瓜蒌薤白白酒汤对脑缺血再灌注损伤大鼠内源性硫化氢水平的影响.pdf

基础研究中国民间疗法CHINAS NATUROPATHY,Aug.2023,Vol.31 No.15瓜萎白白酒汤对脑缺血再灌注损伤大鼠内源性硫化氢水平的影响刘玉龙,孙敏，刘科,刘玲玲,张鲁宁,颜贵明，卞海（安徽中医药大学，安徽合肥2 30 0 12)【摘要】目的：探讨瓜萎蕉白白酒汤对脑缺血再灌注损伤(CIRI)大鼠内源性硫化氢(H,S)的影响。方法：取40 只雄性SD大鼠，随机分为模型组、瓜萎蕴白白酒汤组、尼莫地平组及假手术组，每组10 只。模型组、瓜萎蕴白白酒汤组、尼莫地平组采取线栓法制备CIRI模型，假手术组仅结扎右侧颈总动脉和颈外动脉。造模成功后2 4h内灌胃，瓜萎蕴白白酒汤组给予瓜萎蕉白白酒汤灌胃（4.32 g/kg），尼莫地平组给予尼莫地平灌胃（10 mg/kg），假手术组与模型组给予等体积生理盐水灌胃（10 mL/kg），每日1次，连续3d。造模后2 4h后采用Longa5级评分法进行神经功能评分。分别于造模前、取材前称量体质量，应用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色检测脑梗死范围，应用苏木精-伊红(HE)染色观察脑组织形态学变化，应用紫外分光光度法检测缺血测脑组织、血清中H2S含量的变化。结果：神经功能评分结果显示，假手术组神经功能评分为0 分，与假手术组相比，其余3组大鼠神经功能评分均升高(P0.05)，表示造模成功。取材前与造模前体质量比率结果显示，与假手术组相比，其余3组大鼠体质量均减少(P0.05)；与模型组相比，瓜萎蕉白白酒汤组和尼莫地平组体质量均增加(P0.05)。T T C染色结果显示，与模型组相比，瓜萎蕉白白酒汤组和尼莫地平组脑梗死体积百分比均降低（P0.05）。H E染色结果显示，瓜萎白白酒汤组和尼莫地平组脑组织损伤程度较模型组明显减轻。与假手术组比较，其他3组大鼠缺血侧脑组织、血清中H2S含量均升高(P0.05)；与模型组比较，瓜萎蕴白白酒汤组和尼莫地平组缺血侧脑组织、血清中H,S含量均升高（P0.05）。结论：瓜萎蕴白白酒汤对CIRI大鼠具有保护作用，其部分机制可能与机体H2S合成增加相关。【关键词】瓜萎蕉白白酒汤；脑缺血再灌注损伤；硫化氢中图分类号：R255.2文献标识码：AD0l:10.19621/ki.11-3555/r.2023.1529脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion in-jury,CIRI)是缺血性脑卒中（ischemic stroke,IS)的共同特征和主要病理机制，指脑部组织细胞在遭受一定时间缺血后恢复血流，其脑组织结构和功能损伤程度迅速加剧的现象 1。瓜萎白白酒汤来源于汉代张仲景的金匮要略，该方由瓜萎、白和白酒3味中药组成，具有通阳散结、行气祛痰的功效。本课题组前期研究发现，瓜萎白白酒汤具有保护心肌缺血再灌注、硬膜下血肿大鼠模型抗凝血、改善缺血性脑卒中模型大鼠血液流变学等药理作用 2-41。基金项目：安徽省自然科学基金项目（KJ2017A302)；安徽中医药大学自然科学研究基金项目（2 0 16 ts014)通信作者：下海，E-mail:第一作者：刘玉龙，E-mail:98中国民间疗法2 0 2 3年8 月第31卷第15期硫化氢(HS)是一种无色但具有臭鸡蛋气味的有毒气体，近年来研究发现，H,S是体内除一氧化氮和一氧化碳之外的第3种气体信号分子，在中枢神经系统具有广泛的抗炎、抗氧化应激、抗内质网应激、抗凋亡等生理功能 5。基于此，本研究主要探讨瓜萎白白酒汤对CIRI模型大鼠的脑保护作用及对脑组织和血清中H2S含量的影响。1材料和方法1.1试剂和仪器瓜萎蕉白白酒汤：取全瓜萎2 4g、白12 g、白酒7 L（适量）浓缩至36 mL，含生药1 mg/mL,其中瓜萎、白均购自安徽中医药大学第一附属医院中药房，56 度红星二锅头酒（北京红星股份有限公司）。实验试剂：氯化三苯基四氮唑（TTC)染色剂（北京索莱宝科技有限公司，批号：G3005）；无基础研究中国民间疗法CHINAS NATUROPATHY,Aug.2023,Vol.31 No.15水三氯化铁（批号：C11823602）、三氯乙酸（批号：经状态进行评分，评分参照Longa 5级评分法。神经C12055998）、无水醋酸锌（批号：C11801346)均购自上功能正常，计0 分；对侧前爪伸展困难，计1分；轻微对海麦克林生化科技有限公司;对氨基二甲基苯胺盐（上侧转圈，计2 分；严重对侧转圈，计3分；不能自主行海源叶生物科技有限公司，批号：H30J12X139133）。走，计4分 7。由1名不知情实验员观察打分。实验仪器：6 0 10 型可见光紫外分光光度计（安捷伦科2.4取材给药3d后，用3.5%戊巴比妥麻醉大鼠，技上海有限公司）；OLYMPUSBX51正置显微镜（日腹主动脉取血后，迅速断头取脑，使用生理盐水清洗脑本奥林巴斯公司）;LI颈外动脉RM2235石蜡切片机、组织表面杂物，去除嗅脑、小脑、低位脑干，每组取5只TP1020全自动组织脱水机、LI颈外动脉EG1150H组放人一2 0 冰箱速冻30 min，用于TTC染色，后置于织包埋机均购自德国徕卡公司。4%多聚甲醛中固定；另外5只大鼠脑组织放人1.2实验动物取40 只雄性SD大鼠由安徽医科一8 0 冰箱，备用；血液常温静置30 min，30 0 0 r/mi n大学实验动物中心提供，体质量均为（2 2 0 土2 0)g，生产离心15min，吸取上清液放人一2 0 冰箱，备用。许可证号：SCXK（苏）2 0 17-0 0 0 3，于温度（2 3土2)、2.5检测指标及方法相对湿度45%55%环境下定时喂养，自由饮水。本(1)脑梗死范围的测定取出脑组织沿冠状均匀实验经安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准（动切5片，每片厚度2 mm，放置于37 TTC染色液中物伦理批准号：AHUCM-rats-2021047)。孵育2 0 min，每5min轻轻晃动染色液，染色结果为正2实验方法常组织红色，梗死组织则为白色。拍照后用Image-2.1大鼠CIRI模型造模与分组适应性喂养7 dProPlus6.0软件计算脑梗死面积，计算各个脑片脑后，将40 只大鼠随机分成假手术组、模型组、瓜萎白梗死体积及占大脑横切面体积百分比。白酒汤组、尼莫地平组，每组10 只。模型组、瓜萎白(2)脑组织病理形态学观察取4%多聚甲醛固白酒汤组、尼莫地平组参照改良线栓法 6 制备CIRI模定脑组织，常规方法石蜡包埋，切片，HE染色。40 0 倍型：用3.5%戊巴比妥麻醉大鼠，将大鼠固定在鼠板光学显微镜下观察脑组织的形态学改变。上，备皮。使用眼科剪做颈部正中纵向切口，先分离出(3)缺血侧脑组织和血清中H,S含量测定取冻右侧颈总动脉，再分离出颈外动脉和颈内动脉，避免迷存脑组织,用磷酸缓冲液(PBS)洗去表面血液,分离右走神经受损。结扎右侧颈总动脉近心端、颈外动脉，在后脑皮质，用冷藏磷酸钾缓冲液制备匀浆，备用；取冻颈总动脉下端穿线备用，用血管夹暂时夹闭颈内动脉，存血清室温解冻。采用去蛋白检测H2S的方法，按照用显微剪于颈总动脉剪一小口，插入0.2 8 5mm栓线，参考文献 8 中的方法依次操作，最后用紫外分光光度到达血管夹时，轻轻系紧预留颈总动脉处线，防止出计在波长6 7 0 nm检测混合溶液吸光度，依据HzS标血。松开血管夹，缓缓插人栓线（18 土2）mm，稍有顿准曲线计算缺血侧脑组织和血清中H,S浓度。感即可停止，固定栓线，体外预留栓线2 cm，缝合皮2.6统计学方法采用SPSS23.0统计软件处理数肤。脑缺血2 h后,不必再次麻醉和切开皮肤，体外轻据。计量资料以均数土标准差(元士s)表示，多组间差轻拔出预留线头1cm左右，即可形成大鼠缺血再灌注异比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD损伤。假手术组造模方法：小心分离颈总动脉、颈内动检验,P0.05为差异有统计学意义。脉和颈外动脉，结扎右侧颈总动脉和颈外动脉，切口3结果缝合。(1)取材前与造模前体质量比率、神经功能评分、2.2干预方式造模成功后2 4h进行灌胃处理，瓜脑梗死体积百分比比较神经功能评分结果显示，假萎白白酒汤组给予瓜萎白白酒汤灌胃（4.32 g/kg），手术组神经功能评分为0 分，与假手术组相比，其余尼莫地平组给予尼莫地平灌胃（10 mg/kg），假手术组3组大鼠神经功能评分均升高（P0.05），表示造模成与模型组灌胃等体积生理盐水（10 mL/kg），每日功。取材前与造模前体质量比率结果显示，与假手术1次，连续干预3d。组相比,其余3组大鼠体质量均减少(P0.05)；与模2.3神经功能损伤评分造模成功后2 4h对大鼠神型组相比，瓜萎白白酒汤组和尼莫地平组体质量均中国民间疗法2 0 2 3年8 月第31卷第15期99血清中硫化氢含量比较(umol/L,x土s）基础研究中国民间疗法CHINAS NATUROPATHY,Aug.2023,Vol.31 No.15增加(P0.05)。T T C 染色结果显示，与模型组相比，瓜萎白白酒汤组和尼莫地平组脑梗死体积百分比均降低（P0.05）。见表1、图1。表14组大鼠取材前与造模前体质量比率、神经功能评分和脑梗死体积百分比比较（x土s)取材前与造模前脑梗死体积组别体质量比率（n=10)假手术组1.000.04模型组0.610.024瓜萎蕉白白酒0.770.1344汤组尼莫地平组注：与假手术组比较，P0.05；与模型组比较，-P0.05。lcm假手术组模型组瓜萎白白酒汤组且尼莫地平组图14组大鼠氯化三苯基四氮唑染色结果(2)脑组织HE染色结果比较假手术组脑组织未见损伤，脑细胞数量较多，细胞间隙正常，排列紧密、有序，形态圆润，核仁居中；模型组脑组织损伤严重，脑细胞数量减少，排列疏松、杂乱，间质有水肿，胞体变性；瓜萎白白酒汤组和尼莫地平组脑组织损伤程度较模型组明显减轻，细胞数量增多，排列较有序。见图2。50um假手术组50pum瓜萎燕白白酒汤组图2 4组大鼠脑组织苏木精-伊红染色结果(40 0)100中国民间疗法2 0 2 3年8 月第31卷第15期(3)缺血侧脑组织中H,S含量比较检测结果显示,与假手术组比较，其他3组大鼠缺血侧脑组织、血清中H2S含量均升高(P0.05)；与模型组比较，瓜萎白白酒汤组和尼莫地平组缺血侧脑组织、血清中H2S含量均升高(P0.05）。见表2。神经功能评分表2 4组大鼠缺血侧脑组织、(分，n-10)百分比（%，n=5)0025.622.762.600.97418.034.7342.800.7940.81 0.132.60 0.174模型组50um尼莫地平组组别假手术组模型组20.03 3.374瓜萎蕉白白酒汤组5尼莫地平组5注：与假手术组比较，P0.05；与模型组比较，P0.05。4讨论现代医学研究表明，缺血性脑卒中的损伤机制主要包括能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性、氧化应激损伤、炎症损伤、神经细胞调亡,均由脑缺血所引发，虽发生在不同时间点，但彼此相互联系 9-10 。临床上针对缺血性脑卒中的常用治疗方法包括溶栓、抗凝、抗血小板聚集、介人等11。脑卒中可归属于中医“中风”范畴,其发病率高、致残率高、死亡率高 12 。中医认为中风主要由阴阳失调，气血逆流、错乱所致。瓜萎白白酒汤出自张仲景的金匮要略，瓜萎清热解毒、利尿通淋，白温中散寒、化痰止咳,白酒活血化瘀、温经散寒的功效，常作为引经药以使方剂更好地发挥药效。现代药理学研究表明，瓜萎白白酒汤具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、改善血液流变、抗凝血、扩张血管、保护心肌缺血等作用 13,本研究结果显示，与模型组相比，瓜萎白白酒汤组和尼莫地平组体质量均增加，脑梗死体积百分比均减小(P0.05)，脑组织损伤程度均较模型组明显减50um轻,缺血侧脑组织、血清中H2 S含量均升高(P0.05），表明瓜萎白白酒汤对CIRI模型大鼠具有保护作用,其部分机制可能与机体H2S合成增加相关。内源性H2S具有多种生理调节功能，其保护机制主要包括抗炎、抗氧化应激、抗内质网应激、抗凋亡 5。SCHEID S等 14 研究结果表明,H2S可在短暂局灶性脑缺血模型中以剂量依赖的方式保护神经元免受缺氧损伤，减少局灶性脑缺血后梗死体积和缺血后脑水肿。JIANGZ等 15 研究发现,H,S可保护局灶性脑缺血再例数缺血侧脑组织中硫化氢含量517.790.87519.040.57420.70 0.7420.910.87血清中硫化氢含量16.661.9923.174.25429.69 3.9828.854.75-（收稿日期：2 0 2 2-0 5-0 4)基础研究中国民间疗法CHINAS NATUROPATHY,Aug.2023,Vol.31 No.15灌注后血脑屏障的完整性。SONG YJ等 16 实验证1oJLI Z,YULEI J,YAQING J,et al.Protective effects of tet-明,H2S可通过抗氧化、抗调亡和抗炎等方式保护ramethylpyrazine analogue Z-1l on cerebral ischemia reper-CIRI。此外,JANG H等 17 在CIRI大鼠模型中发现，fusion injuryJJ.Eur J Pharmacol,2019,844:156-164.11郭娟：早期静脉溶栓治疗急性缺血性脑卒中的疗效及对H2S可增加梗死周围区域的血管生成，提示其在脑卒凝血功能的影响J血栓与止血学，2 0 2 1，2 7（6）：中后再生恢复中具有潜在作用。WENJY等 18 研究960-961.证明，内源性和外源性H2S对于CIRI都具有保护神12陈星宇，于子乔，苏卓异，等急性缺血性卒中中西医结经作用。WOOCW等 19 研究表明，在CIRI造模前合诊治研究进展J吉林中医药，2 0 2 1，41（10)：预给予H,S能减轻脑细胞调亡，且离造模时间越短则1397-1400.神经保护作用越好。以上研究均表明H2S在缺血性13 刘义楠，刘明，瓜萎白汤的药理学研究进展 J中医药脑卒中疾病的发病过程中起着重要的保护作用。综上信息，2 0 17,34（2）：12 8-131.所述，瓜萎白白酒汤具有CIRI保护作用，可能与14 SCHEID S,GOELLER M,BAAR W,et al.HydrogenH2S合成增加相关。sulfide reduces ischemia and reperfusion injury in neuronalcells in a dose-and time-dependent mannerJ.Int J Mol参考文献Sci,2021,22(18):10099.15JJIANG Z,LI C,MANUEL M L,et al.Role of hydrogen1J SONG J R,ZHAO Y J,YU C,et al.DUSP14 rescuessulfide in early blood-brain barrier disruption followingcerebral ischemia/reperfusion(IR)injury by reducing in-transient focal cerebral ischemia JJ.PLoS One,2015,flammation and apoptosis via the activation of Nrf-2 J.10(2):e0117982.Biochem Biophys Res Commun,2019,509(3):713-721.16SONG Y J,SHI Y,CUI M M,et al.H,S attenuates injury2下海，王雅娟，黄顺，等瓜萎白白酒汤对大鼠心肌缺血after ischemic stroke by diminishing the assembly of CaMK再灌注损伤的保护作用J中成药，2 0 13，35（11）：II with ASK1-MKK3-p38 signaling moduleJ.Behav2347-2352.Brain Res,2020,384:112520.3下海，杨帆，张静，等，瓜萎白白酒汤对硬膜下血肿模型17JJANG H,OH M Y,KIM Y J,et al.Hydrogen sulfide treat-大鼠抗凝血实验 J.中成药，2 0 15，37（6)：1333-1335.ment induces angiogenesis after cerebral ischemia J.J4下海，王雅娟，李亚军，等瓜萎白白酒汤对缺血性脑卒Neurosci Res,2014,92(11):1520-1528.中模型大鼠血液流变学的影响 J.中药材，2 0 14,37（2)：18JWENJ Y,WANG M,LI Y N,et al.Vascular protection of303-306.hydrogen sulfide on cerebral ischemia/reperfusion injury in5JLOBOV G I,SOKOLOVA I B,GORSHKOVA O P,etratsJ.Front Neurol,2018,9:779.al.Contribution of hydrogen sulfide to dilation of rat19WOO C W,KWON J I,KIM K W,et al.The administrationcerebral arteries after ischemia/reperfusion injuryJJ.Bullof hydrogen sulphide prior to ischemic reperfusion has neu-Exp Biol Med,2020,168(5):597-601roprotective effects in an acute stroke model J.PLoS6缪培，张通，米海霞基于线栓法大鼠大脑中动脉闭塞的局One,2017,12(11):e0187910.灶性脑缺血模型的比较研究J中国康复理论与实践，2016,22(10):1190-1195.7JLONGA E Z,WEINSTEIN P R,CARLSON S,et al.Re-versible middle cerebral artery occlusionwithoutcraniectomy in ratsJ.Stroke,1989,20(1):84-91.8周方杰.硫化氢介导的大鼠大脑中动脉EDHF舒张反应及其在脑缺血再灌注过程中的变化 D合肥：安徽医科大学,2 0 11.9JSHI Y J,SUN L L,JI X,et al.Neuroprotective effects ofoleanolic acid against cerebral ischemia-reperfusion injuryinmiceJJ.Exp Neurol,2021,343:113785.欢迎投稿欢迎订阅本刊投稿网址：本刊联系电话：[phone]（编务）010-64405735（编辑）编辑部地址：北京市大兴区经济技术开发区科创十三街31号院二区8 号楼3层中国民间疗法2 0 2 3年8 月第31卷第15期101