DB37∕T 4298—2020 绿潮次生毒性的快速检测方法 发光细菌法(山东省).pdf

ICS 07.060 CCS A 45 山东省地方标准 DB37/T 42982020 37 绿潮次生毒性的快速检测方法 发光细菌法 Rapid determination for secondary toxicity of green tideLuminescent bacteria method 2020 - 12 - 30 发布 2021 - 01 - 30 实施 山东省市场监督管理局 发 布 DB37/T 42982020 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由山东省海洋局提出并组织实施。 本文件由山东省海洋标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：山东省海洋资源与环境研究院、山东省标准化研究院。 本文件主要起草人：宋秀凯、付萍、张秀珍、刘晓波、刘爱英、姜会超、何健龙、程玲、于广磊、杨沣江。 DB37/T 42982020 1 绿潮次生毒性的快速检测方法 发光细菌法 1 范围 本文件规定了以一种发光细菌-费氏弧菌（Vibrio fischeri）为受试生物的绿潮次生毒性快速检测与毒性水平评价方法。 本文件适用于绿潮发生海域绿潮藻腐烂液次生毒性的检测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 绿潮次生毒性 secondary toxicity of green tide 绿潮藻腐烂分解产生的物质对生态环境产生的影响及损害的能力。 3.2 光抑制率 light inhibition rate 水样在一定的时间和条件下与发光细菌接触后，发光细菌的发光量降低的百分比。 3.3 光增益率 light gain rate 水样在一定的时间和条件下与发光细菌接触后，发光细菌的发光量增加的百分比。 3.4 半数效应浓度 median effect concentration 样品在一定的时间和条件下与发光细菌接触后，发光细菌的发光量减少50 %时的样品浓度。 3.5 水合 reconstitution 处于冷藏环境的发光细菌冻干粉加入一定量的稀释剂恢复至活性。 3.6 水合时间 reconstitution time 添加稀释剂的发光细菌恢复至活性所需要的时间。 3.7 反应时间 reaction time 恢复至活性的发光细菌与对照样本或者待测样本接触的时间。 4 方法原理 DB37/T 42982020 2 发光细菌在一定实验条件下的发光强度是稳定的。 在一定绿潮次生污染物范围内， 发光细菌接触样品后的发光强度与样品的急性毒性水平呈显著负相关（P0.05），通过分析仪测定细菌发光强度的变化以表示样品的急性毒性水平。 5 试剂与材料 5.1 发光细菌冻干粉 本文件使用的发光细菌菌株为费氏弧菌（Vibrio fischeri NRRL B-11177）。冻干粉应在-20 -25 储存，4 时，保存时间不超过4周；22 时，不超过24 h。 5.2 稀释剂 稀释剂为2 %氯化钠溶液， 用作水合发光细菌冻干粉、 稀释样品以及无毒对照样本。 2 8 保存。宜选用与冻干粉相应的稀释剂。 5.3 参比毒物母液 称取0.05 g七水合硫酸锌（ZnSO47H2O、分析纯）溶解于稀释剂中，定容至500 mL，即为参比毒物母液（100 mg/L）。母液密封4 保存，保存期不超过6个月。 5.4 参比毒物标准液 按照等差、等比倍数相结合的方式，采用梯度稀释法将参比毒物母液依次稀释至6 mg/L、4 mg/L、2 mg/L、1 mg/L、0.5 mg/L和0.25 mg/L，用于测定发光强度并制作标准曲线。标准液应现用现配。 6 仪器设备 仪器和设备如下： 生物毒性分析仪； 温度计：5 +40 ； 离心机：5 000 r/min； 电子天平：感量 0.00 1 g。 7 样品的采集、保存和预处理 7.1 样品的采集 参照GB 17378.3的规定，溶解氧、生化需氧量样品采集时应防止搅动水体，水样不应曝气。避免采集漂浮物，水样充满样品瓶，并记录当时现场的水温。样品瓶采用经过灭菌的50 mL棕色玻璃瓶。样品信息采集表参见附录A。 7.2 样品的保存 样品采集后宜在现场尽快进行毒性测定。若在实验室内测定，样品4 保存，24 h内测定；不能在24 h内测定的，转入50 mL冻存管内，于-20 避光保存，1周内测定。 7.3 样品的预处理 DB37/T 42982020 3 浑浊的样品应通过沉淀或使用离心机以5 000 r/min，离心1 min后，取上清液进行毒性测试。 8 样品的检测 8.1 实验室温度的校正 实验室检测时，调节室内温度与采样地温度接近。温差控制在2 。 8.2 样品管的准备 根据样品数量，准备相应数量的测试管：对照样品管23个（3个重复），待测样品管2 n3个(n:样品数量)。将测试管在小试管架中平均排成两排，第一排编码为A1、A2、A3An；第二排编码为B1、B2、B3Bn，前后两排一一对应。 注： n应小于10。 8.3 发光细菌冻干粉的水合 根据待测样品的数量，从冷冻环境中取出相应数量的发光细菌冻干粉，轻敲小瓶，确保冻干细菌充分落在瓶子底部。加入稀释剂，水合时间15 min。若水合单瓶冻干粉，向每只冻干粉中添加300 L稀释剂，用调至100 L的移液器混合34次；若水合多瓶冻干粉，需向每支冻干粉中加入300 L稀释液，然后将所有水合试剂并入一个新试管中，用调至500 L的移液器混合34次。在等待水合过程中，可将稀释剂、待测水样各取1 000 L分别加入A1管及A2An管中。 8.4 发光细菌初始相对发光值的测定 冻干粉水合15 min之后，水合液由浑浊变为清澈。依次向B1、B2、B3Bn小试管中添加100 L水合液，并依次将B1Bn放入检测仪中进行初始相对发光值检测。 8.5 反应后发光细菌相对发光强度值测定 当第Bn个小试管读数结束放回试管架后，5 min反应时间倒计时开始，迅速取A列溶液900 L加到对应的B列小试管中，混匀。待反应结束后，依次对B1、B2、B3Bn发光值读数。 9 标准液检测 测定同一批样品或开始使用一批新的发光菌冻干粉试剂时均需进行毒性测定。测试步骤同8。 10 数据处理 10.1 光抑制率/光增益率的计算 光抑制率/光增益率I计算方法见公式(1)： = 100% (1) 式中： So测试样品管初始相对发光强度值； St测试样品管反应5 min后相对发光强度值； f反应5 min校正因子，计算方法见公式(2)： DB37/T 42982020 4 = (2) 式中： Co对照样品管初始相对发光强度值； Ct对照样品管反应5 min后相对发光强度值。 10.2 EC50的计算 以I值为横坐标，ZnSO47H2O浓度为纵坐标做对数趋势线预测，得出相关系数R并计算出EC50。 11 质量控制 样品检测时应注意： 反应 5 min 校正因子f应为 0.61.8，否则更换冻干粉； 15 35 ，反应 5 min 标准液 ZnSO47H2O 的 EC50范围为 1 mg/L10 mg/L。 12 毒性水平评价 样品毒性水平的表征方法采用反应5 min发光抑制/增益率I进行评价。具体评价方法为： 根据I值将毒性等级分为4级，1、2、3、4级分别为无毒性风险、低度毒性风险、中度毒性风险、高度毒性风险，分级方法见表1。测试结果报表参见附录B。 表1 毒性风险等级评价方法 毒性等级 I 毒性风险等级 1 I0 无毒性风险 2 0I30 % 低度毒性风险 3 30 %I80 % 中度毒性风险 4 I80 % 高度毒性风险 DB37/T 42982020 5 A A 附录A （资料性） 样品信息采集表 样品信息采集表见表 A.1。 表A.1 样品信息采集表 监测单位： （章） 填表日期： 年 月 日 共 页 第 页 采样者 发光菌、仪器名称 样品编号 采样时间 经度 纬度 水温 保存方式 运输方式 分析者 校对者 审核者 DB37/T 42982020 6 B B 附录B （资料性） 测试结果报表 测试结果报表见表B.1。 表B.1 测试结果报表 监测单位： （章） 填表日期： 年 月 日 共 页 第 页 检测时间 检测时温度 校正因子 f 参比毒物标准液检测 ZnSO47H2O mg/L I % I均值 % 线性回归方程 相关系数 R EC50 样品检测 样品编号 温差 是否离心 I % I均值 % 毒性等级 分析者 校对者 审核者 DB37/T 42982020 7 参考文献 1 GB 17378.3 海洋监测规范 第3部分：样品采集、贮存与运输