显微技术和显微镜.pptx

主要内容主要内容n n电子子显微微镜n n透射透射透射透射电电子子子子显显微微微微镜镜的的的的结结构及原理构及原理构及原理构及原理n n扫扫描描描描电电子子子子显显微微微微镜镜的的的的结结构及原理构及原理构及原理构及原理n n扫描隧道描隧道显微微镜的的结构及原理构及原理显微微镜的的发展展1光学光学显微微镜（17世世纪）2电子子显微微镜（1932年，年，1952年）年）3扫描隧道描隧道显微微镜（1981年）年）光学光学显微微镜的原理的原理光学光学显微微镜的的结构构 机械部分：镜座、机械部分：镜座、机械部分：镜座、机械部分：镜座、镜柱、镜臂、镜筒、调焦装镜柱、镜臂、镜筒、调焦装镜柱、镜臂、镜筒、调焦装镜柱、镜臂、镜筒、调焦装置、载物台（物镜转换器）置、载物台（物镜转换器）置、载物台（物镜转换器）置、载物台（物镜转换器）光学部分：目镜、光学部分：目镜、光学部分：目镜、光学部分：目镜、物镜、反光镜、聚光镜物镜、反光镜、聚光镜物镜、反光镜、聚光镜物镜、反光镜、聚光镜放大倍数放大倍数放大倍数放大倍数：目镜的放大倍数目镜的放大倍数目镜的放大倍数目镜的放大倍数物镜的物镜的物镜的物镜的放大倍数放大倍数放大倍数放大倍数显微微镜的基本概念的基本概念n n分辨率分辨率：能：能够把两个点分辨开的最小距离。把两个点分辨开的最小距离。n n放大倍数放大倍数：显微微镜经多次成像后最多次成像后最终所成像所成像的大小相的大小相对原来物体大小的比原来物体大小的比值。n n有效放大有效放大：对于某一于某一显微微镜来来说，在其分辨，在其分辨能力之内的能力之内的图像放大。此像放大。此时的的图像放大不失像放大不失图像表面的像表面的细节。n n无效放大无效放大：在：在显微微镜分辨能力以外的分辨能力以外的图像放像放大。只是放大了大。只是放大了图像像轮廓，不能放大和分辨廓，不能放大和分辨图像的表面像的表面细节。n n景深景深：又称焦点深度，指在要求成一副清：又称焦点深度，指在要求成一副清晰像的前提下，像平面不晰像的前提下，像平面不变，景物沿光，景物沿光轴前后移前后移动的距离。的距离。n n焦焦长：景物不：景物不动，像平面沿光，像平面沿光轴前后移前后移动的距离。的距离。电子子显微微镜 射射线线x射射线线紫紫外外光光红红外外光光微微波波无无线线电电波波10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm可可 见见 光光n加速加速电压与与电子波子波长n n加速加速加速加速电压电压（kVkV）电电子波子波子波子波长长（A A）加速加速加速加速电压电压（kVkV）电电子波子波子波子波长长（A A）n n 25 0.076 200 0.025n n 50 0.054 500 0.014n n 75 0.043 1000 0.0087n n 100 0.037 3000 0.0036加速电压一般加速电压一般在在50-100kv之间之间电子子显微微镜（EM）n n1932年，德国科学家年，德国科学家Max knoll和和Ernst Rusha 制成了世界上第一台制成了世界上第一台透射透射电子子显微微镜（transmission electron microscope,TEM).n n1952年，英国工程年，英国工程师charles Oatley 制造了第一制造了第一台台扫描描电子子显微微镜(scanning electron microscope,SEM).入射电子束入射电子束吸收电子吸收电子二次电子二次电子背散射电子背散射电子俄歇电子俄歇电子特征特征X射线射线透射电子透射电子透射电子透射电子（包含非弹性散射电子）（包含非弹性散射电子）（弹性散射电子）（弹性散射电子）样样 品品入射电子与样品相互作用入射电子与样品相互作用后，使样品原子较外层电后，使样品原子较外层电子（价带或导电电子）电子（价带或导电电子）电离产生的电子。仅在表面离产生的电子。仅在表面深度深度5nm-10nm时逸出时逸出TEM的工作原理的工作原理n n原理：原理：与光学与光学显微微镜相似，不同的是透射相似，不同的是透射电子子显微微镜用用电子束作子束作为光源，用光源，用电磁磁场作透作透镜。n n电子束子束投射到投射到样品品时，可随，可随组织构成成分构成成分的密度不同而的密度不同而发生相生相应的的电子散射，如子散射，如电子束投射到子束投射到质量大量大的的结构构时，电子被散射子被散射的多，因此投射到的多，因此投射到荧光屏上的光屏上的电子少子少而而呈呈暗像暗像，电子照片上子照片上则呈呈黑色黑色，称，称电子子密度密度高。高。反之，反之，则称称为电子密度低。子密度低。中性粒细胞中性粒细胞 （透射电镜）（透射电镜）黑白反差黑白反差结构影像结构影像影像较黑称影像较黑称电子密度高电子密度高反之称反之称电子密度低电子密度低 的的 结 构构n n照明系照明系统n n成像系成像系统n n真空系真空系统n n供供电系系统n n机械系机械系统n n观察察显示系示系统电子枪电子枪聚光镜聚光镜物镜物镜中间镜中间镜投影镜投影镜1.照明系照明系统n n照明系照明系统主要由主要由电子子枪和和聚光聚光镜组成。成。n n电子子枪是是发射射电子的照明光源。子的照明光源。n n聚光聚光镜是把是把电子子枪发射出来的射出来的电子会聚而子会聚而成的交叉点成的交叉点进一步会聚后照射到一步会聚后照射到样品上。品上。n n照明系照明系统的作用的作用就是提供一束亮度高、照就是提供一束亮度高、照明孔径角小、平行度好、束流明孔径角小、平行度好、束流稳定的照明定的照明源。源。电子子枪的的结构及工作原理构及工作原理图电子枪是电镜的电电子枪是电镜的电子发射源，其子发射源，其作用作用是形成电子束，并是形成电子束，并控制电子束的发射，控制电子束的发射，获得一高亮度和高获得一高亮度和高稳定度的照明电子稳定度的照明电子光源光源由阴极灯丝发射的电子，通过栅极上的小孔和电子枪交叉点，即电镜的实际电子源。形成射线电子束，经高电压加速后成为高速电子流奔向聚光镜。电子束在电子枪中是逐级加速的1）阴极）阴极n n又称灯又称灯丝，一般由，一般由0.080.18mm钨丝作成作成V或或Y形状。形状。2）控制极）控制极：调节电子的初速度、控制子的初速度、控制电子束流子束流大小及形状，工作大小及形状，工作电压比灯比灯丝负100500V。改。改变其其电位可改位可改变控制控制电子束的形状和子束的形状和发射射强度。度。3）阳极）阳极：加速从阴极加速从阴极发射出的射出的电子。一般接地。子。一般接地。n 阳极与阳极与栅极极为互相背相的两个互相背相的两个圆形筒，中形筒，中间有有一个小一个小圆孔，均用不孔，均用不锈钢加工制成。加工制成。聚光聚光镜n n由于由于电子之子之间的斥力和阳极小孔的的斥力和阳极小孔的发散作散作用，用，电子束穿子束穿过阳极后，逐阳极后，逐渐变粗，射到粗，射到试样上仍然上仍然过大。大。n n聚光聚光镜有增有增强电子束密度和再次将子束密度和再次将发散的散的电子会聚起来的作用。子会聚起来的作用。n n多多为磁透磁透镜，调节其其电流流控制照明光斑的控制照明光斑的大小，大小，使在不同的放大倍数下只照明使在不同的放大倍数下只照明样品品的被的被观察部分，减少察部分，减少样品不必要的加品不必要的加热和和污染。染。一般装置双聚光镜，第一聚光镜为一强透镜，一般装置双聚光镜，第一聚光镜为一强透镜，可把电子枪交叉点缩小到可把电子枪交叉点缩小到1um左右，第二聚左右，第二聚光镜为一弱透镜，可以把缩小的光斑放大到光镜为一弱透镜，可以把缩小的光斑放大到数微米并聚焦到样品上数微米并聚焦到样品上电 磁磁 透透 镜 的的 结 构构电子源电子源电子轨迹电子轨迹铜导线铜导线软铁壳软铁壳软铁壳软铁壳焦点焦点2.成像系成像系统n n由由电子透子透镜组成，是能使成，是能使电子束聚焦的装置。子束聚焦的装置。n n电子透子透镜是是电镜的核心部件，其工作方式是利的核心部件，其工作方式是利用复用复杂的的电极和极和线圈圈结构形成静构形成静电场和磁和磁场。n n电子透子透镜存在各种像差（存在各种像差（aberration），），这是是影响成像影响成像质量的主要因素。量的主要因素。n n电子透子透镜根据其作用又分根据其作用又分为物物镜、中、中间镜和投和投影影镜。（1）物）物镜n n成一次像。成一次像。n n决定透射决定透射电镜的分辨本的分辨本领，要求它有尽可，要求它有尽可能能高高的分辨本的分辨本领、足、足够高高的放大倍数和尽的放大倍数和尽可能可能小小的像差。的像差。n n通常采用通常采用强激磁，短焦距的物激磁，短焦距的物镜。n n放大倍数放大倍数较高，一般高，一般为100100300300倍。倍。n n目前高目前高质量物量物镜分辨率可达分辨率可达0.1nm0.1nm左右左右（2）中）中间镜n n成二次像。成二次像。n n弱激磁的弱激磁的长焦距焦距变倍透倍透镜，0 02020倍可倍可调。（3）投影）投影镜n n短焦距短焦距强磁透磁透镜，最后一，最后一级放大像，最放大像，最终显示到示到荧光屏上，称光屏上，称为三三级放大成像。放大成像。电子子显微微镜与光学与光学显微微镜的光路比的光路比较3.真空系真空系统由机械泵、油扩散泵由机械泵、油扩散泵或离子泵、联动控制或离子泵、联动控制阀门、真空排气管道、阀门、真空排气管道、空气过滤器和用于真空气过滤器和用于真空度指示的真空测量空度指示的真空测量规等组成。规等组成。4.供供电系系统n透射透射电镜需要两部分需要两部分电源：源：一是供一是供给电子子枪的高的高压部分，二是供部分，二是供给电磁透磁透镜的低的低压稳流流部分部分。n电源的源的稳定性是定性是电镜性能好坏的一个极性能好坏的一个极为重重要的要的标志。所以，志。所以，对供供电系系统的主要要求是的主要要求是产生生高高稳定的加速定的加速电压和各透和各透镜的激磁的激磁电流流。n近代近代仪器除了上述器除了上述电源部分外，尚有自源部分外，尚有自动操操作程序控制系作程序控制系统和数据和数据处理的理的计算机系算机系统。5.机械系机械系统n n包括包括电镜座、座、标本室本室、磁屏蔽外壳、磁屏蔽外壳、镜筒、筒、制冷系制冷系统和控制台等。和控制台等。n由于由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力子易散射或被物体吸收，故穿透力低，必低，必须制制备更薄的超薄切片（通常更薄的超薄切片（通常为50100nm）。）。主要包括取材、固定、包埋、切片、染色等步骤主要包括取材、固定、包埋、切片、染色等步骤超超薄薄切切片片技技术术厚度：厚度：50100nm1mm36.观察察记录系系统n n人眼无法人眼无法观测电子，子，TEM中的中的电子信息通子信息通过荧光屏和照相底版光屏和照相底版转换为可可观察察图像。像。硅的晶格排布硅的晶格排布应 用用n n在生物医学中主要用于在生物医学中主要用于观察察组织和和细胞内胞内的的亚显维结构、蛋白构、蛋白质、核酸等大分子、核酸等大分子的的形形态结构及病毒的形构及病毒的形态结构。构。n n是区是区别细胞凋亡与胞凋亡与细胞坏死的最可靠的胞坏死的最可靠的办法。法。扫描描电子子显微微镜(SEM)一、一、SEM的成像原理的成像原理电子枪发出电子束电子枪发出电子束电磁透镜聚焦形成电子探针电磁透镜聚焦形成电子探针激发样品产生激发样品产生二次电子二次电子二次电子二次电子偏转线圈使得电子束在样品表面逐点逐行扫描偏转线圈使得电子束在样品表面逐点逐行扫描二次电子探测器将电子信号转变成为光信号二次电子探测器将电子信号转变成为光信号光电倍增管形成二次电子脉冲信号光电倍增管形成二次电子脉冲信号视频放大器形成电压模拟视频放大器形成电压模拟信号在荧光屏显示图像信号在荧光屏显示图像或转换为数字信或转换为数字信号输入计算机号输入计算机光光镜、透射、透射电镜和和扫描描电镜的工作原理的工作原理图二次二次电子探子探测器的工作原理器的工作原理图 SEM电磁透镜电磁透镜HITACHI Model S-3000N样品台操作系统样品台操作系统CRT电子枪电子枪电子探头电子探头 样品室样品室电子光学系统电子光学系统：电子枪、电磁透镜电子枪、电磁透镜信号检测系统信号检测系统：二次电子探测器、光电倍增管二次电子探测器、光电倍增管图像显示和数据处理系统图像显示和数据处理系统：CRTCRT扫描系统扫描系统：偏转线圈、扫描波发生器偏转线圈、扫描波发生器真空系统真空系统：机械泵、油扩散泵、阀门等机械泵、油扩散泵、阀门等电源电源：高压电源、真空系统电源等高压电源、真空系统电源等SEM的基本的基本结构构扫描系描系统n扫描偏描偏转线圈（圈（电子束偏子束偏转器）器）随随电流流波形而波形而产生生变化磁化磁场，推，推动电子束偏子束偏转移移动，使，使电子探子探针在在样品上以一定的方式和品上以一定的方式和速度移速度移动n扫描信号描信号发生器生器 产生生扫描脉冲信号，同描脉冲信号，同步提供步提供给镜体和体和显示器中的示器中的扫描描线圈圈SEM的的应用用n n主要用来主要用来观查组织、细胞表面或断裂面的胞表面或断裂面的超微超微结构及构及较大的大的颗粒性粒性样品的表面形品的表面形态结构构 SEM TEM 最高分辨率最高分辨率 310nm 0.10.3nm放大率放大率 7200,000 100800,000 加速电压加速电压 130kv 20200kv成像原理成像原理 二次电子二次电子 透透射电子射电子样品大小样品大小 10mm25mm 1mm3 观察对象观察对象 表面形貌表面形貌 内部结构内部结构 制样方法制样方法 较易较易 复杂复杂操作维护操作维护 方便方便 复杂复杂SEM与与TEM的比的比较扫扫 描描 电电 镜镜 照照 片片 展展 示示注射针头的扫描电镜照片注射针头的扫描电镜照片扫扫 描描 电电 镜镜 照照 片片 展展 示示红血球红血球可以用计算机将黑可以用计算机将黑白照片处理成彩色白照片处理成彩色放大倍率范围广放大倍率范围广扫描电镜特点立体感强立体感强扫描隧道描隧道显微微镜（STM）量子理论中的隧道效应量子理论中的隧道效应 极细探针与研究物质作为两个极极细探针与研究物质作为两个极 隧道电流隧道电流STM的工作原理的工作原理STM的工作原理的工作原理利用量子力学中的利用量子力学中的隧道效隧道效应应，在样品与探针之间加，在样品与探针之间加一定（一定（1V1V左右）的电压，左右）的电压，当样品与针尖距离非常接当样品与针尖距离非常接近（小于近（小于1nm1nm）时，样品）时，样品和针尖之间将产生隧道电和针尖之间将产生隧道电流流隧道电流的大小和两极之间的距离呈指数关系隧道电流的大小和两极之间的距离呈指数关系STM的基本装置的基本装置工作过程：工作过程：利用探针针尖扫描样品，通过隧道利用探针针尖扫描样品，通过隧道电流获取信息，经计算机处理得到图象。电流获取信息，经计算机处理得到图象。STM 探探针针：金金属属丝丝经经化化学学腐腐蚀蚀，在在腐腐蚀蚀断断裂裂瞬瞬间间切切断断电电流流，获获得得尖尖峰峰，曲曲率率半半径径为为10nm10nm左左右。右。STM 针尖针尖STM的基本装置的基本装置扫描器检测电路输出样品运动轨迹STM的扫描模式的扫描模式特点：特点：扫描速度快，噪音减少，但不能用于扫描速度快，噪音减少，但不能用于 观察表面起伏大于观察表面起伏大于1nm 1nm 的样品。的样品。（1 1）恒高测量模式：）恒高测量模式：探针以不变高度在样品表面扫探针以不变高度在样品表面扫描，隧道电流随试件表面起伏描，隧道电流随试件表面起伏而变化，从而得到样品表面形而变化，从而得到样品表面形貌信息。貌信息。STM的扫描模式的扫描模式样品输出运动轨迹驱动电路扫描器检测电路控制器（2 2）恒电流测量模式：）恒电流测量模式：探探针针在在样样品品表表面面扫扫描描，使使用用反反馈馈电电路路驱驱动动探探针针，使使探探针针与与样样品品表表面面之之间间距距离离（隧隧道道间间隙隙）不不变变。此此时时探探针移动直接描绘了样品表面形貌。针移动直接描绘了样品表面形貌。特特点点：此此种种测测量量模模式式隧隧道道电电流流对对隧隧道道间间隙隙的的敏敏感感性性转转移移到到反反馈馈电电路路驱驱动动电电压压与与位位移移之之间间的的关关系系上上，避避免免了了非非线线性性，提提高高了了测测量量精精度度和和测测量量范范围围。适适用用于于观观察察表表面面形形貌貌起起伏伏较较大的样品。大的样品。STM的性能特点的性能特点 原子高分辨率原子高分辨率 实际空间测量实际空间测量 适应性强适应性强 可操作原子位移可操作原子位移 可进行单层局部研究可进行单层局部研究 局限性局限性STM的实际应用的实际应用STM 观察石墨原子观察石墨原子排列的三维图像排列的三维图像 19901990年，年，IBM公司的科学家展示了一项令世人瞠公司的科学家展示了一项令世人瞠目结舌的成果，他们在金属镍表面用目结舌的成果，他们在金属镍表面用STM操纵操纵3535个惰性气体氙原子组成个惰性气体氙原子组成“IBM”三个英文字母三个英文字母。STM的实际应用的实际应用超高超高压电子子显微微镜