FQPCR技术与儿科感染性疾病.pptx

FQ-PCR技术与技术与儿科感染性疾病儿科感染性疾病中山大学达安基因股份有限公司中山大学达安基因股份有限公司市场部市场部 裴媛媛裴媛媛达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本主要内容主要内容1、聚合酶链式反应（、聚合酶链式反应（PCR）的）的发展发展2、实时荧光定量、实时荧光定量PCR（FQ-PCR）的原理）的原理3、FQ-PCR与与儿科儿科感染性感染性疾病疾病（研究进展）（研究进展）4、达安公司儿科、达安公司儿科FQ-PCR相关产品相关产品PCRPCR的发明人的发明人加理加理 莫理斯（莫理斯（Kary B.Mullis Kary B.Mullis）达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本http:/ PCRPCR（polymerase chain reactionpolymerase chain reaction）达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本PCR PCR 动力学原理动力学原理 指数扩增指数扩增达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本发发射射光光实时荧光定量实时荧光定量 PCR PCR(Fluorescence Quantitative PCR,(Fluorescence Quantitative PCR,FQ-PCRFQ-PCR)实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR是指在是指在PCRPCR反应体系中加入反应体系中加入荧光基团荧光基团，利用荧光信号的积累利用荧光信号的积累实时监测实时监测整个整个PCRPCR进程，最后进程，最后 通过软件标准曲线对起始模板进行通过软件标准曲线对起始模板进行定量分析定量分析的方法。的方法。FQ-PCRFQ-PCR原理简化图原理简化图（simplified picture of FQ-PCR simplified picture of FQ-PCR）达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本FQ-PCR FQ-PCR 递增的荧光信号强度递增的荧光信号强度检测范围广检测范围广 (10(101 1-10-101010 拷贝数拷贝数/毫升毫升)实时实时数据数据监测荧光曲线监测荧光曲线高灵敏度、高特异性、高稳定性高灵敏度、高特异性、高稳定性高准确性定量分析高准确性定量分析FQ-PCR FQ-PCR 特点特点达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本荧光阈值荧光阈值&循环阈值（循环阈值（CtCt值）值）达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本FQ-PCRFQ-PCR扩增的理论模式扩增的理论模式l 理想PCR反应：X=X0*2nl 非理想PCR反应：X=X0(1+Ex)n 在扩增产物达到阈值线时在扩增产物达到阈值线时:X XCtCt=X=X0 0(1+Ex)(1+Ex)CtCt=M (1)=M (1)log M=log X log M=log X0 0(1+Ex)(1+Ex)Ct Ct (2)(2)log X log X0 0=-log(1+Ex)*=-log(1+Ex)*Ct+log M (3)Ct+log M (3)数学原理推导过程数学原理推导过程达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本FQ-PCRFQ-PCR定量原理图定量原理图达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本FQ-PCR FQ-PCR 扩增曲线函数关系扩增曲线函数关系（1 1）起始模板量越多，达到荧光阈值的）起始模板量越多，达到荧光阈值的循环数就越少，即循环数就越少，即CtCt值越小。值越小。（2 2）各模板起始拷贝数的对数（）各模板起始拷贝数的对数（LogLog浓度）与浓度）与CtCt值值呈线性反比关系，呈线性反比关系，即即起始模板量越多，起始模板量越多，CtCt值越小。值越小。（3 3）通过已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，）通过已知起始拷贝数的标准品作出标准曲线，根据未知样品根据未知样品CtCt值，就可值，就可以以计算出该样品中所含的计算出该样品中所含的起始模板量。起始模板量。达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本FQ-PCR FQ-PCR 在儿科感染性疾病中的应用在儿科感染性疾病中的应用肺炎支原体肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae,MP）呼吸道合胞病毒呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）人巨细胞病毒人巨细胞病毒（human cytomegalo virus,HCMV）EB病毒病毒（epstein-barr virus,EBv）肠道病毒肠道病毒（enterovirus 71,EV71&coxsackievirus,CoxA16）达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本研究进展达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本肺炎支原体肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae,mycoplasma pneumoniae,MPMP）CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS,Oct.2004,p.697728达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本Science.2009 Nov 27;326(5957):1235-40.Science.2009 Nov 27;326(5957):1235-40.肺炎支原体（肺炎支原体（MPMP）蛋白质图谱绘制完成）蛋白质图谱绘制完成达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本ScienceScience：呼吸道合胞病毒三维图像：呼吸道合胞病毒三维图像（respiratory syncytial virusrespiratory syncytial virus，RSVRSV）Three-dimensional (3D)crystal structure of a decameric,annular ribonucleoprotein complex of the RSV nucleoprotein(N)bound to RNA.The variable region is in orange,with the-hairpin highlighted and labeled with the RSV604 resistance mutation sites.Science.2009 Nov 27;326(5957):1279-83.达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本人巨细胞病毒人巨细胞病毒 （human cytomegalo virus,HCMVhuman cytomegalo virus,HCMV）News and Views.News and Views.Nature Medicine Nature Medicine 6,863-864(2000).6,863-864(2000).达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本ScienceScience：CMVCMV的重复感染机制的重复感染机制Science.2010 Apr 2;328(5974):102-6.Evasion of CD8+T cells is critical for Evasion of CD8+T cells is critical for superinfection by cytomegalovirus.superinfection by cytomegalovirus.达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本EBEB病毒病毒 （epstein-barr virus,EBvepstein-barr virus,EBv）EBv属于疱疹病毒亚科，是一种亲淋巴细胞病毒，能感染人及灵长类动物的 B淋巴细胞。EBv颗粒呈圆形，直径150180 nm，基因组为双股DNA，长170175kb。Nat Rev Cancer.EpsteinBarr virus:40 years on.(2004)4:757768.达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本PNASPNAS：EBEB病毒诱发肿瘤产生机制病毒诱发肿瘤产生机制The EpsteinBarr virus(EBV)nuclear antigen(EBNA)-1 is the only viral protein expressed in all EBV-carrying malignancies,but its contribution to oncogenesis has remained enigmatic.We show that EBNA-1 induces chromosomal aberrations,DNA double-strand breaks,and engagement of the DNA damage response(DDR).These signs of genomic instability are associated with the production of reactive oxygen species(ROS)and are reversed by antioxidants.These findings highlight a novel function of EBNA-1 and a possible mechanism by which expression of this viral protein could contribute to malignant transformation and tumor progression.Proc Natl Acad Sci USA.Proc Natl Acad Sci USA.2009 Feb 17;106(7):2313-8.Epub 2009 Jan 12.2009 Feb 17;106(7):2313-8.Epub 2009 Jan 12.The Epstein-Barr virus nuclear antigen-1 promotes genomic instability via induction of reactive oxygen species.The Epstein-Barr virus nuclear antigen-1 promotes genomic instability via induction of reactive oxygen species.达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本肠道病毒肠道病毒（enterovirus 71,EV71&coxsackievirus,CoxA16enterovirus 71,EV71&coxsackievirus,CoxA16）FQ-PCR特异性核酸（EV71、CoxA16）检测阳性被列为首选的检测方法和确诊依据。2009年7月，达安公司自主研发的三种肠道病毒检测试剂同时获得SFDA颁发的医疗器械注册证，是目前国内唯一获得权威部门认证的手足口病诊断产品。达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本小 结对儿科感染性疾病病原体核酸的特异性诊断已越来越成为病人治疗所必需。采用FQ-PCR方法检测病原体DNA，可以早期、快速、准确、特异性诊断患者的感染病因。从而有助于避免滥用抗生素，了解患者病情、治疗疗效监测、阻断病毒传播等。达安儿科系列产品达安儿科系列产品肺炎支原体（MP）核酸定量检测试剂盒呼吸道合胞病毒（RSV）核酸定量检测试剂盒人巨细胞病毒（HCMV）核酸定量检测试剂盒EB病毒核酸扩增荧光检测试剂盒肠道病毒（EV71型）核酸定量检测试剂盒柯萨奇病毒A16型（CoxA16）核酸定量检测试剂盒达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本（1 1）荧光定量）荧光定量PCRPCR法检测呼吸系统感染儿童肺炎支原体法检测呼吸系统感染儿童肺炎支原体DNADNA的分析的分析JJ 临床儿科杂志临床儿科杂志 20022002。（2 2）鼻咽癌患者血浆）鼻咽癌患者血浆EB EB 病毒病毒DNADNA水平的动态变化与临床疗效的关系水平的动态变化与临床疗效的关系JJ 癌症癌症 20022002。（3 3）检测肺炎支原体抗体对小儿呼吸道疾病诊断的价值）检测肺炎支原体抗体对小儿呼吸道疾病诊断的价值JJ 中国临床医药研究杂志中国临床医药研究杂志 20032003。（4 4）荧光定量）荧光定量PCRPCR与常规与常规PCRPCR检测沙眼衣原体、解脲支原体的比较检测沙眼衣原体、解脲支原体的比较JJ 江西医学检验江西医学检验 20042004。（5 5）荧光定量）荧光定量PCRPCR法检测呼吸道感染患儿支原体、衣原体感染法检测呼吸道感染患儿支原体、衣原体感染JJ 实用诊断与治疗杂志实用诊断与治疗杂志 20052005。（6 6）尿巨细胞病毒定量检测在巨细胞病毒感染诊断中的意义）尿巨细胞病毒定量检测在巨细胞病毒感染诊断中的意义JJ 实用儿科临床杂志实用儿科临床杂志 20062006。（7 7）先天性心脏病患儿体内人巨细胞病毒糖蛋白）先天性心脏病患儿体内人巨细胞病毒糖蛋白B B基因型研究基因型研究JJ 中国预防医学杂志中国预防医学杂志 20082008。（8 8）不同标本）不同标本EV71EV71和和CoxA16CoxA16检测对于手足口病重症患者的临床意义分析检测对于手足口病重症患者的临床意义分析JJ 中国卫生检验杂志中国卫生检验杂志 20092009。（9 9）肠道病毒核酸检测在儿童手足口病临床诊断中的价值及意义）肠道病毒核酸检测在儿童手足口病临床诊断中的价值及意义JJ 中国医师进修杂志中国医师进修杂志 20102010。使用使用FQ-PCRFQ-PCR产品产品第一大股东：中山大学第一大股东：中山大学第二大股东：广州生物工程中心第二大股东：广州生物工程中心 第三大股东：第三大股东：中国工商银行中国工商银行-鹏华优质基金鹏华优质基金 总股本：总股本：12540万股万股总资产：总资产：4亿元亿元国家高新技术产业化示范基地国家高新技术产业化示范基地卫生部医药生物工程技术研究中心卫生部医药生物工程技术研究中心国家认定企业技术中心国家认定企业技术中心广东省生物高新技术示范企业广东省生物高新技术示范企业广东高校第一个上市公司广东高校第一个上市公司（深交所）（深交所）002030002030达达达达 生生生生 命命命命 之之之之 源源源源 安安安安 健健健健 康康康康 之之之之 本本本本谢谢大家