固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定饮用水中的氨基酸污染物.pdf

环境污染与治理-88-固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定饮用水中的氨基酸污染物赵妮娜（四川省广元生态环境监测中心站，四川 广元 628017）摘要：氨基酸是水中重要的含氮有机物，已有研究表明，水中含氮消毒副产物的前体，其中一些具有细胞毒性和致癌性。因此，相关人员开发了一种固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）测定15种游离氨基酸（FAAs），并成功应用于饮用水源水样品的测试。研究结果表明：强阳离子交换固定固相萃取柱的萃取性能优于反相固相萃取柱，提取前确定水的最佳pH值为2.8，所以建议用SPE提取样品以消除基质效应。所开发的方法显示出良好的线性（R20.991），检测限低（LODs，0.010.27 nmol/L），在饮用水源水中的回收率为69.8%117.9%。关键词：固相萃取；液相色谱；串联质谱法；氨基酸；污染物中图分类号：TS5 文献标志码：A DOI：10.20025/ki.CN10-1679.2023-18-29Simultaneous Determination of Amino Acid Pollutants in Drinking Water by Solid Phase Extraction High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass SpectrometryZhao Nina(Guangyuan Ecological Environment Monitoring Center Station,Sichuan Province,Guangyuan 628017,China)Abstract:Amino acids are important nitrogen-containing organic compounds in water.Previous studies have shown that they are precursors of nitrogen-containing disinfection by-products in water,some of which have cytotoxicity and carcinogenicity.Therefore,a solid-phase extraction ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)method for the determination of 15 free amino acids(FAAs)was developed and successfully applied to the testing of drinking water samples.The research results indicate that the extraction performance of the strong cation exchange fi xed solid-phase extraction column is superior to that of the reverse phase solid-phase extraction column,the optimal water pH determined before extraction is 2.8,therefore,it is recommended to extract samples using SPE to eliminate matrix effects,the developed method exhibits good linearity(R20.991),low detection limits(LODs,0.010.27 nmol/L),and a recovery rate of 69.8%117.9%in drinking water sources.Key words:solid phase extraction;liquid chromatography;tandem mass spectrometry;amino acids;pollutant引言氨基酸（AAs）是地表水中有机氮的重要组成部分，占海水中溶解有机氮（DON）的25%1。地表水中的主要氨基酸在不同研究中有所不同，其中一些研究报告指出甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸是浓度相对较高的三种主要氨基酸。地表水中的氨基酸组合是游离氨基的45倍2。然而，肽键中涉及的氮最初不能用于反应，氯和蛋白质之间的反应可以分为两个步骤。首先，发生涉及反应性侧基的快速反应，产生三卤甲烷。其次，包括卤代乙腈在内的其他消毒副产物（DBP）主要是通过多肽主链的缓慢碱催化降解形成的3。然而，在典型的饮用水处理条件下，上述组合AAs的反应不太可能发生，所以在地表水中组合AAs浓度较高的情况，FAAs受到了更多的关注。大多数研究都是基于批量实验，其中FAAs的应用浓度可能远高于实际饮用水中的浓度。然而，我国每年要生产大量饮用水，到2020年这一数量将高达200多亿立方米。另外，我国也是一个经常出现饮用水气味问题的国家，而引起气味的化合物目前仍然未知。因此，从饮用水的安全角度看，充分了解饮用水中FAAs的浓度水平是相当重要的，而且相关研究也较少。基于此，本文主要研究通过SPE与UPLC-MS/MS联用测定饮用水源水中15种FAAs的痕量方法，并检测某地区采集的饮用水源水样品中15种FAAs的浓度水平。1材料与方法1.1化学品和试剂本试验选择了15种游离氨基酸（FAAs）作为目标化合物，包括丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸。每种FAA的纯度至少为99%。L-苏氨酸-2、3-d2和亮氨酸-d3作为内标，购自上海。甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）为HPLC级，购自Fisher Scientific（USA）。作者简介：赵妮娜（1987-），女，本科，工程师，研究方向：环境监测中水、土壤、空气中重金属及有机污染物的检测。环境污染与治理-89-氢氧化铵（NH3H2O，14 mol/L）、甲酸（纯度99%）和浓盐酸（32%，HCl）从Sigma-Aldrich（美国）获得。超纯水用于制备试剂级的化学品溶液。使用0.1 mol/L盐酸溶液分别制备15种FAA的单一标准储备溶液（1 mM）和L-苏氨酸-2、3-d2和亮氨酸-d3的标准储备溶液。1.2样品采集和制备水样品采集于四川省8个不同地区的饮用水源水样本。各水样的基本水质参数见表1。所有水样都经过pH调节至 23，用50%盐酸稀释，用纯水（v/v）稀释，并用0.45 m玻璃纤维过滤器在真空下过滤每个水样。所有水样均储存在 温度为30 的环境中。表1水质参数取水地区温度（）pH值总氮(mg/L)NH3-N(mg/L)A24.28.32.010.14B24.58.11.930.12C24.28.32.030.19D24.38.01.670.12E24.58.41.320.17F24.78.21.640.16G25.08.12.590.29H25.18.32.530.32本试验选择强阳离子交换（SCX）固相萃取柱和反相固定相柱。在pH值分别为2.8、4.5和6.5的条件下进行了两种不同类型固相萃取柱的回收率测试。研究发现，反相药筒中FAAs的回收率非常低。另一方面，强阳离子交换柱明显获得了更好的回收率，尤其是在pH值为2.8时。所以将每个水样的pH值调节至2.8，然后在真空下以2 mL/min的流速通过固相萃取柱滤筒，用9 mL乙酸溶液（pH=2.8）、4.5 mL甲醇和9 mL纯水，流速为2 mL/min，装水后，用含有4.5%的甲醇（pH=2.8），将固相萃取柱在真空下干燥30 min，再用8 mL含有5%氢氧化铵的MeOH溶液以2 mL/min的流速进行洗脱。在40 的温和氮气流下蒸发提取物，并用1 mL超纯水重新配制。最后，将提取的样品转移到1.5 mL琥珀色小瓶中，准备进行UPLC-MS/MS分析。1.3固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）利用UPLC-MS/MS进行分析时，使用LC-20ADXR液相色谱仪与配备ESI源的AB Sciex API 4000三重四级质谱仪。流动相A是含有0.2%甲酸的水，而流动相B是含有0.2%乙酸的MeOH/ACN（2：8；v/v）的混合溶液。梯度程序从5%B开始，在2.5 min内线性升至40%B，然后在3分钟内线性增至70%B，最后在0.5 min内升至90%B，同时平衡2 min。在梯度程序的最后阶段，流动相B在0.5 min内向初始条件的5%返回，并保持2 min。整个分离过程约为10.5 min。流动相流速设定为0.3 mL/min。柱温保持在35，进样体积为5.0 L。串联质谱（MS/MS）在ESI阳性模式下使用定时多反应监测器（MRM）进行。通过注入单一标准溶液和所有目标化合物的混合物来获得最佳的MS/MS条件。离子源温度为150.0，离子喷射电压为2 500 V，入口电势为10 V。氮气用作碰撞和去溶剂气体。碰撞压力、离子源1和离子源2气体的压力分别为6 psi、50 psi和50 psi。1.4研究方法本研究对所提出方法的日间和日内精密度、稳定性、回收率进行评价。基于中等浓度的纯标准溶液，在连续三天的三个时间点评估日间和日内精度。通过制备的样品浓度变化来测量各种FAA的稳定性。分别在0、6、12和24 h测试在室温下放置的相同浓度为100 nmol/L的五个水样。每种分析物的稳定性计算为不同时间点测得的浓度与0 h初始浓度的比值。2结果与讨论2.1高效液相色谱条件的优化首先，本试验研究了用两种不同类型的柱分离浓度为1 mol/L的纯标准品（图1），即ACQUITY UPLC BEH HILIC柱和ACQUITY UPLC BEH C18柱。结果表明，前一列出现峰值模式干扰，各FAA的响应值受到抑制。15个FAA的峰分离效果较差。相反，后一个柱在短时间内显示出相邻峰之间更好的分离，并且峰模式是平滑的，每个FAA的响应值更好，所以选择ACQUITY UPLC BEH C18柱作为分离柱。与阴性模式相比，阳性模式下的多重反应监测可以获得更高的灵敏度和更好的再现性。目标扫描时间设置为1 s。表2中总结了通过将标准纯溶液直接注入质谱仪获得的优化去簇电位、碰撞能量和碰撞退出电位，其中还包括15种FAA的前体和子离子4。表2UPLC-MS/MS条件和等电点类别构造前体离子（m/z）产量（m/z）DP（V）CE（eV）CXP（V）RT（min）pl丙氨酸9044.329167 G1.466.00甘氨酸7630.2382041.115.97异亮氨酸132.186.2441373.586.02亮氨酸132.186.2381564.695.98甲磕氨酸150.2104.2431492.475.74苯基丙氨酸166120.1461866.995.48脯氨酸11670.2422061.606.30205.2146.15025127.115.89色氨酸11872.1381562.115.96缬氨酸105.960261551.435.68丝氨酸12074361491.475.60苏氨酸156.2110.14820101.397.59组氨酸13488.1301471.472.77天冬氨酸182135.9391964.115.66酪氨酸14884.1492171.503.22谷氨酸135.189.3521481.02-亮氨酸-d357.30.97312450.97-环境污染与治理-90-2.2精度和稳定性本研究总结了天然水样中15种FAA的日内和日间精度以及制备后的稳定性，详见表3，日内和日间精密度分别为3.52%6.71%和3.34%7.23%。15种FAAs在饮用水源水中的稳定性在92%110%范围内，表明本研究所建立的方法在室温下可以稳定6、12和24 h，而且具有良好的灵敏度和重复性。本研究表明，当水样pH值低于3时只能使痕量污染物在水样中稳定48 h，所以所开发的方法显示出良好的线性（R20.991），而且检测限低（LODs，0.010.27 nmol/L）。表3精度和稳定性类别日内日间6 h12 h24 h甘氨酸(%)6.217.2398799131027丙氨酸(%)4.144.771056103410613缬氨酸(%)3.034.899212994967亮氨酸(%)4.093.879449241015异亮氨酸(%)4.834.8310239531063苯基丙氨酸(%)4.125.06101121004985色氨酸(%)6.695.03977946983酪氨酸(%)5.015.01101129999天冬氨酸(%)6.715.16964955984谷氨酸(%)4.994.9910351036993蛋氨酸(%)4.065.1010241052987丝氨酸(%)5.844.31954984935苏氨酸(%)3.653.9710079541033脯氨酸(%)5.726.31103129551025组氨酸(%)3.513.3498510469472.3样品提取的优化水样的pH值是影响固相萃取效果的一个重要因素，所以本实验研究了水样pH值分别为2.8、4.5和6.5时对回收性能的影响。如表4所示，当水样的pH值较低时，15种FAAs在超纯水中的回收率可以显著提高，而降低水样的pH值可以在不离解羧酸基团的情况下使氨基质子化，从而产生FAA的正电荷，进一步促进带负电荷的交换树脂和带正电荷的FAAs之间发生相互作用，可以进一步提高FAAs的回收率。尽管降低水样的pH值可以显著提高FAAs的回收率，但当水样的pH值进一步降低到2.8时，水中的一些基质也会被共吸附在SPE柱上，然后从柱上共洗脱，从而导致回收率降低。同时，当水样的pH值增加到中性时，许多FAA的损失可能达到80%。因此，提取前水样的最佳pH值应为2.8。本研究结果表明，优化的洗脱液是含有4.5%甲醇的4.5 mL的乙酸溶液，其pH值为2.8，在饮用水源水中的回收率为69.8%117.9%。表4水样回收率试验的准确性）类别pH=2.8pH=4.5pH=6.5甘氨酸(%)75151丙氨酸(%)72271缬氨酸(%)75241亮氨酸(%)813048异亮氨酸(%)832854苯基丙氨酸(%)792089色氨酸(%)751852酪氨酸(%)58101天冬氨酸(%)139651谷氨酸(%)135711蛋氨酸(%)65251丝氨酸(%)641711苏氨酸(%)73301脯氨酸(%)127771组氨酸(%)642213结论本研究建立了SPE结合UPLC-MS/MS测定15种FAA的痕量分析方法，并对其进行了优化和验证，结果表明：SPE不仅可以富集FAA，还可以消除基质干扰。该方法具有较好的效果，在RSDs低的饮用水中获得了69.8%117.9%的良好回收效率。参考文献：1谢文佳，孙晓霞，王前，等.基于固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定饮用水中14种抗生素J.轻工标准与质量，2021（5）：67-72.2赵晓亚，陈新艳，王晗，等.分散固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定猪肉中的10种利尿剂J.分析科学学报，2021，37（5）：643-648.3姚清华，李捷，柯秋璇，等.固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定银耳中的8种农药残留J.分析科学学报，2020，36（1）：106-110.4柯庆青，李诗言，周凡，等.基于通过型固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法同时测定水产品中的氯霉素和红霉素J.食品科学，2017，38（24）：241-246.