光学适配体传感器检测赭曲霉毒素A的应用进展.pdf

984综述2023年第59 卷8PTCA(PARTB:CHEM.ANAL.)理化检验-化学分册D0I:10.11973/lhjy-hx202308022光学适配体传感器检测赭曲霉毒素A的应用进展邓莉，雷明馨1，潘小梅，张信凤？（1.成都农业科技职业学院，成都6 1110 0；2.成都理工大学材料与化学化工学院，成都6 10 0 59）摘要：赭曲霉毒素A(OTA)是由曲霉和青霉产生的一种真菌毒素，具有强烈的肝肾毒性，并有致畸、致癌的危害。OTA广泛存在于如小麦、玉米、咖啡、葡萄等谷物及食品中，严重危害人类健康。鉴于其危害的严重性和分布的广泛性，发展方便快捷、高灵敏度的OTA检测技术具有重要意义。目前检测OTA的方法有薄层色谱法、高效液相色谱法、荧光分析法及酶联免疫吸附测定法等，这些方法通常成本高、操作复杂且费时。光学适配体传感器发展迅速，在OTA检测领域表现出巨大优势，因此综述了荧光型（包括标记型和免标记型）、比色型、化学发光型以及其他类型（表面等离子体共振、侧向层析、表面增强拉曼散射型）光学适配体传感器检测OTA的原理、性能及在2011一2 0 2 3 年间的相关应用，并对方法面临的问题进行了总结以及未来的的发展趋势进行了展望（引用文献8 1篇）。关键词：光学适配体传感器；赭曲霉毒素A（O T A)中图分类号：0 6 57.3文献标志码：A文章编号：10 0 1-40 2 0（2 0 2 3)0 8-0 9 8 4-0 9赭曲霉毒素是由曲霉和青霉等真菌产生的一类会严重污染食品的真菌毒素 1-2 。赭曲霉毒素A(OTA)是该类真菌毒素中毒性最强、分布最广的一种，广泛存在于咖啡、葡萄酒、玉米、小麦、燕麦和蔬菜中 3 。虽然OTA在食品中的含量极少，但它能长期在人体和动物体中积累，不仅对肝脏、肾脏损害极大，还对神经系统和免疫系统具有毒性，可能致畸和致癌 4-5。鉴于OTA严重的危害性和分布的广泛性，2 0 17 年世界卫生组织已将它列入2 B类致癌物清单 6 。同时，相关原料和食品的OTA限量标准也被欧盟委员会制定并公布出来，如谷物原料中的限量为5.0 gkg-1，谷物类食品中的限量为3.0gkg-1，葡萄汁和葡萄酒中的限量为2.0 gkg-1等 7 检测OTA的传统方法包括仪器分析法和免疫分析法。仪器分析法主要有薄层色谱法（TLC)8收稿日期：2 0 2 2-12-0 3基金项目：成都农业科技职业学院科研项目（2 0 ZR201）；四川省科技厅应用基础重点项目（No.2018JY4066）作者简介：邓莉，助教，硕士，主要从事食品/农产品的分析检测工作*通信联系人。高效液相色谱法（HPLC)C9-11、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS)12-13、荧光分析法（FLD)及HPLC-FLD14-151等。免疫分析法包括酶联免疫吸附测定法（ELISA)16-18、免疫层析法（ICA)19-22和化学发光免疫分析法（CLIA)23等。这些传统的检测方法往往耗时、费力且成本较高，一定程度上限制了OTA检测技术的发展。因此，建立快速、简便、高灵敏度且高选择性的OTA检测方法具有重要意义。核酸适配体（简称适配体）是通过指数富集的配体系统进化（SELEX)技术筛选出来的一段对靶标物质具有高亲和力和高选择性的单链寡核苷酸 2 4-2 5，在一定条件下它能够与靶标物质结合，并折叠成特定的二级结构，进而灵敏地检测靶标物质 2 6 。适配体具有易获得、成本低、性质稳定、特异性和亲和力高等优点 2 7 ，作为一种新型的识别分子，适配体得到分子生物学、纳米材料、临床医学、环境监测等多学科研究者的广泛关注 2 8-2 。目前研究者已构建了诸如荧光型 3 0-3 、比色型 3 4-3 6 、化学发光（CL)型 3 7-3 8 和电化学型 3 9-41 等多种基于适配体的传感器并将其用于实际样品中OTA的检测。本工作综述了2 0 11一2 0 2 3 年间基于光学适配体传985邓莉，等：光学适配体传感器检测赭曲霉毒素A的应用进展理化检验-化学分册感检测 OTA的原理、性能及应用进展,以期为开发新的OTA检测方法提供参考。1荧光型适配体传感器荧光是指某些物质在受到特定波长的光激发时，吸收能量从基态跃迁到激发态，再返回基态时所发出的光 42 。通过荧光信号检测靶标物质的方法具有操作便捷、灵敏度高、分析时间短等特点，因此常被用于各种样品的检测 43-4。荧光型适配体传感器大致可分为标记型和免标记型两种。1.1标记型荧光共振能量转移（FRET）是供体（一个荧光基团)和受体(另一个荧光基团)距离合适时,能量由供体向受体转移的现象 45-48 。常用于标记型荧光型适配体传感器的标记物有有机荧光分子、荧光团和荧光纳米粒子 49-50 1等。LI等 51利用标记在OTA适配体上的羧基荧光素（FAM)作为能量供体，氧化石墨烯（GO）作为能量受体，吐温2 0(Tween 20）作为表面阻断剂，开发了一种基于FRET检测OTA的适配体传感器。当不存在OTA时,GO和修饰了FAM的适配体可通过静电驱动力和元-元堆叠作用结合在一起，GO和FAM间产生FRET,FAM的荧光被有效淬灭 52 。当存在OTA时，修饰有FAM的适配体从GO表面脱离，与OTA组成G-四链体，FAM荧光恢复。在此方法中，研究者们通过改变添加顺序和加入Tween20的方式有效解决了OTA在GO表面的非特异性吸附以及GO和适配体间过度吸附等问题。方法的线性范围为52 0 0 nmolL-1，相关系数为0.9 9 8 4，检出限为3.12 nmolL-1,OTA在红酒基质中的回收率为9 2.8%112.3%，在咖啡基质中的回收率为 8 6.0%110.8%。量子点（QDs)因具有量子产率高、抗光漂白性好等优点常被应用于标记型生物传感器 53-54。WANG等551利用DNA链修饰的氮掺杂碳点（c D NA-C D）及OTA适配体修饰的银纳米粒子（A p t-A g NPs)开发了一种标记型荧光型适配体传感器，用于快速检测农产品中的OTA。在该传感器中,Apt-AgNPs与cDNA-CD的距离通过OTA适配体与cDNA的碱基互补配对拉近，在FRET作用下，CD的荧光信号消失。在该系统中加入OTA后，由于OTA与AgNPs上的适配体的特异性结合，FRET作用被抑制，CD的荧光得以恢复。该方法可检测 10 5 0 0 0 nmolL-1内的 OTA,检出限为 8.7 nmol L-1。B I 等 7 将粒状氮化碳量子点(g-CNQDs)和羟基氧化钻（CoOOH)纳米片结合作为高效的能量供体-受体对,开发了一种新型的基于FRET的适配体传感器来检测OTA。在该传感器中,OTA适配体修饰的g-CNQDs(g-CNQDs-Apt)通过范德华力被组装在CoOOH纳米片上,FRET被启动,g-CNQDs 荧光淬灭。当存在 OTA 时,适配体与 OTA形成 G-四链体,与 CoOOH 纳米片的相互作用减弱，并最终与CoOOH纳米片分离，g-CNQDs-Apt和CoOOH纳米片间的FRET过程受到了阻碍，g-CNQDs的荧光恢复。WANG等 56 使用掺铁多孔碳（MPC)和适配体修饰的氮掺杂石墨烯量子点（NGQDs-Apt)设计了一个高灵敏的荧光型适配体传感器用于OTA的检测。在这种方法中，由于适配体和MPC之间的元-元相互作用，NGQDs-Apt被吸附在MPC表面，形成MPC-NGQDs-Apt复合物，导致NGQDs的荧光被灭。随后进行第一次磁分离去除溶液中游离（未吸附)的NGQDs-Apt，使背景信号降低至更低的水平。在加人OTA以后，由于OTA与适配体有强烈的相互作用，二者结合导致NGQDs-Apt从MPC表面解吸，从而使荧光恢复。为提高传感器的检测灵敏度，研究者们将核酸外切酶I(Exo I)添加到溶液中，该酶会分解适配体，使OTA重新释放到溶液中。游离的OTA与其他MPC-NGQDs-Apt复合物相互作用，促使更多的NGQDs-Apt释放到溶液中。如果溶液中不存在OTA，M PC-NG Q D s-A p t 复合物中的MPC会阻碍ExoI接近适配体，从而保护适配体不被分解。最后进行第二次磁分离，以减少残留的MPC和未被分解的适配体的干扰。该方法检测OTA的线性范围为10 50 0 0 nmolL-1,检出限为 2.2 8 nmol L-11.2免标记型免标记型检测法相较于标记型检测法具有操作简便、快捷以及能避免适配体亲和力和选择性降低等优点 57 ,因此也常被科研工作者运用于OTA的检测 58 LU等 59 1开发了一种用于检测OTA的新型无标记聚集诱导发光传感器。聚集诱导发光材料9，10-二苯乙烯基葱衍生物（DSAI)在游离态或单分子态时荧光微弱，但在聚集态时却呈现出强烈的荧光。当OTA存在时，它与适配体形成的G-四链体986邓莉，等：光学适配体传感器检测赭曲霉毒素A的应用进展理化检验-化学分册会阻碍ExoI分解适配体。在加人DSAI后，DSAI将聚集在适配体/OTA复合物的表面，产生强烈的荧光。当不存在OTA时，适配体被ExoI分解成核苷酸，即使在溶液中加人DSAI，也不能引起DSAI的聚集，产生的荧光信号很微弱。GUO等 6 0 建立了以单壁碳纳米角（SWCNHs）作为荧光淬灭剂，通过FRET淬灭染料SYBRGold荧光的免标记型适配体生物传感器。当不存在OTA时，适配体呈游离的单链DNA状态，SYBRGold与适配体结合产生荧光，SWCNHs对游离单链DNA有较强的吸附作用，二者产生FRET作用，使SYBRGold荧光淬灭。反之，当存在OTA时，适配体与OTA形成的G-四链体能够抵抗SWCNHs的吸附，使SYBRGold荧光得以保留，体系荧光信号较强。因此，可根据检测到的荧光信号的差别对OTA进行定量检测。该传感器可在550 0 gL-1内实现OTA的准确定量，检出限为2.3 gL-1。2比色型适配体传感器比色检测法是借助颜色对靶标物质进行可视化检测的一种方法，因其无需借助于昂贵复杂的检测仪器，并且具有方便快捷等优点而受到研究者们广泛青睐 6 1-6 4辣根过氧化物酶（HRP)在过氧化氢存在的情况下可以催化2 -联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS)和3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB)产生显著的颜色变化 6 5-6 6 ，因此该天然酶常被用在比色型生物传感器中 6 7-6 8 。CHEN等 6 9 设计了带有OTA适配体序列且该序列3 端标记有FAM的双链DNA(FAM-Apt-dsDNA)，当OTA存在时，它可与上述复合物杂交，保护3 -FAM序列不被ExoI分解。FAM-Apt-dsDNA通过生物素-链霉菌素相互作用被固定在磁性微球（MMB）上，而标记有HRP的FAM可通过抗原-抗体间的亲和力与MMB结合。磁分离后，在沉淀物中加人TMB和过氧化氢，通过显色和电化学法可定量检测“signal-on信号，而利用荧光法可在上清液中检测到“signal-off信号。该方法通过上清液荧光信号和沉淀物的电化学及可视化信号同时检测OTA，线性范围为1 10 0 mgL-1,检出限低至0.3 3 mgL-1。相较于天然酶，模拟酶具有更好的稳定性、更高的催化活性以及更低的成本，在传感、食品安全、环境处理等领域的应用趋势越来越广泛。HE等 7 0 利用碱性磷酸酶（ALP）、二氧化锰以及金纳米颗粒(AuNPs)构建了一种可用于检测OTA的比色型传感器。当OTA存在时，OTA与适配体结合，迫使标记有ALP的单链DNA被释放，ALP催化抗坏血酸-2-磷酸生成抗坏血酸（AA),AA将二氧化锰还原为Mn+，M n+导致AuNPs聚集。在上述过程中，可观察到溶液的明显颜色变化（棕红色-紫色-蓝色）。TIAN等 7 1 在上述工作的基础上，利用Ag+设计了一种可高分辨率检测OTA的比色法。该方法利用ALP和抗坏血酸-2-磷酸作用生成的AA还原Ag+，生成的Ag聚集在金纳米棒（AuNRs）表面形成Ag壳，进而引起AuNRs纵向局部表面等离子体共振峰的蓝移，并出现肉眼可见的颜色变化。随着OTA浓度水平的增加，溶液颜色从粉红色变为橙色、绿色、青色，最后变为紫红色。该方法可在12.52 0 0 0 0 n m o lL-1内实现OTA的半定量检测，检出限为9.0 nmolL-1。与报道的大多数检测OTA的比色法相比，上述方法虽然在灵敏度方面没有突出优势，但其高分辨的颜色变化可为直观的半定量检测OTA提供一个新的平台。DNA过氧化物酶是由一段能形成G-四链体的核酸序列和氯高铁血红素（Hemin)组成的复合物，该复合物能在过氧化氢存在下催化TMB和ABTS产生显色反应。YU等 7 2 设计了一个包含Hemin适配体和OTA适配体的cDNA（A G 4-O T A）。当OTA存在时，OTA与AG4-OTA结合，会阻止ExoI从AG4-OTA的3 端对适配体进行消化，Hemin适配体与Hemin结合，形成DNA过氧化物酶。该酶在过氧化氢存在下催化TMB产生蓝色的二亚胺衍生物（TMB2+）。T M B 2+可以腐蚀AuNRs，降低AuNRs的长宽比，从而产生颜色变化。采用肉眼观察时，本方法的检出限为3 0 nmolL-1；采用分光光度法检测时，本方法的检出限为10 nmolL-1。HE等 7 3 利用巧妙的DNA序列设计和DNA酶的组装成功开发了一种具有比色和荧光双模式的方法来检测OTA。在比色模式中，OTA适配体（AP9）被组装到一个具有特殊设计的DNA三螺旋开关中。当OTA存在时，AP9被诱导形成G-四链体并打开开关释放出一个腺嘌呤增强的G4序列，该序列能够形成具有卓越催化活性的G4-HeminDNA酶，该酶可催化ABTS显色，实现比色法检测。通过对DNA序列的巧妙设计，该方法可在不需要任何DNA扩增或纳米材料标记的情况下实现检测信987邓莉，等：光学适配体传感器检测赭曲霉毒素A的应用进展理化检验-化学分册号的放大。在比色模式下，该方法的线性范围为101.5X10g kg-1,检出限为 4 g kg-1。HAO 等 7 4 利用pH 显色试剂酚酞(PP)开发了一种快速、简单、灵敏检测OTA的比色型生物传感器。在合成该生物传感器时,利用 PP、G O、D NA 1制备 PP-GO-DNA1 复合物，利用四氧化三铁(Fe:O4)、G O、D NA 2 制备 Fe:O4-GO-DNA2复合物。OTA适配体与上述两种复合物通过部分互补配对组装成PP/GO-Apt-Fe:O4/GO复合物。当存在OTA时,OTA会与适配体结合，导致PP/GO-Apt-Fe:O4/GO复合物被分解，在磁分离后,PP-GO-DNA1复合物被留在上清液中,加人氢氧化钠，溶液呈红色。反之，当不存在OTA时,PP/GO-Apt-Fe:O4/GO复合物在磁分离后会被留在沉淀物中，在上清液中加人氢氧化钠，溶液呈无色。该方法的线性范围为10 2 50 gL-1,检出限为10 gL-1(10.0 g kg-1)。31化学发光型适配体传感器CL是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象。CL法操作简便、灵敏度高、线性范围宽，目前在食品安全、医学诊断、环境监测等领域应用广泛 7 5YANG等 7 6 设计了包含OTA适配体序列和G-四链体序列的探针DNA。当不存在OTA时，未折叠的OTA适配体会抑制分裂的G-四链体片段自我组装形成DNA酶。当存在OTA时，OTA会结合其适配体，促使分裂的G-四链体片段组装形成G-四链体,并与Hemin复合形成DNA酶，该酶会催化过氧化氢氧化鲁米诺（Luminol)产生CL信号。该方法的线性范围为0.10 2.0 0 nmolL-1，检出限为0.10 nmolL-1。A u NPs 因具备类过氧化物酶活性，因此也常被应用于CL型适配体传感器中。YAN等 7 7 利用磁性微球（MBs）作为载体，AuNPs作为催化剂开发了一种高灵敏检测OTA的CL型适配体传感器。在该方法中，修饰在MBs表面的OTA适配体可通过碱基互补配对与修饰在AuNPs表面的捕获探针DNA结合，使大量的AuNPs附着在MBs表面，磁分离后，附着在MBs表面的AuNPs会催化溴水氧化Luminol,产生强烈的CL信号。当OTA存在时，MBs表面的适配体会与OTA进行特异性结合，导致与AuNPs表面的捕获探针DNA的结合率降低，从而使MBs表面的AuNPs数量减少,CL 信号减弱。该方法可在0.012 0 g L-1 内定量检测 OTA,检出限为0.006 7 g:L-1 4其他光学适配体传感器4.1表面等离子体共振型适配体传感器表面等离子体共振（LSPR)技术因无需标记、操作简单、灵敏度高和成本相对较低引起了研究者们极大的关注 7 8 LEE等 7 9 开发了一种基于光纤的LSPR适配体传感器，用于检测实际样品中的OTA。在这个传感器中，5 端修饰有硫醇基团的OTA适配体通过金-硫醇键被固定在金纳米棒（GNRs）表面，而GNRs被固定在一个非包层纤维芯上。当该传感器被浸人到含有OTA的溶液中时,OTA与适配体形成的G-四链体会导致GNRs的LSPR峰红移。通过这种简单的浸入，即可避免其他霉菌毒素对OTA检测的干扰，该方法可在10 pmolL-1100nmolL-1内特异性定量检测OTA，并已成功应用于OTA加标葡萄汁样品的分析。4.2侧向层析型适配体传感器LIU等 8 0 通过聚酰胺-胺型高分子材料(PAMAM)将AuNPs与OTA适配体聚集成PAMAM-AuNPs-Apt复合物。当缺乏OTA时，该复合物与检测线（Tline）上的DNA1链，以及对照线上（Cline)的DNA2链杂交，Tline和Cline区域均出现红色的颜色信号。当存在OTA时，PAMAM-AuNPs-Apt复合物优先与OTA结合导致Tline上被DNA1链捕获的复合物减少，从而使Tline区域颜色减弱，而未被捕获的复合物仍然会与Cline上的DNA2链结合，Cline区域颜色不发生改变。根据Tline上颜色信号的变化，可实现OTA的定量检测。该传感器可在0.0 50.40 gL-1内实现OTA的定量检测，视觉检出限为0.40gL-1,与其他传统的侧流色谱试纸条相比，灵敏度提高了约5倍，测试时间可控制在15 min内。4.3表面增强拉曼散射型适配体传感器LIN等 8 1将有机染料四甲基罗丹明(TAMRA)与OTA适配体修饰到胶体金纳米颗粒(GNUs)表面形成TAMRA-Apt-GNUs复合物，并将与OTA适配体互补的DNA链修饰到上转换纳米粒子（UCNPs）上形成cDNA-UCNPs复合物。当988邓莉，等：光学适配体传感器检测赭曲霉毒素A的应用进展理化检验-化学分册不存在OTA时，适配体与其互补链杂交，TAMRA-Apt-GNUs复合物和cDNA-UCNPs复合物的距离被拉近，上转换发光（UCL）和表面增强拉曼散射(SERS)信号减弱；当存在OTA时，OTA会与适配体结合，TAMRA-Apt-GNUs复合物和cDNA-UC-NPs复合物距离不再被拉近，UCL信号恢复。此外，适配体构象可使TAMRA和GNUs间的距离缩短，产生强SERS信号。该方法可在0.0 150gL-1内准确定量OTA，检出限为8.6 ngL-1。与单一模式的传感器相比，该适配体传感器具有更高的检测灵活性，提高了检测便捷性和精度。5结语OTA作为一种污染范围广、危害程度大的典型真菌毒素，其检测技术的提升对食品安全检测具有重要意义。近年来，国家对食品安全检测工作越来越重视，真菌毒素的痕量检测工作已积累了大量的经验，但尚有下列工作需要大力开发：目前OTA的光学适配体传感检测大多在缓冲溶液中进行，在进行复杂的食品/农产品样品的现场检测时，需要开发能有效避免基质干扰的溶液体系，以实现OTA的快速、准确检测；OTA在食品中的含量极低，光学适配体传感检测的灵敏度还有待提升，以实现OTA的超痕量检测；目前报道的OTA适配体序列种类少、亲和力较低，应利用筛选技术找出特异性更强、亲和力更高的适配体。总之，基于光学适配体检测OTA的传感技术仍然面临着诸多问题，但随着纳米技术、筛选技术的不断发展，该领域将拥有更为广阔的应用天地。参考文献：1PAGKALI V,PETROU P S,SALAPATAS A,et al.Detection of ochratoxin A in beer samples with a label-free monolithically integrated 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