表示第一行，第二列。样品中实际的公议值结果。赭曲霉毒素胶体金试纸条得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。为方法的检测结果相对准确性的结果，与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。本方法起草单位：山东省食品药品检验研究院。本方法验证单位：北京市食品安全监控和风险评估中心（北京市食品检验所） 、广东省食品检验所、安徽省产品质量监督检验研究院、山东食安检测技术有限公司、国家粮食和物资储备局、河南省口岸食品检验检测所。本方法主要起草人：田洪芸、张海红、王骏、毕婷婷、胡梅、任雪梅、叶金。犓犑