骨抑素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化和促进血管生成能力的影响.pdf

316骨抑素对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化和促进血管生成能力的影响付生龙，张军，刘俊朋，曹吉烈11济南市第五人民医院骨科，2 50 0 2 2 济南；2 空军军医大学空军特色医学中心骨科，10 0 142 北京通信作者：曹吉烈，E-mail：c a o j i l i e 2 7 2 7 16 3.c o m摘要】目的探讨骨抑素（osteostatin，O ST）对缺氧环境下骨髓间充质干细胞（bone marrowmesenchymal stemcells，BMSCs）增殖、成骨分化和促进血管生成能力的影响及其在骨缺损修复中的应用前景。方法从大鼠骨髓中分离培养BMSCs。BMSCs经OST处理后，在常氧（2 1%氧气）或缺氧（1%氧气）条件下培养。采用cellcountingkit-8（CCK-8）法检测细胞增殖，台盼蓝染色法检测细胞死亡率。通过碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，A LP）染色和茜素红S（a l i z a r i n r e d S，A RS）染色评价成骨分化。westernblot检测ALP、成骨转录因子（runt-relatedtranscriptionfactor2，RU NX 2）和骨钙素（osteocalcin，O CN）的蛋白水平。ELISA检测培养基中血管生成素1（angiopoietin-1，A n g-1）和血管内皮生长因子（vascular endothelialgrowthfactor，VEGF）浓度。小管形成试验评估促进血管生成能力。结果OST剂量依赖性增强大鼠BMSCs的增殖（F=4.89,P=0.006）。缺氧诱导下，BMSCs的增殖、小管形成量增加（F=28.98、7 6.6 8，P均 0.0 0 1），Ang-1和VEGF的浓度提高（F=183.7、58 5.6，P均 0.0 0 1）；ALP、RU NX 2 和OCN的蛋白水平降低（F=646.8、432.7、2 57.5，P均 0.0 0 1）。OST处理后，BMSCs增殖（常氧+OSTvs常氧，P均 0.0 0 1缺氧+OSTvs缺氧，P=0.005）、小管形成量（常氧+OSTvs常氧，P=0.002；缺氧+OSTvs缺氧，P=0.005）进一步增加，Ang-1浓度（常氧+OSTvs常氧，P0.001；缺氧+OSTvs缺氧，P0.001）和VEGF的浓度（常氧+OSTvs常氧，P0.001；缺氧+OSTvs缺氧，P0.001）进一步提高；ALP、RU NX 2 和OCN的蛋白水平升高（常氧+OSTvs常氧，P均 0.0 0 1，缺氧+OSTvs缺氧，P均 0.0 0 1）。结论OST可增强缺氧环境中BMSCs的增殖和成骨分化能力，促进血管生成。关键词骨抑素；骨髓间充质干细胞；成骨分化；血管生成；缺氧中图分类号 R681基金项目：山东省医药卫生科技发展计划项目（2 0 19WS065)DOI:10.3969/j.issn.2097-1753.2023.04.007Effects of ostestatin on proliferation,osteogenic differentiation and angiogenic ability of bonemarrow mesenchymal stem cellsFU Shenglong,ZHANGJun,LIU Junpeng,CAOJilieDepartment ofOrthopedics,JinanFifth PeoplesHospital,Jinan250022DepartmentofOrthopedics,AirForceMedical Center,AirForce Medical University,PLA,Beijing 100142,ChinaCorresponding author:CAO Jilie,E-mail:Abstract Objective To investigate the effect of osteostatin(OST)on the proliferation,osteogenic differentiation,and angiogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)under hypoxia,and to explore its applicability inbone defect repair.Methods BMSCs were isolated from bone marrow of rats before being treated with OST and culturedunder normoxic(21%oxygen)or hypoxic(1%oxygen)conditions.CCK-8 assay was used to evaluate cell proliferation,while trypan blue staining was adopted to detect cell mortality.Osteogenic differentiation was evaluated via alkalinephosphatase(ALP)staining and alizarin red S(ARS)staining.Levels of ALP,RUNX2(runt-related transcription factor2)and OCN(osteocalcin)were measured by Western blot.Concentrations of Ang-1(angiopoietin-l)and VEGF(vascularendothelial growth factor)in the medium were detected by ELISA.Angiogenesis was evaluated by tube formation assay.Results The proliferation of BMSCs in rats was enhanced in an OST dose-dependent manner(F=4.89,P=0.006).Underhypoxic inductions,the proliferation and tubule formation of BMSCs increased(F=28.98,76.68,both P0.001),so did空军航空医学2 0 2 3年0 8 月第40 卷第4期AviationMedicineofAirForce，Vo l.40，No.4，A u g u s t，2 0 2 3论著普通医学文献标识码 A文章编号 2 0 97-17 53（2 0 2 3)0 4-316-0 6空军航空医学2 0 2 3年0 8 月第40 卷第4期AviationMedicineofAirForce，Vo l.40，No.4，A u g u s t，2 0 2 3the concentrations of Ang-1 and VEGF(F-183.7,585.6,both P0.001).The protein levels of ALP,RUNX2,and OCNdecreased(F=646.8,432.7,257.5,all P0.001).After OST treatment,the proliferation(normoxia+OST vs normoxia,bothP0.001;hypoxia+OST vs hypoxia,P=0.005)and tubule formation of BMSCs(normoxia+OST vs normoxia,P=0.002;hypoxia+OST vs hypoxia,P=0.005)continued to increase.The concentrations of Ang-1(normoxia+OST vs normoxia,P0.001;hypoxia+OST vs hypoxia,P0.001)and VEGF(normoxia+OST vs normoxia,P0.001;hypoxia+OST vs hypoxia,P0.001)further increased.The protein levels of ALP,RUNX2,and OCN increased(normoxia+OST vs normoxia,both P0.001;hypoxia+OST vs hypoxia,both P0.001).Conclusion OST can enhance proliferation,osteogenic differentiationand angiogenesis of BMSCs under hypoxic conditions.Key words Osteostatin;Bone marrow mesenchymal stem cell;Osteogenic;Angiogenic;HypoxicFund program:Shandong Province Science and Technology Development Project(2019WS065)317肿瘤切除或严重创伤造成的骨缺损会产生缺氧环境，延长骨组织再生的时间，增加临床治疗的难度。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymalstemcells，BM SCs）具有促进多种组织再生和血管生成的能力2 ,可以通过增殖并分化为成骨细胞、分泌相关细胞外基质和活性因子为骨缺损修复提供活性来源和物质基础3，已被广泛应用于使用骨替代物的临床治疗中(4。骨抑素（osteostatin，O ST)是甲状旁腺激素相关蛋白（parathyroid hormone-related protein，PTHrP)C端的五肽片段（10 7-111）5,可以诱导骨组织合成代谢并激活血管内皮生长。本研究通过缺氧诱导和OST处理BMSCs，观察各组BMSCs的增殖、成骨分化能力，检测血管生成素-1（angiopoietin-l,Ang-1）和血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowth factor,VEGF）的表达以及内皮细胞小管形成量，探究OST对缺氧环境中BMSCs成骨分化和促进血管生成能力的影响，为OST在骨组织修复中的应用提供实验基础。1材料与方法1.1材料SPF级SD大鼠2 1只，雄性，8 12 周，体质量230250g，购置于山东大学实验动物中心动物合格证号：SYXK(鲁)2 0 150 0 11)。所有实验方案均获得山东大学第二医院动物实验伦理委员会批准（批准号：sddx-202108374），实验按照山东大学第二医院动物管理委员会指导原则进行。DMEM培养基、胎牛血清、台盼蓝染色液(Invitrogen公司，美国）；CCK-8细胞计数试剂盒、RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司，中国）；碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，A LP）染色试剂盒、茜素红S（a l i z a r i n r e d S，A RS）染色液、-MEM基础培养液、地塞米松、-甘油磷酸钠、L-抗坏血酸（SigmaAldrich公司，美国）；聚偏二氟乙烯(polyvinylidenedifluoride,PVDF）膜（Millipore公司，美国）；牛血清白蛋白（北京索莱宝科技有限公司，中国）；OST（人PTHLH多肽，ab42283）、a n t i-A LP抗体(ab224335)、a n t i-RU NX 2 抗体(ab192256)、a n t i-O CN抗体（ab93876）、a n t i-actin抗体（ab8226）、Ig G H&L二抗（ab6734）（A b c a m公司，美国）。1.2实验方法1.2.1大鼠BMSCs的分离培养大鼠麻醉后颈椎脱白处死，在无菌条件下取双侧股骨、胫骨，剥离肌肉。剪开胫骨和股骨干骺端，暴露骨髓腔，冲出骨髓，制成单细胞悬液，离心后取单个核细胞层。DMEM培养基（含10%FBS和青霉素、链霉素各10 0 U/ml）重悬细胞，置于37、5%CO,恒温培养箱中培养，每34d更换培养基，2周后传代培养。1.2.2OST处理大鼠BMSCs培养基重悬细胞，取3ml细胞悬液接种于6 孔板内，加人不同浓度0 ST（0、1、50、10 0、2 0 0 n m o l/L），37、5%CO 2、饱和湿度条件下培养96 h。1.2.3常氧/缺氧培养大鼠BMSCs培养基重悬细胞，取3ml细胞悬液接种于6 孔板内，CO,培养箱内过夜培养。细胞分组标记为：常氧(21%氧气）、常氧+OST、缺氧（1%氧气）、缺氧+OST对应孔加10 0 nmol/LOST，常氧或缺氧、37 条件下培养2 4h。1.2.4CCK-8法检测细胞增殖依次将各组细胞加入96 孔板，每孔接种50 0 0个细胞，设3个重复，终体积2 0 0 l。37、5%CO 2、饱和湿度条件下培养9 6 h后，每孔加人2 0 u1CCK-8溶液，37、5%CO2条件下孵育2 h。使用酶标仪在318OD450测定吸光值。1.2.5台盼蓝染色评估细胞死亡培养基重悬细胞，取7 l重悬细胞加人ll台盼蓝染色液（0.0 5%），室温染色10 min。在光学显微镜下，用血细胞计数板计数蓝色细胞和细胞总数，细胞死亡率=蓝色细胞数/细胞总数10 0%。1.2.6大鼠BMSCs成骨诱导培养基重悬细胞，取3ml细胞悬液接种于6 孔板内，CO,培养箱内过夜培养。第2 天更换成骨诱导培养基（含10%FBS,10 mol/L地塞米松,10 mmol/L-甘油磷酸钠，50 mol/LL-抗坏血酸的-MEM基础培养液）。细胞分组，对应加入10 0 nmol/LOST，在常氧或缺氧、37 条件下培养，每3d更换培养基。7 d后，每组取3孔进行ALP染色；14d后，每组取3孔进行ARS染色。1.2.7ALP染色自然晾干细胞样本，浸入固定液中2 5min，自然晾干。滴加基质液数滴，覆盖住已处理好的样本，37 避光孵育15min，立即滴加显色液A染色5min，水洗30 s；再滴加显色液B染色30 S，水洗30 s；加复染剂染色30 s，水洗30 s；显微镜下观察细胞染色情况，拍照保存。1.2.8ARS染色PBS洗涤细胞，4%甲醛固定15min，吸去固定液，PBS浸洗3次。1%茜素红染色液染色30 min，PBS冲洗2 次。在光学显微镜下观察钙沉积阳性细胞呈现桔红色，拍照保存。1.2.9Western blot分析样品用含PMSF的RIPA裂解液4裂解10 min，细胞刮下后静置10 min，离心取上清。样品与5上样缓冲液4:1混合，煮沸10 min。样品与marker分别上样，电泳后，转移至PVDF膜，浸入5%牛血清白蛋白封闭液室温震荡1h。加人稀释好的一抗抗体ALP、成骨转录因子(runt-related transcription factor2,RUNX2）、骨钙素（osteocalcin，O CN）、-actin均为1:10 0 0 ，4过夜。TBST洗膜3次，加人辣根过氧化物酶标记兔抗大鼠IgGH&L（1:10 0 0）室温孵育60min，洗膜3次，加入发光液曝光。用ImageJ软件分析结果。1.2.10ELISA检测分别设标准品孔、空白孔、待测样本孔。每孔分别加标准品或待测样本50 l，除空白孔外每孔立即加人酶标试剂50 l，37 孵育30 min，洗涤后拍干。每孔先后加人显色剂A、显色剂B各50 ul，37 避光显空军航空医学2 0 2 3年0 8 月第40 卷第4期AviationMedicineofAirForce，Vo l.40，No.4，A u g u s t，2 0 2 3色10 min。每孔加50 l终止液终止反应，用酶标仪在OD450测量光密度。1.2.11小管形成将内皮细胞接种到涂有含生长因子基底胶的48孔板中（2 10 4个/孔），与经过不同处理的BMSCs（空白对照、常氧、缺氧、常氧+OST、缺氧+OST）共孵育12h后，使用光学显微镜评估小管结构形成结果。1.3统计学处理采用GraphPadPrism7软件进行统计分析。所有数据以x土s表示。多组间比较采用单因素方差分析和Tukeys检验。以P0.668），表明浓度小于2 0 0 nmo1/L的OST对大鼠BMSCs没有明显的毒性。见表1。表1不同浓度OST对大鼠BMSCs增殖和死亡率的影响(xs)OST浓度/(nmol/L)细胞死亡率/%01.220.0311.230.05501.260.061001.330.052001.300.04F值4.89P值0.006注：OST骨抑素；BMSCs：骨髓间充质干细胞；CCK-8法检测不同浓度OST作用下BMSCs增殖情况；台盼蓝染色检测不同浓度OST暴露后BMSCs的死亡率。与0 nmol/L比较，p=0.011；与1nmol/L比较，p=0.023。2.2缺氧和OST对大鼠BMSCs增殖的影响缺氧组与对应的常氧组相比，BMSCs增殖增加（P=0.0 0 1）；O ST 处理组与对应的非OST处理组相比，BMSCs增殖均增加（缺氧+OST组vs缺氧组，P=0.005；常氧+OST组vs常氧组，P0.001）。见表2。表2 CCK-8法检测缺氧和OST对大鼠BMSCs增殖的影响(土s)组别P值常氧组1.080.05常氧+OST组1.250.04缺氧组1.22 0.03a缺氧+OST组1.330.056注：OST：骨抑素，BMSCs：骨髓间充质干细胞，与常氧组比较，P0.001，与缺氧组比较,P=0.0052.3缺氧和OST对大鼠BMSCs成骨分化的影响缺氧诱导降低了ALP染色和ARS染色强度，而OD450值OD450值3.410.033.800.053.600.064.010.05*3.79 0.04b0.590.668F值28.980.001空军航空医学2 0 2 3年0 8 月第40 卷第4期AviationMedicineofAirForce，Vo l.40，No.4，A u g u s t，2 0 2 3OST处理则显著提高染色强度（图1），表明OST处理可以恢复被缺氧抑制的BMSCs细胞成骨分化能力。贝张dTV常氧注：OST：骨抑素；BMSCs：骨髓间充质干细胞；ALP：碱性磷酸酶；ARS：茜素红S。图1不同染色方法缺氧和OST对BMSCs成骨分化的影响（40 0)2.4缺氧和OST对大鼠BMSCs成骨分化基因表达的影响缺氧诱导下，ALP、RU NX 2 和OCN的蛋白表达量均降低（F=646.8、432.7、2 57.5，P均 0.0 0 1），而OST处理可部分逆转这种抑制作用（P均 0.0 0 1）。见图2。AALPRUNX2OCN-actin常氧tOST注：OST：骨抑素；BMSCs：骨髓间充质干细胞，ALP：碱性磷酸酶；RUNX2：成骨转录因子，OCN：骨钙素；-action：-肌动蛋白。A：W e s t e r n b l o t 检测ALP(F=646.8,P0.001)、RU NX 2(F=432.7,P 0.0 0 1)和OPN(F=257.5,P0.001)）的蛋白表达水平。B：与同组常氧组比较，P0.001；与同组缺氧组比较,P0.001。图2 缺氧和OST对BMSCs成骨分化基因表达的影响2.5缺氧和OST对大鼠BMSCs血管生成因子分泌的影响与常氧组相比，缺氧组培养基中Ang-1和VEGF的浓度升高（F=187.3、58 5.6，P均 0.0 0 1），而OST处理组培养基中Ang-1和VEGF的浓度进一步提高（P均 0.0 0 1)。见图3。A500r3002001000常氧常氧+OST缺氧缺氧+OST分组注：OST：骨抑素；BMSCs：骨髓间充质干细胞，Ang-1：血管生成素l，VEG F：血管内皮生长因子。A：ELISA 法测定培养基中Ang-1的浓度（F=183.7，P0.001），B：ELI SA 法测定培养基中VEGF的浓度（F=585.6，P 0.0 0 1）；A 图中与常氧组比较，P0.001；与缺氧组比较，p0.001；B图中与常氧组比较，P0.001；与缺氧组比较，P0.001。图3缺氧和OST对大鼠BMSCs血管生成因子分泌的影响2.6缺氧和OST对大鼠BMSCs促进小管形成的影响内皮细胞与处理后的大鼠BMSCs共孵育12 h后,319光学显微镜观察评估毛细血管样结构的形成差异有统计学意义（F=76.68，P 0.0 0 1）；与常氧组比较，缺氧组内皮细胞小管结构形成量增加（7 58 3.0 0 42 8.51vs5705.50398.10，P.0 0 1），添加OST处理的组别中小管结构形成量进一步增加常氧+OST(7294.00469.51)vs常氧（57 0 5.50 398.10），P=0.002；缺氧+0 ST(9027.00567.10)vs缺氧（7 58 3.0 0 42 8.51)，P=0.005)。见图4。缺氧常氧+OST一B32第舒缺氧OST缺氧ba缺氧+OST一常氧一缺氧一常氧+OST一缺氧+OSTbb0ALP蛋白RUNX2蛋白OCN蛋白B80m20常氧常氧+OST缺氧缺氧+OST分组对照注：OST：骨抑素；BMSCs：骨髓间充质干细胞。缺氧组与常氧组比较，P0.001；缺氧+OST组与缺氧组比较，P=0.005；常氧+OST组与常氧组比较，P=0.002。图4缺氧和OST对大鼠BMSCs促进内皮细胞小管形成能力的影响3讨论疾病、创伤等原因引起的骨缺损严重影响患者健康7 ，利用间充质干细胞（marrowmesenchymalstemcells，M SC s）的成骨分化和促进血管生成能力开展的骨组织工程技术是目前临床治疗骨缺损的主要方法之一8 。然而，骨缺损导致的缺氧环境会抑制MSCs的作用，使治疗效果下降，给患者带来更多的痛苦和负担9。因此，研究缺氧抑制MSCs修复功能的机制，寻找解除抑制的方法有重大意义。BMSCs进入骨缺损部位发挥修复功能的过程主要包括自身增殖、成骨分化和诱导血管形成等部分，本研究对其分别开展研究，分析缺氧的影响，并探索骨抑素OST是否能够改善BMSCs受到的缺氧抑制。3.1缺氧环境会抑制骨修复有研究表明，当环境中的氧气浓度从2 1%变为1%时，MSCs的增殖受到抑制110-1。然而本研究结果显示，缺氧处理反而会增加BMSCs的增殖，尽管其中具体机制仍待研究，但可据此推测，缺氧抑制BMSCs骨修复功能的关键并非影响其增殖能力。在受到RUNX2、O SX 等外源因子刺激后，MSCs具有向骨组织等间充质组织成熟细胞类型分化的能力2 1。有研究表明，缺氧环境会导致成骨分化降低，其中RUNX2失活，ALP活性也会降低13-14。本研究的结果表明，缺氧会导致BMSCs成骨分化大幅度减弱，成骨分化相关基因的表达显著降低，这表明成骨分化是缺氧抑制BMSCs骨修复能力的关键环节。血管形成是骨组织再生的另一个关键过程15-16 ,，MSCs可常氧缺氧(400)常氧+OST缺氧+OST320以通过分泌血管生长因子等与内皮细胞相互作用，促进血管形成7 。而缺氧是在骨生长过程中启动血管形成的关键因素之一18 ,并且BMSCs在缺氧条件下的血管生成促进作用增强19。在本研究中，缺氧条件下BMSCs会分泌更多的血管生成因子Ang-1和VEGF，且经过缺氧诱导的BMSCs能够促进内皮细胞形成更多的小管结构。上述结果表明，在缺氧环境中，BMSCs成骨分化能力被显著削弱，而增殖能力和促进血管生成能力的增强远不足以弥补，所以整体上表现为BMSCs骨修复功能受到缺氧环境的抑制，由此可知改善干细胞疗法治疗效果的关键在于恢复其成骨分化能力。3.2OST解除缺氧对骨修复的抑制目前，在多项结合无机框架材料治疗骨缺损的研究中都显示，添加OST涂层2 0-2 1 或注射OST2都会显著增强骨再生，其中的机制可能包括促进MSCs的生长和成骨分化2 3。因此，OST可能也具有在缺氧环境中保护BMSCs、恢复其骨修复功能的能力。本研究用OST处理了常氧和缺氧环境下的BMSCs，并检测其相关指标。在OST处理后，BMSCs的增殖能力相应提高；对应组BMSCs的成骨分化和相关基因的表达显著增强，恢复到了常氧环境下的水平；同时，BMSCs培养基中血管生成因子的浓度也都相应增加，诱导的内皮细胞小管结构形成量也都相应增加。这些结果表明，OST能够恢复BMSCs的成骨分化能力，同时还能进一步增强其增殖能力和促进血管生成能力，即OST能够解除缺氧对BMSCs骨修复能力的抑制，具有潜在的临床应用价值。3.3OST作用机制的相关研究讨论OST能够保护缺氧环境中的BMSCs成骨分化，然而其中的具体分子机制仍有待进一步研究。根据已有的报道，在骨修复过程中，OST的保护和促进作用是多方面的。OST可以诱导人间充质干细胞中成骨细胞分化基因RUNX2、A LP等的表达2 3,也可以通过Src激活磷酸化VEGFR2调节成骨细胞功能。OST的抗氧化特性能显著降低过氧化氢处理下活性氧的产生和FOXO转录因子的激活，保护成骨细胞2 4。除了促进新骨形成外，OST还能通过多种方式减少骨质的流失。例如：通过下调NFATc1等转录因子的表达，抑制破骨细胞的形成2 5,降低血清IgG2a水平和T细胞活化，下调多种炎症因子水平，以减轻关节炎和骨退化等2 。除了OST对成骨分化过程的直接调控外，缺氧诱导因子HIF及其相关的mTOR、NF-k B、Ja k-St a t、空军航空医学2 0 2 3年0 8 月第40 卷第4期AviationMedicineofAirForce，Vo l.40，No.4，A u g u s t，2 0 2 3-catenin等多个信号通路是研究缺氧环境下分子调控时不可绕过的部分2 7 ，而OST是否能通过调控其中一个或多个信号通路，改变缺氧信号的传递，从而解除缺氧对BMSCs成骨分化的抑制，仍然需要更加深入的研究。综上所述，本研究发现缺氧环境会增加BMSCs增殖和促进血管生成能力，降低其成骨分化能力；而OST处理可以恢复BMSCs的成骨分化能力，并进一步增强BMSCs的增殖和促进血管生成能力。本研究揭示了骨抑素OST对缺氧环境下BMSCs骨修复功能的保护和促进作用，并探讨其中的潜在分子机制，为其在骨缺损临床治疗中的应用提供参考。利益冲突所有作者声明无利益冲突作者贡献声明付生龙：实验研究、分析数据、撰写文章；张军：统计分析、经费支持；刘俊朋：材料支持、技术指导；曹吉烈：设计实验【参考文献】1 DING H,GAO Y,WANG Y,et al.Dimethyloxaloylglycineincreases the bone healing capacity of adipose-derived stemcells by promoting osteogenic differentiation and angiogenicpotentialJ.Stem Cells Dev,2014,23(9):990-1 000.2Rani S,Ryan A E,Grifin M D,et al.Mesenchymal Stem Cell-derived Extracellular Vesicles:Toward Cell-free TherapeuticApplicationsJJ.Mol Ther,2015,23(5):812-823.3李羚榕，刘玉梅，匙峰，等.骨缺损修复中干细胞成骨分化调控因素研究进展J.中国现代医生，2 0 2 0，58（2 3）：18 6-192.4YUAN J,CUI L,ZHANG W J,et al.Repair of caninemandibular bone defects with bone marrow stromal cells andporous beta-tricalcium phosphateJ.Biomaterials,2007,28(6):1005-1013.5 3王德心，刘红岩，黄磊，等.骨抑素的结构改造及活性初探J.药学学报，2 0 0 0,35（3)：194-197.6 Garcia-Martin A,Acitores A,Maycas M,et al.Src kinasesmediate VEGFR2 transactivation by the osteostatin domain ofPTHrP to modulate osteoblastic functionJ.J Cell Biochem,2013,114(6):1404-1413.7先朱婧娴，施斌，纪伟.骨膜细胞促进骨缺损修复的研究进展 .中国口腔种植学杂志，2 0 2 1，2 6（4）：2 48-2 52.8 袁冰，韦卓骨缺损修复的研究进展.生物骨科材料与临床研究,2 0 14,11(3)：38-41.9杨民胜.低氧通过上调Notch1的表达抑制外周血间充质干细胞成骨分化的研究D.广州：南方医科大学，2 0 19.10 Holzwarth C,Vaegler M,Gieseke F,et al.Low physiologicoxygen tensions reduce proliferation and differentiation ofhuman multipotent mesenchymal stromal cellsJ.BMC CellBiol,2010,11:11.11 Lampert FM,Kitscher C,Stark GB,et al.Overexpression ofHif-l in Mesenchymal Stem Cells Affects Cell-Autonomous空军航空医学2 0 2 3年0 8 月第40 卷第4期AviationMedicineofAirForce，Vo l.40，No.4，A u g u s t，2 0 2 3Angiogenic and Osteogenic ParametersJ.J Cell Biochem,2016,117(3):760-768.12 CHEN Q,SHOU P,ZHENG C,et al.Fate decision ofmesenchymal stem cells:adipocytes or osteoblasts?J.CellDeath Differ,2016,23(7):1128-1139.13 YANG M,LIU H,WANG Y,et al.Hypoxia reduces theosteogenic differentiation of peripheral blood mesenchymalstem cells by upregulating Notch-1 expressionJ.ConnectTissue Res,2019,60(6):583-596.14 ZHANG P,HA N,DAI Q,et al.Hypoxia suppressesosteogenesis of bone mesenchymal stem cells via theextracellular signal-regulated 1/2 and p38-mitogen activatedprotein kinase signaling pathwaysJJ.Mol Med Rep,2017,16(4):5515-5522.15胡灏，王任先，万奔，等.骨发育及损伤修复过程中骨形成与血管形成的偶联作用J.中国骨与关节杂志，2 0 2 1，10（11)：8 7 1-876.16彭荟桢，蔡明详，刘湘宁.骨修复过程中的血管生成调控：新思路与新方法.中国组织工程研究，2 0 2 2，2 6（15）：2 40 0-2 40 5.17 Nassiri SM,Rahbarghazi R.Interactions of mesenchymal stemcells with endothelial cellsJ.Stem Cells Dev,2014,23(4):319-332.18 Yellowley CE,Genetos DC.Hypoxia Signaling in theSkeleton:Implications for Bone HealthJ.Curr OsteoporosRep,2019,17(1):26-35.19 GAO W,HE R,REN J,et al.Exosomal HMGB1 derived fromhypoxia-conditioned bone marrow mesenchymal stem cellsincreases angiogenesis via the JNK/HIF-1 pathwayJJ.FEBSOpen Bio,2021,11(5):1364-1373.20 Mora-Raimundo P,Lozano D,Benito M,et al.OsteoporosisRemission and New Bone Formation with Mesoporous Silica321NanoparticlesJ.Adv Sci(Weinh),2021,8(16):e2101107.21 Lozano D,Feito MJ,Portal-Nunez S,et al.Osteostatinimproves the osteogenic activity of fibroblast growth factor-2immobilized in Si-doped hydroxyapatite in osteoblasticcellsJ.Acta Biomater,2012,8(7):2770-2777.22 Van der Stok J,Lozano D,Chai YC,et al,Osteostatin-coated porous titanium can improve early bone regenerationof cortical bone defects in ratsJJ.Tissue Eng Part A,2015,21(9-10):1495-1506.23 Heras C,Sanchez-Salcedo S,Lozano D,et al.Osteostatinpotentiates the bioactivity of mesoporous glass scaffoldscontaining Zn(2+)ions in human mesenchymal stem cellsJ.Acta Biomater,2019,89:359-371.24 Portal-Nunez S,Ardura JA,Lozano D,et al.Parathyroidhormone-related protein exhibits antioxidant features inosteoblastic cells through its N-terminal and osteostatindomainsJ.Bone Joint Res,2018,7(1):58-68.25 Ibanez L,Nacher-Juan J,Terencio MC,et al.OsteostatinInhibits M-CSF+RANKL-Induced Human OsteoclastDifferentiation by Modulating NFATelJ.Int J Mol Sci,2022,23(15):8551,26 Nacher-Juan J,Terencio MC,Alcaraz MJ,et al.OsteostatinInhib