《细胞与免疫学技术与原理》精讲.ppt

第二讲细胞培养技术二细胞培养技术二 动物细胞培养可以在同一时期、动物细胞培养可以在同一时期、相同条件、相似性状的条件下提相同条件、相似性状的条件下提供大量的实验样本，开展科学研供大量的实验样本，开展科学研究，相对耗资较少，因而成为生究，相对耗资较少，因而成为生物制品、单克隆抗体和基因工程物制品、单克隆抗体和基因工程制品生产的重要手段。制品生产的重要手段。第一节第一节动物细胞原代培养动物细胞原代培养概念：概念：从供体获得组织细胞从供体获得组织细胞为材料，进行首次培养，称为材料，进行首次培养，称为细胞的原代培养或称细胞为细胞的原代培养或称细胞的初代培养。的初代培养。原代培养的细胞特点：原代培养的细胞特点：（1 1）原始性）原始性（2 2）不均一性）不均一性 理理论论：各各种种动动物物和和人人体体内内所所有有组组织织都都可进行培养。可进行培养。实实际际：幼幼体体组组织织尤尤其其是是胚胚胎胎组组织织比比老老年年的的易易培培养养；分分化化程程度度底底的的组组织织比比分分化化程程度度高高的的易易生生长长；肿肿瘤瘤组组织织比比正正常常组织容易培养。组织容易培养。一、取一、取 材材一般要求：一般要求：无无特特定定的的要要求求时时，取取容容易易培培养养的的组组织织进进行行培培养养，成成功功率率高高。取取材材后后最最好好立立即即培培养养，因因故故不不能能培培养养时时，应应把把组组织织切切成成1cm1cm3 3左左右右的的小小块块，置置培培养养液液中中，44储储存存，存放时间不宜超过，存放时间不宜超过2424小时。小时。因为时间越长、组织块越大细胞因为时间越长、组织块越大细胞越易死亡。越易死亡。从体内取材时，应严格保持无菌，从体内取材时，应严格保持无菌，严防有害物污染，如化学药物、试剂、严防有害物污染，如化学药物、试剂、射线等。射线等。取组织时要作好记录，如动物、取组织时要作好记录，如动物、性别、年龄、部位、种类和疾病，以性别、年龄、部位、种类和疾病，以便与日后实验结果相比较。便与日后实验结果相比较。常用取材方法举例：常用取材方法举例：1 1、取体液、取体液 主要指取血液，血液是白细胞的主要指取血液，血液是白细胞的主要来源。有主要来源。有指尖取血指尖取血和和静脉取血静脉取血等等方法。方法。指尖取血指尖取血指尖取血指尖取血2 2、取人体皮肤或活检材料、取人体皮肤或活检材料 （1 1）皮肤用）皮肤用75%75%酒精消毒；酒精消毒；（2 2）用刮皮刀刮取表皮，以轻微渗血为界；）用刮皮刀刮取表皮，以轻微渗血为界；（3 3）包扎伤口，伤口好后不留疤痕。）包扎伤口，伤口好后不留疤痕。这种取皮方法的这种取皮方法的优点优点是表皮细胞多，培是表皮细胞多，培养容易成功。如取活检组织（小儿包皮）须养容易成功。如取活检组织（小儿包皮）须先准备含双抗的先准备含双抗的BSSBSS液送入手术间，手术后储液送入手术间，手术后储44冰箱。冰箱。3 3、取内脏和实体瘤、取内脏和实体瘤 内脏除消化道外基本是无菌内脏除消化道外基本是无菌的，要明确和熟悉所需组织的类的，要明确和熟悉所需组织的类型和部位。型和部位。实体瘤取材时要取肿瘤细胞实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域，要避开破溃、坏死丰富的区域，要避开破溃、坏死液化部分，以防污染。液化部分，以防污染。怀孕母鼠怀孕母鼠怀孕母鼠怀孕母鼠4 4、取鼠胚、取鼠胚17171717天的胚胎天的胚胎天的胚胎天的胚胎取取完完整整鼠鼠胚胚胎胎步步骤骤5 5、取各种动物材料、取各种动物材料 先准备好一瓶含双抗的无菌先准备好一瓶含双抗的无菌PBSPBS液，待处死动物后，迅速取出液，待处死动物后，迅速取出所需要的脏器组织，放入无菌所需要的脏器组织，放入无菌PBS PBS 液内，尽快将实验材料送入超净液内，尽快将实验材料送入超净工作台，进行细胞原代培养。工作台，进行细胞原代培养。从从体体内内取取出出的的各各种种组组织织均均由由众众多多的的细细胞胞和和纤纤维维成成分分组组成成，且且结结合合十十分分紧紧密密，为为获获取取大大量量生生长长良良好好的的细细胞胞，必必须须把把组组织织细细胞胞分分散散开开来来，使使细细胞胞解解离离出出来来；能能达达到到单单细细胞胞水水平平更更好好，同同时时并并不不使使细细胞胞受伤害。受伤害。二、组织分离方法二、组织分离方法 适适用用范范围围：血血液液、羊羊水水、腹腹水水和和胸胸水水等等细细胞胞悬液。悬液。方方法法：一一般般用用5005001000r/min1000r/min的的低低速速离离心心，如如果果离离心心速速度度过过大大和和时时间间太太长长，则则易易挤挤压压细细胞使之受损或死亡。胞使之受损或死亡。分分层层液液：分分层层液液根根据据细细胞胞比比重重不不同同，使使各各类类细细胞胞相相互互分分开开的的，红红细细胞胞比比重重为为1.0921.092，淋淋巴巴和和大大单单核核等等白白细细胞胞比比重重为为1.0701.070，分分层层液适用于分离血中淋巴细胞。液适用于分离血中淋巴细胞。1 1、离心分离法、离心分离法离心前离心前离心前离心前离心后离心后离心后离心后FicollFicollFicollFicoll分层液离心后外周血细胞示意图分层液离心后外周血细胞示意图分层液离心后外周血细胞示意图分层液离心后外周血细胞示意图2 2、机械分散法、机械分散法 适用范围：适用范围：某些软组织如脑、胚胎及一些某些软组织如脑、胚胎及一些肿瘤组织。肿瘤组织。组织消化法是在把组织经过切割处理后，组织消化法是在把组织经过切割处理后，再用生化手段进一步分散成细胞团或单个细再用生化手段进一步分散成细胞团或单个细胞然后加入培养液。胞然后加入培养液。制成细胞悬液制成细胞悬液，接种入，接种入培养容器中后，细胞容易生长增殖，如：培养容器中后，细胞容易生长增殖，如：3 3、消化分离法、消化分离法胰蛋白酶消化法胰蛋白酶消化法胶原酶消化法胶原酶消化法EDTAEDTA消化法消化法 优点：优点：组织和细胞刚刚离体，生物性组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，具有二倍体遗状尚未发生很大变化，具有二倍体遗传性状，供体来源充分、生物条件稳传性状，供体来源充分、生物条件稳定的情况下，在一定程度上能反映在定的情况下，在一定程度上能反映在体状态。体状态。三、细胞原代培养方法三、细胞原代培养方法 1 1组织块培养法组织块培养法怀孕母鼠怀孕母鼠怀孕母鼠怀孕母鼠17171717天的胚胎天的胚胎天的胚胎天的胚胎胚胎中取出的胚胎中取出的胚胎中取出的胚胎中取出的成体近端小肠成体近端小肠成体近端小肠成体近端小肠把粘膜切成小块把粘膜切成小块把粘膜切成小块把粘膜切成小块细胞培养板细胞培养板细胞培养板细胞培养板中贴壁培养中贴壁培养中贴壁培养中贴壁培养组织块间距组织块间距组织块间距组织块间距1 1 1 1厘米厘米厘米厘米取小鼠肠粘膜细胞贴壁培养取小鼠肠粘膜细胞贴壁培养组织块培养法示意图组织块培养法示意图 翻转培养瓶的翻转培养瓶的目的目的是为了使是为了使组织块微干涸，以利贴附和免从组织块微干涸，以利贴附和免从瓶壁脱落，但时间不易过长，超瓶壁脱落，但时间不易过长，超过过4 4小时以上可能对组织有不利小时以上可能对组织有不利影响。影响。2 2、消化细胞培养法、消化细胞培养法 单层培养的表皮细胞单层培养的表皮细胞单层细胞培养示意图单层细胞培养示意图 胰蛋白酶冷消化法胰蛋白酶冷消化法 胰蛋白酶热消化法胰蛋白酶热消化法 消化得到的细胞沉淀，用培养液消化得到的细胞沉淀，用培养液配制成细胞悬液，接种到培养瓶内水配制成细胞悬液，接种到培养瓶内水平放置，平放置，3737进行培养，每隔进行培养，每隔1 12 2天天换培养液一次，培养一定的时间后，换培养液一次，培养一定的时间后，细胞在瓶底可长成一单层。细胞在瓶底可长成一单层。单层培养的神经细胞（左）和内皮细胞（右）单层培养的神经细胞（左）和内皮细胞（右）单层细胞培养的好处：单层细胞培养的好处：（1 1）更换新鲜培养液比较容易，便于细胞）更换新鲜培养液比较容易，便于细胞从培养液摄取营养和排除代谢产物；从培养液摄取营养和排除代谢产物；（2 2）易于观察某些因子加到培养液内后的）易于观察某些因子加到培养液内后的作用，以及从培养液中减去某些因子后对细作用，以及从培养液中减去某些因子后对细胞生长的影响。胞生长的影响。（3 3）当细胞粘附在基底质上后，则更）当细胞粘附在基底质上后，则更容易表达某些产物；容易表达某些产物；（4 4）单层细胞培养更适用许多细胞系。）单层细胞培养更适用许多细胞系。（5 5）适合大量细胞培养。）适合大量细胞培养。第二节第二节动物细胞传代培养动物细胞传代培养 原代培养过程中要不断更换新原代培养过程中要不断更换新鲜培养液以维持细胞的生长。待细鲜培养液以维持细胞的生长。待细胞生长到一定的限度时会胞生长到一定的限度时会产生接触产生接触抑制，抑制，需要对细胞进行再培养。需要对细胞进行再培养。概念：概念：由原代培养的细胞经消化由原代培养的细胞经消化分离后，从培养瓶中取出，配制成分离后，从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为细胞上的培养瓶中继续培养，称为细胞传代培养或再培养。传代培养或再培养。传代培养形成的细胞群称传代培养形成的细胞群称细细胞系胞系。细胞系虽然比原代培养物。细胞系虽然比原代培养物的细胞组成均一得多了，但它仍的细胞组成均一得多了，但它仍不是单一细胞。必须在细胞系的不是单一细胞。必须在细胞系的基础上进行单细胞的克隆化、筛基础上进行单细胞的克隆化、筛选而形成选而形成细胞株细胞株。一、需要更换新鲜培养液的一、需要更换新鲜培养液的提示提示1 1、培养液的、培养液的pHpH值下降值下降2 2、细胞浓度、细胞浓度3 3、细胞类型、细胞类型4 4、细胞形态学、细胞形态学二、传代培养的确定二、传代培养的确定 1 1细细胞胞生生长长停停滞滞，继继而而细细胞胞出出现现脂脂肪肪滴滴、衰衰老老或或者者组组织织块块脱脱离离基基质质漂漂流在培养液中。流在培养液中。2 2正常细胞生长贴满瓶壁后，由于正常细胞生长贴满瓶壁后，由于正常细胞表面具有正常细胞表面具有接触抑制接触抑制，因而，因而细胞生长受抑制。细胞生长受抑制。3.3.肿肿瘤瘤细细胞胞生生长长可可形形成成多多层层细细胞胞。多多层层细细胞胞中中，在在低低层层部部位位的的细细胞胞与与培培养养液液不不能能直直接接触触，结结果果由由于于营营养养不不足足而而生生长长停停滞滞，甚甚至至细细胞胞呈呈片片状状脱脱离离瓶瓶底底而而漂漂浮浮在在培培养中。养中。三、传代培养的方法传代培养的方法1 1、单层细胞的传代培养、单层细胞的传代培养（1 1）轻轻震荡法）轻轻震荡法（2 2）用胰蛋白酶消化液处理）用胰蛋白酶消化液处理（3 3）用）用EDTAEDTA溶液溶液（4 4）机械刮削法）机械刮削法消化法传代培养步骤消化法传代培养步骤 悬浮细胞的传代培养，不需要解离悬浮细胞的传代培养，不需要解离细胞一步，可直接用离心法得到细胞，细胞一步，可直接用离心法得到细胞，然后将细胞悬于新鲜培养液内，计数，然后将细胞悬于新鲜培养液内，计数，分装培养瓶，再培养。分装培养瓶，再培养。2 2、悬浮细胞的传代培养、悬浮细胞的传代培养 原代培养所含的细胞类型多而杂，培养原代培养所含的细胞类型多而杂，培养初期细胞类型多种多样。随着培养时间的延初期细胞类型多种多样。随着培养时间的延长，有的细胞类型经过适应生长阶段而加速长，有的细胞类型经过适应生长阶段而加速繁殖生长；而另一些细胞，或者死亡，或者繁殖生长；而另一些细胞，或者死亡，或者经过逐步退化而至死亡。培养物的细胞类型经过逐步退化而至死亡。培养物的细胞类型由复杂逐步变为单一的或均匀的。由复杂逐步变为单一的或均匀的。四、细胞系的建立四、细胞系的建立 传代培养不仅仅是为了维持传代培养不仅仅是为了维持细胞不断地生长，而且使培养物细胞不断地生长，而且使培养物逐步演变为具有增殖能力、特征逐步演变为具有增殖能力、特征专一、类型均匀的培养细胞，称专一、类型均匀的培养细胞，称之为之为细胞系细胞系。“有限有限”细胞系：细胞系：寿命有限的细寿命有限的细胞系。这类细胞系大多经过有限的细胞系。这类细胞系大多经过有限的细胞代数后，一般经胞代数后，一般经20208080群体倍增后，群体倍增后，细胞退化或死亡，其寿命长短与细胞细胞退化或死亡，其寿命长短与细胞类型和培养条件有关。类型和培养条件有关。“无限无限”细胞系：细胞系：经过再培养传代经过再培养传代后，细胞发生转化，可连续培养和生后，细胞发生转化，可连续培养和生长，寿命变为长，寿命变为“无限无限”的，称谓连续的，称谓连续培养细胞系，或培养细胞系，或“无限无限”细胞系。细胞系。第三节第三节培养细胞的生物学特性培养细胞的生物学特性一、培养细胞的形态分类一、培养细胞的形态分类1 1、贴附型、贴附型 只依赖于贴附才能生长的细胞称只依赖于贴附才能生长的细胞称贴附性细胞或锚着依存性细胞。贴附性细胞或锚着依存性细胞。（1 1）成纤维型细胞）成纤维型细胞皮肤成纤维细胞（皮肤成纤维细胞（100 100 倍）倍）成纤维型细胞，细胞体呈梭形成纤维型细胞，细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出胞质向外伸出2 23 3个长短不同的突个长短不同的突起。细胞在生长时多呈放射状、火起。细胞在生长时多呈放射状、火焰状或旋涡状走行。在培养中的细焰状或旋涡状走行。在培养中的细胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆胞凡形态与成纤维细胞类似时，皆可称之为可称之为成纤维细胞成纤维细胞。（2 2）上皮型细胞）上皮型细胞培养的血管内皮细胞培养的血管内皮细胞3 3、游走型细胞、游走型细胞 游走型细胞在支持物上散在生长，游走型细胞在支持物上散在生长，一般不连接成片。细胞质经常伸出伪足一般不连接成片。细胞质经常伸出伪足或突起，呈活跃的游走或变形运动，速或突起，呈活跃的游走或变形运动，速度快而且不规则。此型细胞不很稳定，度快而且不规则。此型细胞不很稳定，有时亦难和其它型细胞相区别。在一定有时亦难和其它型细胞相区别。在一定条件下，由于细胞密度增大联接成片后，条件下，由于细胞密度增大联接成片后，可呈类似多角形。可呈类似多角形。（4 4）多形型细胞）多形型细胞 除上述三型贴附型细胞外，除上述三型贴附型细胞外，还有一些组织和细胞，如神经还有一些组织和细胞，如神经组织的细胞等，难以确定它们组织的细胞等，难以确定它们规律的形态，可统归入多形型规律的形态，可统归入多形型细胞。细胞。2 2、悬浮型、悬浮型 有的细胞在培养时不贴附有的细胞在培养时不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生于支持物上，而呈悬浮状态生长，如某些癌细胞和血液白细长，如某些癌细胞和血液白细胞可呈悬浮型。胞可呈悬浮型。细胞悬浮生长时，胞体为圆形，观察细胞悬浮生长时，胞体为圆形，观察时不如贴附型方便。但优点是细胞悬浮在时不如贴附型方便。但优点是细胞悬浮在培养液中生长，生存空间大，允许长时间培养液中生长，生存空间大，允许长时间生长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢生长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢等研究。等研究。二、培养细胞的生长和二、培养细胞的生长和增殖过程增殖过程 细胞在体外培养后，在一切条件细胞在体外培养后，在一切条件适宜的情况下，最主要的活动是生长适宜的情况下，最主要的活动是生长和增殖。和增殖。细胞生长：细胞生长：细胞体积增大。细胞体积增大。细胞增殖细胞增殖：细胞数量增多。细胞数量增多。1 1、培养细胞的生命周期、培养细胞的生命周期 组织培养细胞生命周期指细胞组织培养细胞生命周期指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致的死亡衰老基本相一致。进行正常细胞培养时，不论细进行正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致都经历以下胞全生存过程中，大致都经历以下三个阶段：三个阶段：v原代培养期原代培养期 v 传代期传代期 v 衰退期衰退期2 2、培养细胞的一代生存期、培养细胞的一代生存期 细胞细胞“一代一代”仅指从细胞接种仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，如某到分离再培养时的一段时间，如某一细胞系为第一细胞系为第153153代细胞，即指该细代细胞，即指该细胞系已传代胞系已传代153153次。它与细胞世代或次。它与细胞世代或倍增一代不同；倍增一代不同；细胞世代细胞世代是指细胞是指细胞的生命周期。而在细胞的一代中，的生命周期。而在细胞的一代中，细胞能倍增细胞能倍增5 56 6次。次。细胞传一代，一般要经过以下细胞传一代，一般要经过以下三个阶段：三个阶段：v 潜伏期潜伏期v 指数增长期指数增长期v 停滞期停滞期培养细胞的生长曲线培养细胞的生长曲线 3 3、细胞周期、细胞周期 一个细胞周期是从一次细胞分裂一个细胞周期是从一次细胞分裂结束开始，经过物质积累过程，直到结束开始，经过物质积累过程，直到下一次细胞分裂结束为止，这种细胞下一次细胞分裂结束为止，这种细胞物质积累和细胞分裂的循环过程，称物质积累和细胞分裂的循环过程，称为为细胞周期细胞周期。细胞周期分为细胞间期和细胞分细胞周期分为细胞间期和细胞分裂期两个阶段。裂期两个阶段。4.4.细胞系的生长过程细胞系的生长过程 细胞系在培养中能够存活时间的细胞系在培养中能够存活时间的长短，主要取决于细胞来自何种动物长短，主要取决于细胞来自何种动物种族及年龄。不同的细胞体外培养可种族及年龄。不同的细胞体外培养可传代数不同，当细胞发生遗传性改变，传代数不同，当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶习性转化时，细胞的如获永生性或恶习性转化时，细胞的生存期可能发生改变。生存期可能发生改变。人胚二倍体成纤维细胞培养，人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可在不冻存和反复传代条件下，可传传30305050代，相当于代，相当于150150300300个个细胞增殖周期，能维持细胞增殖周期，能维持1 1年左右的年左右的生存时间。生存时间。恒河猴恒河猴的皮肤成纤维细胞能的皮肤成纤维细胞能传传4040代；代；鸡鸡胚胎成纤维细胞最多胚胎成纤维细胞最多能传能传3030代；代；小鼠小鼠成纤维细胞只能成纤维细胞只能传传8 8代左右；如供体为成体或衰老代左右；如供体为成体或衰老个体，则生存时间更短；如培养个体，则生存时间更短；如培养的肝细胞或肾细胞，仅能传几代的肝细胞或肾细胞，仅能传几代或几十代。或几十代。体外培养条件可能延迟细体外培养条件可能延迟细胞衰老，寿命从胞衰老，寿命从5050代延至代延至150150代。当细胞发生遗传性改变，代。当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶习性转化时，如获永生性或恶习性转化时，细胞的生存期可能发生改变。细胞的生存期可能发生改变。第三章第三章培养细胞性状的检测与保存培养细胞性状的检测与保存 细胞在体外培养过程中需要每细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液的染、培养液的pHpH是否变酸、变黄是是否变酸、变黄是否需要更换等。否需要更换等。一、细胞常规检查观察的内容一、细胞常规检查观察的内容 1 1、肉眼观察、肉眼观察 2 2、显微镜观察、显微镜观察 3 3、离体活细胞染色观察、离体活细胞染色观察 (1)(1)中性红染色中性红染色 (2)(2)结晶紫染色结晶紫染色 (3)(3)台盼蓝染色台盼蓝染色 4 4、固定细胞观察法、固定细胞观察法 组组织织培培养养既既可可直直接接观观察察活活细细胞胞，也也可可进进行行固固定定制制成成永永久久标标本本观观察察。标标本本制制好好以以后后可可以以长长期期保保存存和和做做长长时时间间的观察、分析。的观察、分析。5 5、固定细胞染色观察法、固定细胞染色观察法 培培培培养养养养细细细细胞胞胞胞染染染染色色色色有有有有一一一一般般般般和和和和特特特特殊殊殊殊之之之之分分分分；一一一一般般般般染染染染色色色色为为为为观观观观察察察察细细细细胞胞胞胞一一一一般般般般形形形形态态态态之之之之用用用用，特特特特殊殊殊殊染染染染色色色色为为为为用用用用于于于于观观观观察细胞特殊成分的染色方法。察细胞特殊成分的染色方法。察细胞特殊成分的染色方法。察细胞特殊成分的染色方法。常用染色法：常用染色法：常用染色法：常用染色法：(1)Giemsa(1)Giemsa(1)Giemsa(1)Giemsa染色法染色法染色法染色法 (2)(2)(2)(2)苏木精苏木精苏木精苏木精-伊红（伊红（伊红（伊红（H.E.H.E.H.E.H.E.）染色法）染色法）染色法）染色法 (3)Feulgen(3)Feulgen(3)Feulgen(3)Feulgen染色法染色法染色法染色法 (DNA(DNA(DNA(DNA特异性染色特异性染色特异性染色特异性染色)(4)(4)(4)(4)吖啶橙染色荧光观察法吖啶橙染色荧光观察法吖啶橙染色荧光观察法吖啶橙染色荧光观察法 二、细胞增殖生长二、细胞增殖生长 细胞增殖生长率是判定细胞活力的重细胞增殖生长率是判定细胞活力的重要指标，有多种显示方法。要指标，有多种显示方法。常用方法：常用方法：1.1.细胞计数细胞计数 2.2.生长周期的检测生长周期的检测 3.3.细胞周期测定细胞周期测定 4.4.生长晕的测量生长晕的测量1.1.细胞计数细胞计数 用细胞计数法测定细胞生长动力学是用细胞计数法测定细胞生长动力学是目前采用的最普遍的方法。目前采用的最普遍的方法。计数方法：计数方法：血细胞计数板人工计数血细胞计数板人工计数 细胞计数器细胞计数器计数平均值计数平均值10104 4稀释倍数稀释倍数 =细胞数细胞数/ml/ml 计数中，如果细胞悬液的细胞浓度计数中，如果细胞悬液的细胞浓度过高，必须稀释后再计；如果细胞数太过高，必须稀释后再计；如果细胞数太少，可离心浓缩后再计。每个细胞悬液少，可离心浓缩后再计。每个细胞悬液至少滴样两次求平均值。至少滴样两次求平均值。2.2.生长周期、细胞周期的检测生长周期、细胞周期的检测 任何一个细胞系在接种培养过程任何一个细胞系在接种培养过程中均经过生长缓慢期、快速生长和最中均经过生长缓慢期、快速生长和最后维持稳定期的生长周期。掌握一个后维持稳定期的生长周期。掌握一个细胞系的生长周期，必须严格控制取细胞系的生长周期，必须严格控制取样、培养时间等培养条件。样、培养时间等培养条件。细胞周期细胞周期有丝分裂有丝分裂细胞系生长周期曲线细胞系生长周期曲线DT：倍增时间（doubling time）3 3、流式细胞仪检测细胞周期时相和、流式细胞仪检测细胞周期时相和DNADNA合成合成 近年来流式细胞仪的发展已成为近年来流式细胞仪的发展已成为检测细胞增殖周期的主要手段，可进行检测细胞增殖周期的主要手段，可进行多项检测，如细胞周期时相、多项检测，如细胞周期时相、DNADNA合成合成强度、持续时间等，已取代了应用同位强度、持续时间等，已取代了应用同位素等繁琐方法。特别是培养细胞非常适素等繁琐方法。特别是培养细胞非常适用于做流式细胞仪检测的对象，且程序用于做流式细胞仪检测的对象，且程序简单、快速、效果准确。简单、快速、效果准确。4.4.生长晕的测量生长晕的测量 外植块外周形成薄而透明的生长晕外植块外周形成薄而透明的生长晕时，表明培养物生长正常；取生长良时，表明培养物生长正常；取生长良好的培养物观察其生长情况。从起始好的培养物观察其生长情况。从起始培养后间隔一定时间，如培养培养后间隔一定时间，如培养2424小时小时和和4848小时，在显微镜下借用投影描画小时，在显微镜下借用投影描画仪将组织块大小和生长晕外周轮廓画仪将组织块大小和生长晕外周轮廓画在同一张纸上。在同一张纸上。成纤维母细胞生长晕绘图 中央中央E E为接种培为接种培养的外植块面积；养的外植块面积；A A为培养为培养6 6小时时的生小时时的生长晕面积；长晕面积；B B为培养为培养1212小时后的生长晕面小时后的生长晕面积；积；C C为培养为培养2424小时小时时的生长晕面积。时的生长晕面积。三、细胞培养的污染及控制三、细胞培养的污染及控制 污染是细胞培养的大敌。预防污染是细胞培养的大敌。预防和避免污染是细胞培养成功的关和避免污染是细胞培养成功的关键之一。键之一。(一一)细胞微生物污染的类型细胞微生物污染的类型 1.1.细菌污染细菌污染 2.2.真菌污染真菌污染 3.3.支原体污染支原体污染 4.4.病毒污染病毒污染 5.5.非同种细胞污染非同种细胞污染 （二）（二）污染来源及鉴别污染来源及鉴别 1.1.污染来源污染来源 （1 1）不洁的动物组织标本）不洁的动物组织标本 （2 2）空气）空气 （3 3）清洗消毒）清洗消毒 （4 4）操作）操作 2.2.污染的鉴别污染的鉴别 （1 1）细菌、真菌污染的检测）细菌、真菌污染的检测（2 2）支原体污染的检测）支原体污染的检测（三）三）污染的清除和预防污染的清除和预防 1.1.污染的清除污染的清除 （1 1）使用抗生素）使用抗生素 （2 2）加温处理）加温处理2.2.污染的预防污染的预防 （1 1）从物品、用品消毒灭菌着手）从物品、用品消毒灭菌着手 （2 2）从操作者做起）从操作者做起 （3 3）防止细胞交叉污染）防止细胞交叉污染 四、细胞的冻存与复苏技术四、细胞的冻存与复苏技术 一、细胞的冻存一、细胞的冻存 细胞在不加任何保护剂的情况细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成快形成冰晶冰晶，从而导致细胞死亡。，从而导致细胞死亡。采用采用甘油甘油或或二甲基亚砜二甲基亚砜(DMSO)作保作保护剂，这两种物质分子量小，溶解护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使度大，易穿透细胞，可以使冰点下冰点下降降，提高细胞膜对水的通透性，且，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。对细胞无明显毒性。慢速冷冻慢速冷冻方法又可使细胞方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，内的水分渗出细胞外，减少胞减少胞内形成冰结晶的机会，内形成冰结晶的机会，从而减从而减少冰晶对细胞的损伤。少冰晶对细胞的损伤。1 1、细胞冻存方法、细胞冻存方法（1 1）选择处于）选择处于对数生长期对数生长期的细胞，去细的细胞，去细胞培养液，胞培养液，PBSPBS清洗，清洗，0.25%0.25%胰蛋白酶胰蛋白酶消化。将细胞收集于离心管中离心。消化。将细胞收集于离心管中离心。离离心后弃上清液心后弃上清液，加含血清的培养基重悬，加含血清的培养基重悬细胞。细胞。（2 2）取少量细胞悬浮液计数细胞浓度及）取少量细胞悬浮液计数细胞浓度及冻前存活率。细胞浓度为冻前存活率。细胞浓度为1 1101010106 6/mL/mL之间。加入冻存管，约之间。加入冻存管，约1ml/1ml/管。管。（3 3）将冷冻管盖子盖紧，并标记好细胞）将冷冻管盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。细胞种类及代次、冻存支数）。（4 4）将冻存管置入）将冻存管置入44冰箱中冰箱中3030分钟，分钟，再移至再移至2020冰箱冰箱3030分钟，分钟，7070冰箱冰箱2 2小时或过夜，最后放入液氮罐内。小时或过夜，最后放入液氮罐内。2 2、注意事项、注意事项（1 1）要定期给液氮灌）要定期给液氮灌充液氮充液氮，以确，以确保液氮灌内有一定量的液氮。液氮温保液氮灌内有一定量的液氮。液氮温度达度达-196-196，使用时注意勿让液氮溅，使用时注意勿让液氮溅到皮肤上，以免引起冻伤。到皮肤上，以免引起冻伤。（2 2）细胞冻存液的配方有很多种：）细胞冻存液的配方有很多种：培养基：血清：培养基：血清：DMSO=DMSO=7:2:17:2:1或或8 8：1 1：1 1或或5 5：4 4：1 1。冻存细胞时也可直接用。冻存细胞时也可直接用血清：血清：DMSO=9:1DMSO=9:1，一般高浓度血清有，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，对原代培养的细助于维护细胞活力，对原代培养的细胞，以胞，以90%90%血清冻存更为有效，复苏血清冻存更为有效，复苏存活率在存活率在80%80%90%90%以上。以上。（3 3）细胞冻存在液氮中可以长期保）细胞冻存在液氮中可以长期保存，但为妥善起见，冻存半年后，存，但为妥善起见，冻存半年后，最好取出一支冻存细胞复苏培养，最好取出一支冻存细胞复苏培养，观察生长情况，然后再继续冻存。观察生长情况，然后再继续冻存。细胞在液氮中可长期冻存无限时间，细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力；而不会影响细胞活力；注：在注：在-80-80度只可保存数月度只可保存数月 二、二、细胞的复苏细胞的复苏1 1、细胞复苏的方法、细胞复苏的方法（1 1）自）自液液氮中取出冷冻管，氮中取出冷冻管，检查检查盖子是否盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。掉。（2 2）将取出的冷冻管，立即放入）将取出的冷冻管，立即放入3737水浴水浴中快速解冻，轻摇冷冻管使其在中快速解冻，轻摇冷冻管使其在1 1分钟内分钟内全部融化，以全部融化，以70%70%酒精擦拭保存管外部，酒精擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。移入无菌操作台内。（3 3）将解冻的细胞悬浮液取出移入）将解冻的细胞悬浮液取出移入含有含有5-10ml5-10ml培养基的离心管内，吹打培养基的离心管内，吹打均匀，离心均匀，离心5 5分钟。分钟。（4 4）移去上清液，加入新鲜培养基）移去上清液，加入新鲜培养基吹打均匀，放入培养瓶中置吹打均匀，放入培养瓶中置COCO2 2培养培养箱培养。箱培养。2 2、注意事项、注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要细胞速度要快快，可不时摇动冷冻管，使，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（之尽快通过最易受损的温度段（-5-500）。以保证细胞外结晶快速融化，避）。以保证细胞外结晶快速融化，避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。这样复苏的冻存细胞内结晶损伤细胞。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。胞存活率高，生长及形态良好。谢谢 谢！谢！