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生化技术第二篇 生化检测技术第一章第一章 生物大分子化学和光学检测技术生物大分子化学和光学检测技术糖的化学及光学检测技术糖的化学及光学检测技术蛋白化学及光学检测技术蛋白化学及光学检测技术核酸化学及光学检测技术核酸化学及光学检测技术第一节 糖的测定1.1费林试剂热滴定法（兰-爱龙法）原理原理还原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）还原糖是指含有自由醛基（如葡萄糖）或酮基（如果糖）的单糖和某些二糖（如乳糖和麦芽糖）。在碱性溶液中，的单糖和某些二糖（如乳糖和麦芽糖）。在碱性溶液中，还原糖能将还原糖能将Cu2+Cu2+、Hg2+Hg2+、Fe3+Fe3+、Ag+Ag+等金属离子还原，而等金属离子还原，而糖本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类的这种性质常被糖本身被氧化成糖酸及其他产物。糖类的这种性质常被用于糖的定性和定量测定。用于糖的定性和定量测定。本实验采用费林试剂热滴定法。费林试剂由甲、乙两种本实验采用费林试剂热滴定法。费林试剂由甲、乙两种溶液组成。甲液含硫酸铜和亚甲基蓝（氧化还原指示剂）溶液组成。甲液含硫酸铜和亚甲基蓝（氧化还原指示剂）；乙液含氢氧化钠，酒石酸钾钠和亚铁氰化钾。将一定；乙液含氢氧化钠，酒石酸钾钠和亚铁氰化钾。将一定量的甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，量的甲液和乙液等体积混合时，硫酸铜与氢氧化钠反应，生成氢氧化铜沉淀：生成氢氧化铜沉淀：2NaOH+CuSO4=Cu(OH)2+Na2SO42NaOH+CuSO4=Cu(OH)2+Na2SO4在碱性溶液中，所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反应，在碱性溶液中，所生成的氢氧化铜沉淀与酒石酸钠反应，生成可溶性的络合物酒石酸钾钠铜：生成可溶性的络合物酒石酸钾钠铜：在加热条件下，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸在加热条件下，用样液滴定，样液中的还原糖与酒石酸钾钠铜反应，酒石酸钾钠铜被还原糖还原，产生红色氧钾钠铜反应，酒石酸钾钠铜被还原糖还原，产生红色氧化亚铜沉淀，其反应如下：化亚铜沉淀，其反应如下：滴定时以亚甲基蓝为氧化还原指示剂。因为亚甲基蓝滴定时以亚甲基蓝为氧化还原指示剂。因为亚甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜离子全部被还原后，稍氧化能力比二价铜弱，待二价铜离子全部被还原后，稍过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的过量的还原糖可使蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型的亚甲基蓝，即达滴定终点。根据样液量可计算还原型的亚甲基蓝，即达滴定终点。根据样液量可计算出还原糖含量。出还原糖含量。反应生成的氧化亚铜沉淀也可与费林试剂中的亚铁氰化反应生成的氧化亚铜沉淀也可与费林试剂中的亚铁氰化钾（黄血盐）反应生成可溶性复盐，便于观察滴定终点。钾（黄血盐）反应生成可溶性复盐，便于观察滴定终点。Cu2O+K4Fe(CN)6+H2OCu2O+K4Fe(CN)6+Cu2O+K4Fe(CN)6+H2OCu2O+K4Fe(CN)6+H2OK2Cu2Fe(CN)6+2KOHH2OK2Cu2Fe(CN)6+2KOH操作方法一、样品中还原糖的提取一、样品中还原糖的提取准确称取准确称取1g1g藕粉，放在藕粉，放在100mL100mL烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加入约加入约40mL40mL蒸馏水，混匀，于蒸馏水，混匀，于5050恒温水浴中保温恒温水浴中保温20min20min，不时搅，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在50mL50mL的容量瓶中，的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。二、样品中总糖的水解及提取二、样品中总糖的水解及提取准确称取准确称取1g1g淀粉，放在大试管中，加入淀粉，放在大试管中，加入6mol/L 6mol/L HClHCl 10mL 10mL，蒸馏水，蒸馏水15mL15mL，在沸水浴中加热，在沸水浴中加热0.5h0.5h，取出，取出1 12 2滴置于白瓷板上，加滴置于白瓷板上，加1 1滴滴I-KII-KI溶溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕。冷却至室温后加入却至室温后加入1 1滴酚酞指示剂，以滴酚酞指示剂，以6mol/L 6mol/L NaOHNaOH溶液中和至溶液呈溶液中和至溶液呈微红色，并定容到微红色，并定容到100mL100mL，过滤取滤液，过滤取滤液10mL10mL于于100mL100mL容量瓶中，定容容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释至刻度，混匀，即为稀释10001000倍的总糖水解液，用于总糖测定。倍的总糖水解液，用于总糖测定。三、空白滴定三、空白滴定准确吸取费林试剂甲液和乙液各准确吸取费林试剂甲液和乙液各5.00mL5.00mL，置于，置于250mL250mL锥形瓶中，加蒸馏锥形瓶中，加蒸馏水水10mL10mL。从滴定管滴加约。从滴定管滴加约9mL9mL葡萄糖标准溶液，加热使其在葡萄糖标准溶液，加热使其在2min2min内内沸腾，准确沸腾沸腾，准确沸腾30s30s，趁热以每，趁热以每2s 12s 1滴的速度继续滴加葡萄糖标准滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。平行操作总体积。平行操作3 3次，取其平均值次，取其平均值 四、样品糖的定量测定四、样品糖的定量测定(1)(1)样品溶液预测定：吸取费林试剂甲液及乙液各样品溶液预测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL5.00mL，置于，置于250mL250mL锥形瓶中，加蒸馏水锥形瓶中，加蒸馏水10mL10mL，加热使其在，加热使其在2min2min内沸腾，准确沸腾内沸腾，准确沸腾30s30s，趁热以先快后慢的速度从滴定管，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要保持溶液呈沸腾状态。待溶中滴加样品溶液，滴定时要保持溶液呈沸腾状态。待溶液由蓝色变浅时，以每液由蓝色变浅时，以每2s 12s 1滴的速度滴定，直至溶液的滴的速度滴定，直至溶液的蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。(2)(2)样品溶液测定：吸取费林试剂甲液及乙液各样品溶液测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL5.00mL，置于锥形瓶中，加蒸馏水置于锥形瓶中，加蒸馏水10mL10mL，加玻璃珠，加玻璃珠3 3粒，从滴定管粒，从滴定管中加入比与测试样品溶液消耗的总体积少中加入比与测试样品溶液消耗的总体积少1mL1mL的样品溶液，的样品溶液，加热使其在加热使其在2min2min内沸腾，准确沸腾内沸腾，准确沸腾30s30s，趁热以每，趁热以每2s 12s 1滴滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品溶液的总体积。平行操作消耗样品溶液的总体积。平行操作3 3次，取其平均值。次，取其平均值。注意事项（1 1）费林试剂甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则）费林试剂甲液和乙液应分别贮存，用时才混合，否则酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出酒石酸钾钠铜络合物长期在碱性条件下会慢慢分解析出氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。氧化亚铜沉淀，使试剂有效浓度降低。（2 2）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原）滴定必须是在沸腾条件下进行，其原因一是加快还原糖与糖与Cu2Cu2的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的反应速度；二是亚甲基蓝的变色反应是可逆的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧的，还原型的亚甲基蓝遇空气中的氧时会再被氧化为氧化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所化型。此外，氧化亚铜也极不稳定，易被空气中的氧所氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝氧化。保持反应液沸腾可防止空气进入，避免亚甲基蓝和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。和氧化亚铜被氧化而增加消耗量。（3 3）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源）滴定时不能随意摇动锥形瓶，更不能把锥形瓶从热源上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。上取下来滴定，以防止空气进入反应溶液中。I2+2OH-IO-+I-+H2OC6H12O6+IO-+OH-C6H12O7-+I-+H2O3IO-IO3-+2I-IO3-+5I-+6H+3I2+3H2O酸性条件下酸性条件下葡萄糖酸葡萄糖酸1.2 次碘酸法（醛糖）及铜试剂法铜试剂法原理原理被测样品与过量的斐林氏被测样品与过量的斐林氏A A、BB液共沸，其中所液共沸，其中所含的还原糖将二价铜离子还原成氧化亚铜。剩余含的还原糖将二价铜离子还原成氧化亚铜。剩余的二价铜离子在酸性条件下与碘离子反应生成定的二价铜离子在酸性条件下与碘离子反应生成定量的碘。以疏代硫酸钠标准溶液滴定生成的碘，量的碘。以疏代硫酸钠标准溶液滴定生成的碘，从而计算出样品中总糖或还原糖的含量。从而计算出样品中总糖或还原糖的含量。滴定指示剂滴定指示剂 淀粉淀粉血糖的斐林法测定 血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子即被血血液中的葡萄糖与碱性硫酸铜溶液共热，铜离子即被血液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼酸试剂还液中的葡萄糖还原成氧化亚铜，后者又可使钼酸试剂还原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含量与产生的氧化亚原成低价的钼蓝（蓝色）。血糖的含量与产生的氧化亚铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合物的量成正比，铜成正比，氧化亚铜的量与形成的钼化合物的量成正比，可以用比色的方法进行测定。可以用比色的方法进行测定。取具取具25ml25ml刻度的血糖管刻度的血糖管3 3只，编号，用奥氏吸管吸取无蛋只，编号，用奥氏吸管吸取无蛋白血滤液白血滤液2ml2ml，放入第一只血糖管中，于第二只血糖管中，放入第一只血糖管中，于第二只血糖管中加加2ml2ml标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中加标准葡萄糖溶液。第三只血糖管中加2ml2ml蒸馏水。蒸馏水。然后各加然后各加2ml2ml新配置的碱性硫酸铜溶液，同时置沸水浴内新配置的碱性硫酸铜溶液，同时置沸水浴内煮煮6min6min，取出，在流水中迅速冷却，各加入，取出，在流水中迅速冷却，各加入4ml4ml酸性钼酸酸性钼酸盐溶液，盐溶液，1min1min后以蒸馏水稀释至后以蒸馏水稀释至25ml25ml，混匀，倒入比色，混匀，倒入比色杯，用杯，用722722型风光光度计于型风光光度计于420420440nm440nm波长比色（先以空波长比色（先以空白管调节零点，然后测标准管和样品管）。白管调节零点，然后测标准管和样品管）。1.3 硫酸-苯酚法实验原理实验原理苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在成一种橙红色化合物，在1010100g100g范围内其颜范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在色深浅与糖的含量成正比，且在485nm485nm波长下有波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，基本不受蛋白质存在的影方法简单，灵敏度高，基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定响，并且产生的颜色稳定160min160min以上。以上。操作步骤操作步骤 1 1标准曲线的制作标准曲线的制作 按顺序向试管内加入按顺序向试管内加入1ml 9%1ml 9%苯酚溶液，摇匀，再苯酚溶液，摇匀，再从管液正面快速加入从管液正面快速加入5ml5ml浓硫酸，摇匀。比色液浓硫酸，摇匀。比色液总体积为总体积为8ml8ml，在恒温下放置，在恒温下放置30min30min，显色。然后，显色。然后以空白为参比，在以空白为参比，在485nm485nm波长下比色测定，以糖波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密为纵坐标，绘制标准曲线，含量为横坐标，光密为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。求出标准直线方程。2 2可溶性糖的提取可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪碎混匀，称取取0.100.100.30g0.30g，共，共3 3份，或干材料。分别放入份，或干材料。分别放入3 3支刻度试管中，加入支刻度试管中，加入5 510ml10ml蒸馏水，塑料薄膜蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取封口，于沸水中提取30min30min（提取（提取2 2次），提取液次），提取液过滤入过滤入25ml25ml容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。容至刻度。3 3测定测定 吸取吸取0.5ml0.5ml样品液于试管中（重复样品液于试管中（重复2 2次）次），加蒸馏水，加蒸馏水1.5ml1.5ml，同制作标准曲线的步骤，按，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚，浓硫酸溶液，显色并测定光顺序分别加入苯酚，浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算密度。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。测试样品中糖含量。2.5 蒽酮法1 1葡萄糖标准曲线的制作葡萄糖标准曲线的制作取取6 6支支20ml20ml具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同具寒试管，编号，按下表数据配制一系列不同浓度的标准葡萄糖溶液。浓度的标准葡萄糖溶液。在每管中均加入在每管中均加入0.5ml0.5ml蒽酮试剂，再缓慢地加入蒽酮试剂，再缓慢地加入5ml5ml浓浓H2SO4H2SO4，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸，摇匀后，打开试管塞，置沸水浴中煮沸1010分钟，分钟，取出冷却至室温，在取出冷却至室温，在620nm620nm波长下比色，测各管溶液的光波长下比色，测各管溶液的光密度值（密度值（ODOD），以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度值），以标准葡萄糖含量为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。为纵坐标，作出标准曲线。糖含量测定糖含量测定2.2.用移液管吸收用移液管吸收1ml1ml提取液于提取液于20ml20ml具塞刻度试管中，加具塞刻度试管中，加1ml1ml水和水和0.5ml0.5ml蒽酮试剂。再缓慢加入蒽酮试剂。再缓慢加入5ml5ml浓浓H2SO4H2SO4（注意：（注意：浓硫酸遇水会产生大量的热！），盖上试管塞后，轻轻浓硫酸遇水会产生大量的热！），盖上试管塞后，轻轻摇匀，再置沸水浴中摇匀，再置沸水浴中1010分钟（比色空白用分钟（比色空白用2ml2ml蒸馏水与蒸馏水与0.5ml0.5ml蒽酮试剂混合，并一同于沸水浴保温蒽酮试剂混合，并一同于沸水浴保温1010分钟）。冷分钟）。冷却至室温后，在波长却至室温后，在波长620nm620nm下比色，记录光密度值。查标下比色，记录光密度值。查标准曲线上得知对应的葡萄糖含量（准曲线上得知对应的葡萄糖含量（gg）。）。1.4邻甲苯胺法测定血糖 葡萄糖在热的醋酸溶液中，与邻甲苯胺缩合成雪夫氏碱葡萄糖在热的醋酸溶液中，与邻甲苯胺缩合成雪夫氏碱(Schiff base)(Schiff base)。雪夫氏碱呈兰绿色，其最高吸收峰为雪夫氏碱呈兰绿色，其最高吸收峰为620nm620nm波长，颜色深浅与葡萄糖量成正比，和标准液比较波长，颜色深浅与葡萄糖量成正比，和标准液比较求得其量。求得其量。本法不需要除去蛋白质，邻甲苯胺试剂只与醛糖显色，本法不需要除去蛋白质，邻甲苯胺试剂只与醛糖显色，血液中其他还原性物质基本上无影响。血液中其他还原性物质基本上无影响。邻甲苯胺试剂与葡萄糖显色的深浅及其稳定性与试剂中邻甲苯胺试剂与葡萄糖显色的深浅及其稳定性与试剂中邻甲苯胺浓度、冰醋酸浓度、加热时间有关。此法显色邻甲苯胺浓度、冰醋酸浓度、加热时间有关。此法显色稳定，稳定，2424小时内无变化。如将加热时间缩短，生成颜色小时内无变化。如将加热时间缩短，生成颜色容易消褪容易消褪 1.5 3，5-二硝基水杨酸法 实验原理实验原理单单糖糖都都是是还还原原糖糖，均均可可以以利利用用其其还还原原性性进进行行定定量量，但但是是双双糖糖和和多多糖糖等等则则不不一一定定就就是是还还原原糖糖，利利用用糖糖的的溶溶解解度度不不同同可可以以把把还还原原糖糖和和非非还还原原糖糖分分离离开开，然然后后利利用用多多糖糖的的酸酸水水解解，使使之之转转化化为为有有还还原原性性的的单单糖糖，从从而而可可以以使使多多糖糖也也可以利用还原性进行定量。可以利用还原性进行定量。3 3，5 5二二硝硝基基水水杨杨酸酸和和还还原原糖糖共共热热后后，被被还还原原成成棕棕色色的的化化合合物物，颜颜色色的的深深浅浅在在一一定定范范围围内内和和还还原原糖糖的的含含量量成成线线性性关关系系，在在540nm540nm处处进进行行比比色色测测定定，求求出出还还原原糖糖的的量量，进进而求出总糖的含量。而求出总糖的含量。操作(1)(1)样品中还原糖的提取：称取甘薯粉样品中还原糖的提取：称取甘薯粉1.0g1.0g放入小烧杯放入小烧杯中，先加入少量水调成糊状，再加入约中，先加入少量水调成糊状，再加入约50mL50mL水摇匀，煮水摇匀，煮沸约数分钟，使还原糖浸出，然后转移至沸约数分钟，使还原糖浸出，然后转移至100mL100mL容量瓶中容量瓶中定容，经过滤的上清液用于还原糖的测定。定容，经过滤的上清液用于还原糖的测定。(2)(2)样品中总糖的水解和提取：称甘薯粉样品中总糖的水解和提取：称甘薯粉1.0g1.0g放入小烧杯放入小烧杯中，先加入中，先加入6mol/L 6mol/L HClHCl 10mL 10mL，水，水15mL15mL，搅匀后放入沸水，搅匀后放入沸水浴加热水解浴加热水解30min30min，冷却后用，冷却后用6 mol/L 6 mol/L NaOHNaOH调调pHpH到中性到中性（1 1滴酚酞试剂检测呈微红）然后转移至滴酚酞试剂检测呈微红）然后转移至100mL100mL容量瓶中容量瓶中定容，过滤后，取定容，过滤后，取10mL10mL上清液稀释至上清液稀释至100mL100mL即为稀释即为稀释10001000倍的总糖水解液。倍的总糖水解液。(3)(3)还原糖和总糖的测定：分别吸取上述还原糖溶液和总还原糖和总糖的测定：分别吸取上述还原糖溶液和总糖溶液水解液糖溶液水解液1mL1mL于试管中，以制作标准曲线相同的方法于试管中，以制作标准曲线相同的方法加入加入DNSDNS试剂试剂1mL1mL，沸水浴加热，沸水浴加热5min5min，取出冷却后再加入，取出冷却后再加入蒸馏水蒸馏水8mL8mL，摇匀，分光光度计，摇匀，分光光度计540nm540nm处测定吸光值。还处测定吸光值。还原糖和总糖各做原糖和总糖各做3 3个平行实验。个平行实验。根据测定的吸光值，在标准曲线上查出相应的还原糖含根据测定的吸光值，在标准曲线上查出相应的还原糖含量，并折算成样品中还原糖和总糖含量。量，并折算成样品中还原糖和总糖含量。第二节 蛋白的检测技术目前常用的有四种古老的经典方法目前常用的有四种古老的经典方法:凯式定氮法，凯式定氮法，缩脲法缩脲法(BiuretBiuret法法),),FolinFolin-酚试剂法酚试剂法(Lowry(Lowry法法)和紫外吸收法和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍使用另外还有一种近十年才普遍使用起来的新测定方法起来的新测定方法,考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法(Bradford(Bradford法法).).其中其中Bradford Bradford 法和法和 Lowry Lowry 法灵敏度高，比紫法灵敏度高，比紫外吸收法高外吸收法高10-2010-20倍倍,比比 BiuretBiuret 法高法高100100倍以上倍以上.凯氏定氮法比较复杂凯氏定氮法比较复杂,但较准确但较准确,往往以定氮法测往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质 2.1 凯氏定氮法 原理原理1.消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮机氮硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需约需30min至至1h，视样品的性质而定。，视样品的性质而定。2.加碱蒸馏：硫酸铵与加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓浓)作用生成作用生成(NH4)OH,加加热后生成热后生成NH3,通过蒸馏导入过量酸中和生成通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被而被吸收。吸收。3.滴定：用过量标准滴定：用过量标准HCl吸收吸收NH3，剩余的酸可用标准，剩余的酸可用标准NaOH滴定，由所用滴定，由所用HCl摩尔数减去滴定耗去的摩尔数减去滴定耗去的NaOH摩摩尔数，即为被吸收的尔数，即为被吸收的NH3摩尔数。此法为回滴法，采用摩尔数。此法为回滴法，采用甲基红卫指示剂。甲基红卫指示剂。HClNaOHNaCl+H2O本法适用于本法适用于0.22.0mg的氮量测定的氮量测定。1.1.热源热源 2.2.烧瓶烧瓶 3.3.玻璃管玻璃管 4.4.橡皮管橡皮管5 5玻璃玻璃杯杯 6.6.棒状玻塞棒状玻塞 7.7.反应室反应室 8.8.反应室外壳反应室外壳 9.9.夹子夹子 10.10.反应室中插管反应室中插管 11.11.冷凝管冷凝管 12.12.锥形锥形瓶瓶 13.13.石棉网石棉网图微量凯氏蒸馏装置示意图图微量凯氏蒸馏装置示意图 实验步骤一、样品处理一、样品处理称取牛血清白蛋白称取牛血清白蛋白50mg，加入，加入2个凯氏烧瓶中，另个凯氏烧瓶中，另2个凯个凯氏烧瓶为空白对照，不加样品。分别在每个凯氏烧瓶中氏烧瓶为空白对照，不加样品。分别在每个凯氏烧瓶中加入约加入约500mg硫酸钾硫酸铜混合物，再加硫酸钾硫酸铜混合物，再加5mL浓硫酸。浓硫酸。二、消化二、消化将以上将以上4个凯氏烧瓶置于通风橱中电炉上加热。在消化开个凯氏烧瓶置于通风橱中电炉上加热。在消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出完，硫酸开始分解并放出SO2白烟后，适当加强火力，白烟后，适当加强火力，继续消化继续消化,使瓶内液体微微沸腾，大约维持使瓶内液体微微沸腾，大约维持23h。待消。待消化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，化液变成褐色后，为了加速完成消化，可将烧瓶取下，稍冷，将稍冷，将30过氧化氢溶液过氧化氢溶液12滴加到烧瓶底部消化液滴加到烧瓶底部消化液中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿中，再继续消化，直到消化液由淡黄色变成透明淡蓝绿色，消化即告完成。冷却后将瓶中的消化液倒入色，消化即告完成。冷却后将瓶中的消化液倒入50mL容容量瓶中，并以蒸馏水洗涤烧瓶数次，将洗液并入容量瓶量瓶中，并以蒸馏水洗涤烧瓶数次，将洗液并入容量瓶中，定容备用。中，定容备用。三、蒸馏三、蒸馏1.蒸馏器的洗涤蒸馏器的洗涤蒸气发生器中盛有加有数滴蒸气发生器中盛有加有数滴H2SO4的蒸馏水和的蒸馏水和数粒沸石。加热后，产生的蒸汽经贮液管、反应数粒沸石。加热后，产生的蒸汽经贮液管、反应室至冷凝管，冷凝液体流入接受瓶。每次使用前，室至冷凝管，冷凝液体流入接受瓶。每次使用前，需用蒸汽洗涤需用蒸汽洗涤10分钟左右（此时可用一小烧杯承分钟左右（此时可用一小烧杯承接冷凝水）。将一只盛有接冷凝水）。将一只盛有5mL2硼酸液和硼酸液和12滴指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管滴指示剂的锥形瓶置于冷凝管下端，使冷凝管管口插入液体中，继续蒸馏口插入液体中，继续蒸馏12分钟，如硼酸液颜分钟，如硼酸液颜色不变，表明仪器已洗净。色不变，表明仪器已洗净。2.消化样品及空白的蒸馏消化样品及空白的蒸馏取取50mL锥形瓶数个，各加锥形瓶数个，各加25mL0.01M标准标准HCl和和12滴指示剂，用表面皿覆盖备用。滴指示剂，用表面皿覆盖备用。取取2mL稀释消化液，由小漏斗加入反应室。将一个装有稀释消化液，由小漏斗加入反应室。将一个装有0.01M标准标准HCl和指示剂的锥形瓶放在冷凝管下，使冷凝和指示剂的锥形瓶放在冷凝管下，使冷凝器管口下端浸没在液体内。器管口下端浸没在液体内。用小量筒量取用小量筒量取5mL10MNaOH溶液，倒入小漏斗，让溶液，倒入小漏斗，让NaOH溶液缓慢流入反应室。尚未完全尽时，加紧夹子，溶液缓慢流入反应室。尚未完全尽时，加紧夹子，向小漏斗加入约向小漏斗加入约5mL蒸馏水，同样缓缓放入反应室，并蒸馏水，同样缓缓放入反应室，并留少量水在漏斗内作水封。加热水蒸气发生器，沸腾后，留少量水在漏斗内作水封。加热水蒸气发生器，沸腾后，关闭收集器活塞。使蒸汽冲入蒸馏瓶内，反应生成的关闭收集器活塞。使蒸汽冲入蒸馏瓶内，反应生成的NH3逸出被吸收。待氨已蒸馏完全，移动锥形瓶使液面逸出被吸收。待氨已蒸馏完全，移动锥形瓶使液面离开冷凝管口约离开冷凝管口约1cm，并用少量蒸馏水冷凝管口。取下，并用少量蒸馏水冷凝管口。取下锥形瓶，以锥形瓶，以0.01MNaOH标准溶液滴定。记下所耗去的标准溶液滴定。记下所耗去的体积。体积。3.蒸馏后蒸馏器的洗涤蒸馏后蒸馏器的洗涤蒸馏完毕后，移取热源，夹紧蒸汽发生器和收集蒸馏完毕后，移取热源，夹紧蒸汽发生器和收集器间的橡皮管，此时由于收集器温度突然下降，器间的橡皮管，此时由于收集器温度突然下降，即可将反应室残液吸至收集器。即可将反应室残液吸至收集器。4.滴定滴定注意事项（1 1）必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，）必须仔细检查凯氏定氮仪的各个连接处，保证不漏气。保证不漏气。（2 2）凯氏定氮仪必须事先反复清洗，保证洁净。）凯氏定氮仪必须事先反复清洗，保证洁净。（3 3）小心加样，切勿使样品沾污口部、颈部。）小心加样，切勿使样品沾污口部、颈部。（4 4）消化时，须斜放凯氏烧瓶（）消化时，须斜放凯氏烧瓶（4545o o左右）。火左右）。火力先小后大，避免黑色消化物溅到瓶口、瓶颈壁力先小后大，避免黑色消化物溅到瓶口、瓶颈壁上。上。（5 5）蒸馏时，小心加入消化液。加样时最好将）蒸馏时，小心加入消化液。加样时最好将火力拧小或撤去。蒸馏时，切记火力不稳，否则火力拧小或撤去。蒸馏时，切记火力不稳，否则将发生倒吸现象。将发生倒吸现象。（6 6）蒸馏后应及时清洗定氮仪。）蒸馏后应及时清洗定氮仪。1.4 双缩脲试剂测定蛋白质含量实验原理实验原理具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反具有两个或两个以上肽键的化合物皆有双缩脲反应。在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂应。在碱性溶液中双缩脲与铜离子结合形成复杂的紫好色复合物。而蛋白质及多肽的肽键与双缩的紫好色复合物。而蛋白质及多肽的肽键与双缩脲的结构类似，也能与脲的结构类似，也能与Cu2+形成紫红色络合物，形成紫红色络合物，其最大光吸收在其最大光吸收在540nm处。其颜色深浅与蛋白质处。其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸的组成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适于成无关，该法测定蛋白质的浓度范围适于110mg/mL。双缩脲法常用于蛋白质的快速测。双缩脲法常用于蛋白质的快速测定。定。紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：操作方法一、制作标准曲线一、制作标准曲线取取1212支试管分成两组，按下表平行操作：支试管分成两组，按下表平行操作：012345标准蛋白液(mL)00.20.40.60.81.0蛋白浓度(mg/mL)02.04.06.08.010.0蒸馏水(mL)1.00.80.60.40.20.0双缩脲试剂(mL)4.04.04.04.04.04.0充分混匀后，室温下（2025）放置30minA540二、样品测定二、样品测定取取4 4支试管分成两组，按下表平行操作：支试管分成两组，按下表平行操作：01血清稀血清稀释释液液(mL)00.5蒸蒸馏馏水水(mL)1.00.5双双缩脲试剂缩脲试剂(mL)4.04.0充分混匀后，室温下（充分混匀后，室温下（2025）放置）放置30minA540注意事项（1 1）须于显色后）须于显色后30min30min内比色测定。各管由显色内比色测定。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。到比色的时间应尽可能一致。（2 2）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。澄清后离心，取上清液再测定。2.3 lowry 法（Folin酚法）实验原理实验原理FolinFolin酚试剂法最早是由酚试剂法最早是由LowryLowry确定的测定蛋白质浓度确定的测定蛋白质浓度的基本方法。以后在生物化学领域得到广泛的应用。此的基本方法。以后在生物化学领域得到广泛的应用。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即种试剂，即FolinFolin酚试剂，以增加显色量，从而提高了酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。检测蛋白质的灵敏度。这个方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺这个方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时较长，要严格控制操作时间，标准曲线也不是点是费时较长，要严格控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。凡干严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。凡干扰双缩脲反应的基团，如扰双缩脲反应的基团，如-CO-NH2,-CH2-NH2,CS-NH2-CO-NH2,-CH2-NH2,CS-NH2以以及及TrisTris缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰FolinFolin酚反应，而且对后者的影响还要大得多。此外，酚反应，而且对后者的影响还要大得多。此外，酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用。酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用。FolinFolin酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。乙试剂是由盐溶液起作用，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是定范围是25250g25250g蛋白质。蛋白质。注意事项(1)(1)FolinFolin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而FolinFolin酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜蛋白质溶液。当生成碱性的铜蛋白质溶液。当FolinFolin酚乙试酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏之前。原反应产生在磷钼酸磷钨酸试剂被破坏之前。(2)(2)血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。2.4 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 实验原理实验原理有些染料在一定的蛋白质浓度范围内，能和蛋白质定量结有些染料在一定的蛋白质浓度范围内，能和蛋白质定量结合。因此可以根据染料的深浅来判定蛋白质的含量。合。因此可以根据染料的深浅来判定蛋白质的含量。过去人们把蛋白质样品滴加到膜材料上，然后用染料染色，过去人们把蛋白质样品滴加到膜材料上，然后用染料染色，再将染了色的蛋白质斑点洗脱下来，测定其光吸收值，再将染了色的蛋白质斑点洗脱下来，测定其光吸收值，就可以确定蛋白质的含量。就可以确定蛋白质的含量。19761976年，年，M.M.BradfordM.M.Bradford发现考马斯亮蓝发现考马斯亮蓝GG250250（GoomassieGoomassie Brilliant Blue G Brilliant Blue G250250）与蛋白质结）与蛋白质结合后，它的光吸收峰会从合后，它的光吸收峰会从465nm465nm改变到改变到595nm595nm。因此，他。因此，他把染色液直接加到蛋白质溶液中。根据把染色液直接加到蛋白质溶液中。根据OD595OD595的变化就可的变化就可确定蛋白质溶液的浓度。本法的灵敏度很高，常量法可确定蛋白质溶液的浓度。本法的灵敏度很高，常量法可测定范围测定范围0.10.11.0mg/ml1.0mg/ml，微量法可测定范围为，微量法可测定范围为2 220ug/ml20ug/ml。本实验采用改良的方法，以达操作简易之目的。本实验采用改良的方法，以达操作简易之目的。考马斯亮蓝考马斯亮蓝G250G250具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，具有红色和蓝色两种色调。在酸性溶液中，其以游离存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结其以游离存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。合后变为蓝色。优缺点考马斯亮蓝染色法的突出优点是：考马斯亮蓝染色法的突出优点是：（1 1）灵敏度高，据估计比）灵敏度高，据估计比LowryLowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达可达1mg1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度白质染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比的变化比LowryLowry法要大的多。法要大的多。（2 2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要只需要5 5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2 2分钟分钟即可完成，其颜色可以在即可完成，其颜色可以在1 1小时内保持稳定，且在小时内保持稳定，且在5 5分钟至分钟至2020分钟之分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像LowryLowry法那样费时和严格法那样费时和严格地控制时间。地控制时间。（3 3）干扰物质少。如干扰）干扰物质少。如干扰LowryLowry法的法的K+K+、Na+Na+、Mg2+Mg2+离子、离子、TrisTris缓缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTAEDTA等均不干扰此测定法。等均不干扰此测定法。此法的缺点是：此法的缺点是：（1 1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用标准曲线时通常选用gg球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。差。（2 2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100Triton X-100、十二烷基硫酸钠（、十二烷基硫酸钠（SDSSDS）等。）等。操作方法（一）取配好的考马斯亮蓝染（一）取配好的考马斯亮蓝染色液用普通漏斗过滤，过滤好色液用普通漏斗过滤，过滤好了马上用，不能久置。了马上用，不能久置。（二）标准曲线制作（二）标准曲线制作取取7 7支试管，按照下列表格配支试管，按照下列