DB37∕T 3128.3-2020 Ⅰ群禽腺病毒感染诊断技术 第3部分：血清4型Ⅰ群禽腺病毒感染间接ELISA诊断技术.doc

ICS65.020.30B41DB37山东省地方标准DB37/T 3128.32020群禽腺病毒感染诊断技术第3部分：血清4型群禽腺病毒感染间接ELISA诊断技术Diagnostic techniques for fowl adenovirus group infectionPart 3：An indirect ELISA for detection of antibody against fowl adenovirus group serotype 42020-06-08发布2020-07-08实施山东省市场监督管理局 发布前言本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东农业大学。本标准主要起草人：刁有祥、唐熠、杨晶、王鸿志、陈浩、冯强、张吉、宋存鑫、李伟。群禽腺病毒感染诊断技术第3部分：血清4型群禽腺病毒感染间接ELISA诊断技术1 范围本标准规定了间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测鸡血清4型群禽腺病毒抗体的技术规范。本标准所规定间接酶联免疫吸附试验（ELISA）适用于鸡血清4型群禽腺病毒感染抗体的特异性检验。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法GB 19489实验室生物安全通用要求GB/T 27401实验室质量控制规范动物检疫3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1血清4型群禽腺病毒Fowl adenovirus group Serotype 4是引起鸡心包积水-肝炎综合征的病原，主要造成3周龄5周龄鸡突然死亡，并伴随有心包积水和肝炎。3.2一抗Primary antibodies第一抗体就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。本标准的一抗为经离心后分离后鸡的血清待检样品。3.3酶标二抗HRP-labeled secondary antibodies二抗是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白，同时用辣根过氧化物酶进行标记的抗体。本标准中的酶标二抗为兔抗鸡辣根过氧化物酶标记的IgG，其效价应在1:32以上。3.4血清标准品SPF鸡接种血清4型群禽腺病毒经PCR检测为阳性后，制备的血清为阳性血清；SPF鸡的血清作为标准阴性血清，PCR检测结果为阴性。4 实验室要求4.1 环境4.1.1 实验室符合GB 19489和GB/T 27401要求，实验室必须为生物安全级（BSL-2级）及以上实验室。4.1.2 生物样品应严格控制对环境的污染，试验结束后应将相关样品（血液）收集高压灭菌后，送有资质的医用垃圾处理公司做最终处理。4.2 人员操作人员应接受实验室生物安全、实验室质量管理和血清学实验室检测技术培训。熟悉生物样品处理以及熟悉间接ELISA检测结果的判断方法。4.3 仪器设备4.3.1 台式高速离心机（最大转速为15000 rpm）。4.3.2 酶标仪。4.3.3 微量移液器：最大量程分别为10 L、20 L、100 L、1000 L。4.3.4 聚苯乙烯板。4.3.5 水平振荡器。4.3.6 恒温培养箱。4.4 试剂或材料除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯，水符合GB/T 6682规定的一级水。4.4.1 阳性血清，SPF鸡接种血清4型I群禽腺病毒经PCR检测为阳性后，制备的血清。4.4.2 阴性血清，SPF鸡血清，PCR检测结果应为阴性。4.4.3 血清4型I群禽腺病毒抗原：经浓缩纯化灭活后的全病毒，浓度为4.68 mg/mL。4.4.4 酶标二抗：兔抗鸡辣根过氧化物酶标记的IgG，效价应在1:32以上。4.4.5 磷酸盐缓冲液（PBS），见附录A.1。4.4.6 包被液，见附录A.2。4.4.7 洗涤液，见附录A.3。4.4.8 样品稀释液（封闭液），见附录A.4。4.4.9 底物溶液，TMB底物显色液。4.4.10 终止液（浓度为2M），见附录A.5。5 样品5.1 样品的准备与处理5.1.1 待检禽血清样品，每份不少于200 L，无溶血。5.1.2 用样品稀释液4.4.8将被检血清样品稀释10倍（1:10，如10 L血清加入90 L稀释液中）。注意：不要稀释对照血清。5.1.3 确保每个样品换一个吸头，做好样品的标记。稀释的样品血清充分混匀后，加入包被孔。5.2 样品保存样品应尽快处理。5.3 操作步骤5.3.1 将试验试剂预温到20 25 。5.3.2 将全病毒抗原按照浓度为4.68 g/L用1碳酸盐缓冲液（pH9.6）稀释400倍，每孔100 L加入到96孔聚苯乙烯板中，37 孵育2 h后，继续4 孵育过夜。孵育后洗涤液洗5次，甩干板上残余液体。5.3.3 每孔加入200 L封闭液，37 温箱孵育1 h，用5.3.2方法洗板。5.3.4 在A1、A2孔各加100 L阴性血清对照，A3、A4孔各加100 L阳性血清对照。5.3.5 将100 L稀释好的待检血清加入其他各孔，混匀后，37 孵育1 h，用5.3.2方法洗板。5.3.6 酶标二抗用样品稀释液按1:1000倍稀释，每孔加入100 L，37 孵育1 h，用5.3.2方法洗板。5.3.7 每孔加入100 L TMB显色液，37 避光条件下孵育15 min。5.3.8 每孔加入50 L终止液，轻轻振荡，终止反应。5.3.9 将酶标板置于酶标仪中，于450 nm测定各孔样品的吸光值（OD），该操作需在30 min内完成。6 结果判定6.1 阴性对照OD均值=(ODA1+ODA2)/2；阳性对照OD均值=(ODA3+ODA4)/2。6.2 阳性对照平均值减去阴性对照平均值，其差必须大于0.40；阴性对照平均值必须小于等于0.36，试验条件成立，否则重复测定。6.3 阳性样品OD4500.40，待检血清为阳性，即已感染血清4型I群禽腺病毒。6.4 阴性样品OD4500.36，待检血清为阴性，即未感染血清4型I群禽腺病毒。6.5 可疑样品0.36OD4500.40，判为可疑，重复测定。AA附录A （规范性附录）ELISA试验用溶液的配制A.1 磷酸盐缓冲液（PBS，0.0 1mol/L pH 7.4）NaCl8.0 gKCl0.2 gKH2PO40.2 gNa2HPO412H2O0.2 g水加至1000 mLA.2 包被液（0.05 mol/L pH 9.6）Na2CO30.2756 gNaHCO30.6216 g水加至100 mLA.3 洗涤液PBS1000 mLTween-200.5 mLA.4 样品稀释液（封闭液）脱脂奶粉5.0 g洗涤液100 mLA.5 终止液（2M）H2SO4（98%）58 mL水442 mL_