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160现代食品XIANDAISHIPIN分析检测 Analysis and Testing大蒜在我国的种植历史悠久，作为食物、香料，在国内的产销量一直较高。同时，其作为具有药用价值的食材，在各种疾病的治疗中作为传统民间药物使用1，其健康益处主要与有机含硫成分有关2-3。大蒜中的有机含硫化合物主要是蒜氨酸和大蒜素 2 种活性成分，通常用来表征大蒜和大蒜相关产品的质量。由doi:10.16736/41-1434/ts.2023.18.050作者简介：李锦晶（1985），男，本科，工程师，研究方向为化学分析。通信作者：李凡（1984），男，本科，工程师，研究方向为植物与食品成分分析。高效液相色谱测定大蒜原料及大蒜片中蒜氨酸和大蒜素的方法研究Method Development and Validation for Quantitation of Alliin and Allicin in Garlic Raw Materialsand Garlic slice by HPLC李锦晶，李 凡，易 渡，张沿军（康宝莱蕾硕（湖南）天然产物有限公司，湖南 长沙 410100）LI Jinjing,LI Fan,YI Du,ZHANG Yanjun(Herbalife Natsource(Hunan)Natural Products Co.,Ltd.,Changsha 410100,China)摘 要：本文利用蒜氨酸的改性衍生物，建立了一种提取蒜氨酸和大蒜素的独特样品制备方法。对蒜氨酸采用酶抑制剂水溶液，邻苯二甲醛（OPA）试剂为衍生试剂，在 pH值为 9.010.0 条件下提取，获得较好的反应和稳定性。用 pH6.0 的醋酸钠缓冲液提取大蒜素，以获得更稳定的大蒜素。结果显示，5的进样温度可使蒜氨酸和大蒜素在溶液中保持 48h 的稳定。关键词：蒜氨酸；衍生化；液相色谱；同时测定Abstract：This article establishes a unique sample preparation method for extracting alliin and allicin using modified derivatives of allicin.Enzymatic inhibitor aqueous solution was used to extract allicin,with o-phthalaldehyde(OPA)reagent as the derivative reagent.The reaction and stability were achieved under pH 9.0-10.0 conditions.Extract allicin with sodium acetate buffer at pH 6.0 to obtain more stable allicin.The results showed that a sample injection temperature of 5 canmaintain the stability of alliin and allicin in solution for 48 hours.Keywords：alliin;derivatization;liquid chromatography;simultaneous determination中图分类号：TS207.2Analysis and Testing161XIANDAISHIPIN现代食品分析检测于蒜氨酸酶的存在，蒜氨酸是相当不稳定的，可以迅速转化为大蒜素；大蒜素性质极不稳定，容易分解，不能长期保存。2 种活性成分的极性以及稳定性差异较大，导致准确测定大蒜及制品中的蒜氨酸和大蒜素含量的方式也差异较大。其中，蒜氨酸通常用液相色谱测定4-5；大蒜素有用气质联用仪6-7进行测定，但更多采用分光光度法8-9或者反相色谱10-11测定。因此，建立一种同时测定 2 种物质的方法，可以极大提高分析效率。在本研究中，我们开发了一种将蒜氨酸标准品转化生成大蒜素的方法，并建立了一种控制其转化的方法。测定方法的关键在于防止蒜氨酸转化为大蒜素，并在样品制备和分析中，同时稳定蒜氨酸和大蒜素。本研究采用改进的柱前衍生的样品制备方法，不仅可以减少传统提取方法中常见的干扰，而且可以同时测定蒜氨酸和大蒜素。1材料与方法1.1 材料蒜氨酸标准品，USP,目录#1012950;乙腈，HPLC 级；乙酸铵，ACS 级；三水合醋酸钠，ACS；邻苯二甲醛（OPA）试剂，安捷伦#5061-3335（打开后可在冰箱中保存不超过 2 周）;十水四硼酸钠，GR 级；半盐酸羧甲氧基胺，ACS 级。1.2 仪器Waters 2695 液相色谱仪，包括泵、脱气器、自动进样器、温度控制模块和 PDA 检测器；分析天平；旋涡混合器；研磨机；超声发生器；振荡器；离心机。1.3 溶剂准备蒜氨酸酶抑制剂溶液（1 mgmL-1）：100 mg半盐酸羧甲氧基胺到 100 mL 纯净水中。硼酸缓冲溶液（pH 9.0）:将 1.9 g 十水四硼酸钠溶解在约 100 mL的纯净水中，用 0.2 molL-1硼酸调整 pH 值为 9.0。1.4 试验方法1.4.1 蒜氨酸测试样品溶液的制备称取 100 1 000 mg（精确到 0.1 mg)之间的粉末样品装入 35 mL 螺旋盖试管中，加入蒜氨酸酶抑制剂溶液（1 mgmL-1）20 mL，涡旋 30 s。超声 15 min，每隔 5 min 手动摇 5 s。用 0.2 m 针式过滤器过滤，丢弃前几滴滤液，收集约 5 mL 样品至一个小烧杯中。1.4.2 衍生化程序在小瓶中加入硼酸缓冲液 50 L，样品液 10 L，涡旋 1015 s，再加入 OPA 试剂 10 L，旋涡 1015 s，等待 2 min 左右加入纯水 130 L，将此溶液放入HPLC 进样瓶用于分析。1.4.3 大蒜素测试样品溶液的制备称取 1001 000 mg（精确到 0.1 mg）之间的粉末样品装入 35 mL 螺旋盖试管中，加入 20 mL 醋酸钠缓冲液，涡旋 30 s 左右。超声 15 min，每隔 5 min 手动摇动 5 s。静置 10 min 后，加入半盐酸羧甲氧基胺 约20 mg，涡旋 30 s。用 0.2 m 针式过滤器过滤，丢弃前几滴滤液，放入 HPLC 进样瓶用于分析。1.5 测定蒜氨酸及大蒜素的色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse AAA,1504.6 mm；检测波长：254 nm、520 nm；流动相A：20 mmol 乙酸铵；流动相 B：乙腈/水=90/10（体积比）；梯度洗脱程序见表 1；样品温度：5；流速：1 mLmin-1；进样体积：20 L（如表 1）。表1梯度洗脱程序表时间（min）流速（mLmin-1）A（%）B（%）01.00955301.007525451.001090551.001090561.00955601.009551.6 标准溶液准备1.6.1 蒜氨酸标准原液精确称量约 10 mg（精确到 0.01 mg）蒜氨酸参考标准倒入 10 mL 容量瓶中，加入约 6 mL 水，将溶液超声处理 10 min，用水稀释至刻度，摇匀备用。1.6.2 蒜氨酸工作标准溶液工作标准溶液 1：将 1 mL 蒜氨酸原液标准溶液移至 10 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度并摇匀。工作标准溶液 2：将 2.5 mL 蒜氨酸原液标准溶液移到 5 mL 容量瓶中，用水稀释至刻度并摇匀。工作标准溶液 3：蒜氨酸原液标准溶液作为工作标准溶液 3。每次工作溶液使用时，用 0.2 注射器过滤器过滤储存溶液，并遵循衍生化程序进行衍生化。162现代食品XIANDAISHIPIN分析检测 Analysis and Testing1.6.3大蒜素工作标准溶液取 1.0 m L 蒜 氨 酸 工 作 标 准 溶 液 2（约0.5 0 m g m L-1），加 入 1 0 0 L 粗 蒜 氨 酸酶 溶液，室温静置 10 min。用水稀释，用 0.2 注射器过滤器过滤。蒜氨酸工作标准溶液2 浓度（mgmL-1）162.26 354.425其中，162.26:大蒜素的分子量；354.42:蒜氨酸分子量的 2 倍。2结果与分析2.1衍生化溶液 pH 值对蒜氨酸产率和稳定性的影响如图 1 所示，蒜氨酸面积随着缓冲液的 pH 值增加而增加。当缓冲液的 pH 值在 4.0 5.5 之间时，蒜氨酸的衍生转化效率较低；当缓冲液 pH 值为 5.510.0时，蒜氨酸衍生化反应效率转化较高且没有明显变化。伴随碱度的增加，蒜氨酸衍生化产物变得更加稳定。当 pH 值在 9.010.0 之间时，降解率不超过 5%，蒜氨酸稳定时间至少为 48 h。图1pH值对蒜氨酸稳定性的影响图2.2提取液 pH 值对大蒜素产率和稳定性的影响考察了不同 pH 值下大蒜素的得率和稳定性。在大蒜素样品的制备过程中，使用了一系列 pH 值为 4.0 8.0 的提取液。在 5 下保存，分别在 0、8、10、15 和 21 d 时评价大蒜素的稳定性。结果如图 2 所示，当 pH 值为 4.0 时，大蒜素产率很低，且没有明显变化。当 pH 值为 4.5 8.0 时，反映出大蒜素在酸性条件下比在碱性条件下更易分解。当pH 值在 5.08.0 之间时，大蒜素保持稳定至少 10 d。综合考虑大蒜素得率、稳定性和蒜氨酸酶活性12，选择 pH 6.0 的缓冲液作为提取液。图2pH 值对大蒜素稳定性的影响图2.3温度对大蒜素溶液的影响考察了大蒜素在不同贮藏温度下的稳定性。提取后，大蒜素样品溶液分别在室温和 5 下保存 0、2、4、10、16 和 40 h，0、8、10、15 和 21 d 后进行评价。从图 3、图 4 可以看出，大蒜素在温度为 5 时最为稳定，15 d 后仅略有下降，降解率不超过 5%。在室温（25）下，该化合物的分解趋势更为明显，但呈渐进式，16 h 后分解速率为 9%。图3 25大蒜素样品的稳定性图图45大蒜素样品的稳定性图2.4精密度每个样品按试验方法制备 6 个重复样品，将样品与新配制的标准溶液进行对比分析。计算了各样品中蒜氨酸和大蒜素的含量。如表 2、表 3 所示，蒜氨酸和大蒜素 6 个结果的 RSD 均不大于 2%。大蒜素标准品浓度（mgmL-1）=1 420 0001 220 0001 020 000820 000620 000420 000220 00020 000A r e a o f a lllln（A u）550 000 500 000450 000400 000350 000300 000250 000200 000150 000100 000A r e a o f A l l i c i n （A u）600 000 500 000400 000300 000200 000100 000600 000 500 000400 000300 000200 000100 000D a yAnalysis and Testing163XIANDAISHIPIN现代食品分析检测2.5 准确度（加标回收率）测试考虑到基体干扰方法的准确度，本研究采用标准加入法，已知量的蒜氨酸和大蒜素原液被添加到样品溶液中，为方便测定，根据各样品中目标化合物本底值不同，分别以 3 个水平加标，每个水平做 3 次重复，测量的加标样品中每个组分的量相对于样品中相应组分的加入量被计算为回收率。在此基础上，以精密度试验得到的大蒜提取物和大蒜片中蒜氨酸和大蒜素的浓度，作为试验样品中蒜氨酸和大蒜素的基线含量，分别计算了加标样品中发现的蒜氨酸和大蒜素的数量与预期的蒜氨酸和大蒜素的回收率。如表 4 所示，蒜氨酸和大蒜素的加标回收率均在 80%120%之间。原料和片剂这两种基质的方法学验证结果差别不大，6 种目标化合物的平均回收率在 90%110%,说明此方法具有较高的稳定性和精密度。表2大蒜提取物中蒜氨酸及大蒜素的精密度结果表（大蒜提取物，R11255)重复试验蒜氨酸结果(mgg-1)RSD控制要求大蒜素结果(mgg-1)RSD控制要求19.91602%NMT 5%3.282 12%NMT 5%210.210 13.2080310.594 13.188 7410.159 93.299 5510.484 43.304 1610.354 83.318 6表 3大蒜片中蒜氨酸及大蒜素的精密度结果表（大蒜片，F0313)重复试验蒜氨酸结果(mgg-1)RSD控制要求大蒜素结果(mgg-1)RSD控制要求114.795 35.215 43.282 12%NMT 5%215.206 35.314 2315.076 65.293 9414.853 35.208 3515.035 85.258 1615.371 85.076 6表4 大蒜提取物和大蒜片中蒜氨酸的准确度结果表大蒜提取物，R11255大蒜片，F0313加标级别加标量(mg)实测值(mg)回收率(%)加标级别加标量(mg)实测值(mg)回收率(%)150%-11.153 91.06792150%-11.153 90.931 781150%-21.153 91.073 193150%-21.153 90.930 581150%-31.153 91.009 187150%-31.153 90.950 882175%-11.730 91.694 598175%-11.730 91.497 387175%-21.730 91.639 495175%-21.730 91.673 597175%-31.730 91.628 594175%-31.730 91.64395200%-12.307 82.077 490200%-12.307 82.133 592200%-22.307 82.01187200%-22.307 82.108 491200%-32.307 82.097191200%-32.307 82.14593164现代食品XIANDAISHIPIN分析检测 Analysis and Testing3 结论当前，学界许多研究对于蒜氨酸以及大蒜素的测定都是采用分开的方法，而本研究通过柱前衍生化反应，选取 pH 6 作为萃取条件，使用安捷伦 ZORBAX Eclipse AAA 色谱柱为分离柱，同时测定蒜氨酸以及大蒜素。样品再现性以及加标回收率试验结果表明，该方法准确可靠、精密度较好，可应用于大蒜原料、大蒜片中的蒜氨酸及大蒜素的测定。参考文献1 商春峰，周一冉，付彤.大蒜中蒜氨酸及大蒜素检测方法研究进展 J.现代食品，2018（10）：36-39.2 李天昊.高效液相色谱法测定大蒜素片中 DADS 和DATS 的含量 J.分析仪器，2021（2）：116-119.3CHEN LY，CHEN Q，CHENG Y F，et al.Diallyl trisulfide attenuates ethanol-induced hepatic steatosis by inhibiting oxidative stress and apoptosisJ.Biomedicine&pharmacotherapy.2016，79：35-43.4EMIKO M,AKIRA N,YOSHIMI K.Liquid chromatographic determination of allicin in garlic and garlic productsJ.Journal of chromatography A，1988，455：211-277.5 袁耀佐，杭太俊.柱前衍生化反相高效液相色谱法测定大蒜中的蒜氨酸及其有关物质 J.色谱，2008，26（2）：242-245.6 付松，谢碧俊.GC/MS 法检测保健食品-大蒜油中大蒜素 J.中国卫生检验杂志，2006（12）：1461-1462.7 王立媛.气相色谱法测定葱属植物中大蒜素含量 J.中国卫生检验杂志，2022（24）：2983-2985+2989.8WANG D，FENG Y，LIU J.Black garlic(Allium sativum)extracts enhance the immune systemJ.Med aroma plant science biotechnology，2010，4：37-40.9 唐辉、黄洪勇，陈坚.4-巯基嘧啶紫外法定量测定鲜蒜中蒜辣素 J.食品科技，2007，32（4）：183-187.10JANSEN H.MULLER B，KNOBLOCH K.Allicin characterization and its determination by HPLCJ.Plant medicine，2015，53：559-562.11 洪亮，张权、陈文生，等.高效液相色谱法测定蒜油中大蒜素的含量 J.贵州师范大学学报(自然科学版），2013，31（4）：81-84.12 曾哲灵，徐仁华，熊涛.蒜氨酸酶的分离纯化及其酶学性质测定 J.生物工程，2008（12）：431-434.（上接 1 0 6页）以及起重型机械的取物装备（吊钩、货叉、吸盘、抓具、抓斗等）的一维、二维、三维认址和定位技术。因此，未来研究方向可以集中于对起重机停车位置，以及取物装置的认址、标定技术，包括被吊物品存放的位置技术，根据不同货物、不同取物装置、不同的使用条件，开展有关的感应器和工艺方法研制5。目前，定位使用的主要感应器包括限位开关、接近开关、编码器、条码定位仪，以及大齿轮齿片位置等。9 结语未来，行车半自动化集控平台的应用，将逐步取代人的身体劳作，替代或局部取代人的大脑劳作，从而实现人、机器、物体之间的有效互动和深度整合，实现认识、判断、操作的全过程，对整个系统工作进行现场监测和信息识别，为起重机设计工作提供数据支撑。对此，本文深入研究了智能控制系统，并作出了一定的理论探讨，今后将结合工程技术实践，并充分考虑各种因素的制约，开展更深层次的技术探索。参考文献1 唐启儒.桥式起重机安全装置的应用探讨 J.工程建设标准化，2021（3）：156-157.2 赵攸乐.桥式起重机安全距离问题的检验与思考 J.质量与标准化.2020（09）：45-47.3 陈坚.桥式起重机典型事故分析及安全管理 J.山东工业技术.2015（02）：245.4 高聪.桥式起重机的常见故障与维修保养分析 J.中国设备工程.2023（08）：81-83.5 吴昊罡，潘彦宏，步超.智能起重机的控制系统与关键技术 J.起重运输机械，2018（5）：69-72.