高效好氧反硝化盖氏假单胞菌YZ-7的鉴定及其脱氮性能研究.pdf

5期1549高效好氧反硝化盖氏假单胞菌YZ-7的鉴定及其脱氮性能研究李茜1，孙正祥1，2*，周燚1，2*（1长江大学农学院，湖北荆州434025；2湖北省农林病虫害预警与调控工程技术研究中心，湖北荆州434025）摘要：【目的】筛选出高效好氧反硝化细菌，开发出适宜在虾塘应用且具有强脱氮能力的新菌株，以解决虾塘因氮素含量过高引起的水体富营养化等问题。【方法】采用稀释涂布法和Giltay鉴别培养基从稻虾养殖塘的污水污泥中分离筛选高效脱氮菌株，结合形态学特性、生理生化特征和16S rDNA序列分析对分离菌株进行鉴定；测定分离菌株在KNO3氮源条件下的脱氮效率，同时分析不同环境因子对分离菌株反硝化能力的影响，并通过模拟试验评价其在处理虾塘养殖废水时的反硝化性能。【结果】从稻虾养殖塘污水污泥中分离获得1株高效脱氮菌，经形态学特性、生理生化特征和16S rDNA序列分析鉴定为盖氏假单胞菌（Pseudomonas gessardii），命名为YZWF2207（简写为YZ-7）。以KNO3为唯一氮源时，菌株YZ-7经过6 h的迟缓期后进入对数生长阶段，且菌株YZ-7生长速率与含氮物质的去除速率密切相关。以柠檬酸钠为唯一碳源时，菌株YZ-7对硝态氮（NO3-N）的去除率为99.05%；碳氮比（C/N）范围为4.425.00时，菌株YZ-7具有较高的NO3-N去除率（99.71%99.85%）；菌株YZ-7的最高NO3-N去除率与生物量最大值并不同步，其更适宜生活在弱碱性（pH 7.08.0）环境中；菌株YZ-7的适宜环境温度为30，但在低温（15）下也能高效率完成反硝化过程，NO3-N去除率可达79.41%。菌株YZ-7对虾塘养殖废水中的NO3-N去除效果极显著（P0.01），且积累的亚硝态氮（NO2-N）相对于对照组有明显下降趋势。【结论】从稻虾养殖塘污水污泥中分离获得1株反硝化能力强的盖氏假单胞菌（YZ-7），其实现最佳好氧反硝化性能的碳源为柠檬酸钠，C/N为4.425.00，pH为7.08.0，温度为30。菌株YZ-7在养殖废水处理方面具有较强的反硝化能力和竞争优势，作为好氧反硝化细菌在富氮养殖废水的脱氮生物产品研发中具有广阔应用前景。关键词：反硝化；盖氏假单胞菌；脱氮性能；养殖塘废水处理中图分类号：S959文献标志码：A文章编号：2095-1191（2023）05-1549-10收稿日期：2022-12-06基金项目：湖北省科技重大攻关项目（2020BBA051）通讯作者：孙正祥（1980-），https:/orcid.org/0000-0001-5009-5384，博士，副教授，主要从事植物病害生物防治研究工作，E-mail：；周燚（1972-），https:/orcid.org/0000-0002-8432-8075，博士，教授，博士生导师，主要从事应用微生物学研究工作，E-mail：第一作者：李茜（1999-），https:/orcid.org/0000-0002-0297-1690，研究方向为微生物学，E-mail：南方农业学报Journal of Southern Agriculture2023，54（5）：1549-1558ISSN 2095-1191；CODEN NNXAABhttp:/DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.05.027Identification and denitrification performance of an efficientaerobic denitrification bacterium Pseudomonas gessardii YZ-7LI Qian1，SUN Zheng-xiang1，2*，ZHOU Yi1，2*（1College ofAgriculture，Yangtze University，Jingzhou，Hubei 434025，China；2Forewarning and Management ofAgricultural and Forestry Pests，Hubei Engineering Technology Center，Jingzhou，Hubei 434025，China）Abstract：【Objective】The efficient aerobic denitrification bacteria were screened to develop new strains with strongdenitrification ability suitable for application in shrimp ponds，so as to solve the problem of eutrophication caused byexcessive nitrogen content in shrimp ponds.【Method】An efficient aerobic denitrification bacterium was isolated andscreened from shrimp pond sewage sludge and water samples by diluted method in Giltay differential medium.Then it wasidentified by morphological characteristics，physiological and biochemical characteristics and 16S rDNAsequence analysis.Furthermore，the denitrification efficiency of the isolated strain under KNO3as nitrogen source was determined，and theeffects of different environmental conditions on denitrification performance of the isolated strain was analyzed.Finally，the denitrification ability of the strain in shrimp pond aquaculture waste water was evaluated by simulation test.【Result】An efficient denitrification bacterium was isolated from shrimp pond sewage sludge and water samples.It was identified54卷南 方 农 业 学 报 15500引言【研究意义】在自然界中，氮素作为水体污染的主重要污染物之一，同时有多种存在形式，其中硝酸盐是氮素存在于水体中最稳定的形式，通常情况下很难去除（沈桐等，2022）。过量的硝态氮（NO3-N）会造成硝酸盐污染，引起水质恶化及水体富营养化，严重威胁水生动物的生存繁衍及人类的生命健康（Rajta et al.，2020；朱红旭等，2021；李晶等，2022）。目前，我国虾塘水体的净化处理方式主要有物理、化学和生物3种方法，与物理和化学方法相比，新型的生物脱氮方法以无污染、安全性高、效果佳及成本低等优点被认为是污水治理最安全有效的途径，已得到广泛应用（许育新，2019；解维俊和姜海滨，2021；沈桐等，2022）。其中，好氧反硝化细菌充分展示出了新型生物脱氮的优点，已成为脱氮益生菌研发与应用的研究热点（张成龙等，2019；马青山和李艳，2021），在解决水体氮素污染的实际问题上具有重要意义。【前人研究进展】自1984年Robertson和Kuenen首次从废水中分离出1株具有好氧反硝化作用的副球菌属（Paracoccus sp.）以来，越来越多的好氧反硝化细菌从各种各样的生态环境中分离获得。沈辉等（2016）从沿海滩涂沉积物中筛选出的Halomo-nas sp.IW11-1对硝酸盐去除率为89.3%；高宇轩等（2022）从化工污水中筛选出的巨大芽孢杆菌（Bacil-lus megatherium）不仅能在8%高盐浓度条件下维持正常的代谢活动，还能高效脱氮，对氨氮和亚硝态氮（NO2-N）去除率分别为73.61%和83.56%。可见，好氧反硝化细菌具备较强的脱氮能力。此外，王薇等（2007）、沈桐等（2022）对已报道的好氧反硝化菌进行归纳总结，发现主要包括副球菌属、芽孢杆菌属（Bacillus）（Huang et al.，2017）、产碱杆菌属（Alcalig-enes）（陈均利等，2021）及假单胞菌属（Pseudomoas）（赵洋等，2022）等。至今，关于好氧反硝化细菌的理论技术趋于成熟，研究方向主要集中在菌株的脱氮特性、生理生化特性和脱氮机理等领域（Lei et al.，2016；Xi et al.，2022）。然而，针对菌株在养殖废水处理过程中存在脱氮效果稳定性差、环境适应力和竞争力弱等问题（雷强等，2022）的研究鲜见报道。【本研究切入点】我国江汉平原湖泊众多，淡水养殖业盛行，尤其是虾塘中残余饲料、龙虾排泄物及水生动植物代谢物等有机物的累积，导致养殖水体中富含含氮化合物，严重制约着小龙虾养殖业的健康发展。生物脱氮是当前解决水体氮素污染最安全有效的方法，因此亟待从虾塘环境筛选出更具优势的本土菌株，以解决反硝化细菌在养殖废水处理过程中存在脱氮效果稳定性差、环境适应力和竞争力弱的问题。【拟解决的关键问题】分离筛选高效好氧反硝化细菌并探究其最佳脱氮性能的培养条件，开发出适宜在虾塘应用且具有强脱氮能力的新菌株，以解决虾塘因氮素含量过高引起的水体富营养化等问题，促进我国小龙虾养殖业的持续健康发展。1材料与方法1.1菌株来源及培养基制作选取湖北省公安县稻虾养殖塘的污水污泥作为反硝化细菌筛选来源。（1）LB培养基：NaCl 10.0 g，胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，pH 7.2；固体培养基添加20.0 g琼脂。（2）Giltay培养基：A溶液为KNO31.0 g，天冬酰胺1.0 g，1%BTB酒精溶液5.0 mL，加as Pseudomonas gessardii by morphological characteristics，physiological and biochemical characteristics and 16S rDNAsequence analysis，and named YZWF2207（YZ-7）.When KNO3was used as the sole nitrogen source，strain YZ-7 enteredthe logarithmic growth phase after a 6 h lag period，with the growth rate of the strain YZ-7 closely related to the removalrate of nitrogen-containing substances.When sodium citrate was used as the solecarbon source，the removal rate of nitratenitrogen（NO3-N）was 99.05%.When the carbon/nitrogen ratio（C/N）ranged from 4.42 to 5.00，strain YZ-7 had relative-ly high NO3-N removal rate（99.71%-99.85%）.The highest NO3-N removal rate of strain YZ-7 was not synchronizedwith the maximum biomass.And it was more suitable to living in weak alkaline environment（pH 7.0-8.0）.The appropria-te ambient temperature of strain YZ-7 was 30 though，the denitrification process could be completed efficiently at lowtemperature（15），and the NO3-N removal rate could reach 79.41%.Strain YZ-7 had extremely significant effect onNO3-N removal from shrimp pond aquaculture wastewater（P葡萄糖乙酸钠丁二酸钠蔗糖。以柠檬酸钠为唯一碳源时，菌株YZ-7对NO3-N的去除率为99.05%。2.4.2C/N对菌株YZ-7反硝化效率的影响探究不同C/N对菌株YZ-7反硝化能力的影响，结果如图5所示。当C/N为1.005.00时，随着碳氮比的升高，菌株YZ-7的生长量越高，其NO3-N去除效率也随之提高；但C/N从5.00升高至20.00时，菌株YZ-7的生长量和NO3-N去除率均呈下降趋势，说明合适的C/N对维持菌株YZ-7的反硝化能力至关重要。此外，通过单因素方差分析发现菌株YZ-7好氧反硝化的最佳C/N范围是4.425.00，具有较高的NO3-N去除率（99.71%99.85%）。2.4.3pH对菌株YZ-7反硝化效率的影响在不同初始pH条件下对菌株YZ-7的反硝化能力进行探究，生理生化试验 Physiological and biochemical test葡萄糖 Glucose硝酸盐 Nitrate柠檬酸盐 Citrate淀粉水解 Starch hydrolysis葡萄糖氧化发酵 Glucose oxidative fermentation接触酶 Contact enzyme产酯酶 Esterase producing3%NaCl生长 3%NaCl growth4 生长 4 growth42 生长 42 growth结果 Result+氧化型+表 1菌株YZ-7的生理生化特性Table 1Physiological and biochemical characteristics of strainYZ-7“+”表示呈阳性反应；“-”表示呈阴性反应“+”indicated a positive reaction and“-”indicated a negative reaction图 1菌株YZ-7的菌落形态特征（A）及扫描电镜观察结果（B）Fig.1Colony morphology characteristics（A）and scanningelectron microscopic morphology（B）of strain YZ-75期1553结果如图6所示。当pH为7.0和8.0时，菌株YZ的NO3-N脱除性能最佳，NO3-N去除率分别为98.64%和98.21%，且基本无NO2-N积累（0.0286 mg/L）；与pH为7.0和8.0相比，pH为9.0时菌株YZ-7的生长不受影响，但NO3-N去除率明显下降，仅为74.13%。综合考虑不同pH条件下菌株YZ的生长量和NO3-N去除率，发现pH呈碱性时较pH呈酸性时的生长量和NO3-N去除率更高，表明菌株YZ-7的最高NO3-N去除率与生物量最大值可能并不同步，其更适宜生活在弱碱性环境中。2.4.4温度对菌株YZ-7反硝化效率的影响为检测培养温度对菌株YZ-7反硝化效率的影响，在不同温度条件下对菌株YZ-7培养48 h，结果如图7所示。当培养温度为1530 时，随着温度的升高，菌株YZ-7的生长量越高，其NO3-N去除效率也随之提高；图 2基于16S rDNA序列相似性构建的系统发育进化树Fig.2The phylogenetic tree constructed on the basis of 16S rDNAsequence similarity图 3菌株YZ-7的生长曲线及硝态氮脱除曲线Fig.3Growth curve and nitrate nitrogen removal curve ofstrain YZ-7图 4碳源对菌株YZ-7生长情况及其好氧反硝化效率的影响Fig.4Effects of carbon source on growth and aerobic denitrifi-cation efficiency of strain YZ-7图柱上不同小写字母表示差异显著（P0.05）。图4图7同Different lowercase letters on the bar represented significant difference（P0.05）.The same was applied in Fig.4-Fig.7图 5C/N对菌株YZ-7生长情况及其好氧反硝化效率的影响Fig.5Effects of C/N on growth and aerobic denitrificationefficiency of strain YZ-7100.0080.0060.0040.0020.000.001.40001.20001.00000.80000.60000.40000.20000.0000OD5401.003.004.425.00 10.00 20.00C/NNO3-NOD540NO3-N去除率（%）NO3-N removal ratedcbcaab300.00250.00200.00150.00100.0050.000.00浓度（mg/L）Concentration1.40001.20001.00000.80000.60000.40000.20000.0000OD540培养时间（h）Culture time06122436486072NO3-NNO2-NOD540P.proteolytica CMS 64（NR 025588.1）P.brenneri CFML 97-391（NK 025103.1）P.gessardii CIP 105469（NR 024928.1）YZWF2207P.azotoformans IAM 1603（LC130639.1）P.azotoformans NBRC 12693（AB680322.1）P.fluorescens NBRC 14160（MH191400.1）P.marginalisATCC 10844（LC409077 1）P.rhodesiae CIP 104664（AB021410.1）P.grimontii CFML 97-514（NR 025102.1）P.grimontii CIP 106645（LC409075 1）P.tolaasiiATCC 33618（NR 114481.1）P.tolaasii LMG 2342（NR 041799.1）P.palleroniana CFBP 4389（NR 029050.1）P.stutzeri NBRC 14165（NK 113652.1）0.005976089759189889085996590100.0080.0060.0040.0020.000.001.40001.20001.00000.80000.60000.40000.20000.0000OD540NO3-N去除率（%）NO3-N removal rate碳源种类 Carbon source柠檬酸钠丁二酸钠乙酸钠葡萄糖蔗糖NO3-NOD540acccb李茜等：高效好氧反硝化盖氏假单胞菌YZ-7的鉴定及其脱氮性能研究54卷南 方 农 业 学 报 1554但培养温度超过30 后，菌株YZ-7的生长量和NO3-N去除率均急剧下降。通过单因素方差分析，发现菌株YZ-7好氧反硝化的最佳温度为30，且在1530 的范围内均可获得理想的NO3-N去除效果（79.41%99.86%）。值得注意的是，菌株YZ-7在15 下的NO3-N去除率可达79.41%。综上所述，菌株YZ-7的适宜环境温度为30，但能在低温（15）下高效率完成反硝化过程。2.5菌株YZ-7对富氮养殖废水的处理效果经检测，对照组和试验组的富氮养殖废水NO3-N初始浓度分别为30.76和31.96 mg/L，NO2-N初始度均为0.33 mg/L，pH为8.3。将菌株YZ-7投加到富氮养殖废水中，静置培养72 h，养殖废水NO3-N和NO2-N的浓度变化如图8所示。在培养的前24 h，对照组养殖废水中有部分NO3-N降解，而试验组中的菌株YZ-7能迅速将养殖废水中的NO3-N完全降解，同时NO2-N积累量达最高值，为17.711.01 mg/L。在培养2448 h阶段，对照组养殖废水中的NO3-N浓度趋于稳定，最终去除率为62.45%，但NO2-N浓度仍继续增加；试验组养殖废水中的NO2-N浓度开始下降。培养至72 h后，试验组和对照组养殖废水的NO2-N浓度均趋于稳定，对照组的NO2-N浓度最终维持在17.48 mg/L左右，试验组的NO2-N浓度稳定在12.741.54 mg/L。总体而言，与对照组相比，试验组养殖废水中的NO3-N去除效果极显著（PNO2-N），与本研究中NO3-N先降解、NO2-N先积累后降解的变化趋势一致。此外，郑冰冰等（2020）发现低C/N会影响微生物酶活性，从而导致反硝化作用不彻底，影响脱氮效果。本研究结果表明，经菌株YZ-7处理后NO2-N最终积累量仍高于初始浓度，可能与养殖水中的碳源或其他营养物质含量不足及菌体死亡有关，但具体原理有待进一步探究。4结论从稻虾养殖塘污水污泥中分离获得1株反硝化能力强的盖氏假单胞菌（YZ-7），其实现最佳好氧反硝化性能的碳源为柠檬酸钠，C/N为4.425.00，pH为7.08.0，温度为30。菌株YZ-7在养殖废水处理方面具有较强的反硝化能力和竞争优势，作为好氧反硝化细菌在富氮养殖废水的脱氮生物产品研发中具有广阔应用前景。李茜等：高效好氧反硝化盖氏假单胞菌YZ-7的鉴定及其脱氮性能研究54卷南 方 农 业 学 报 1556参考文献：陈均利，张苗苗，张树楠，肖润林，吴金水，刘锋.2021.Alca-ligenes faecalis WT14的异养硝化好氧反硝化特性及对高氨废水处理潜力 J.环境工程，39（2）：27-32.ChenJ L，Zhang M M，Zhang S N，Xiao R L，Wu J S，Liu F.2021.Heterotrophicnitrification-aerobicdenitrificationcharacteristics of Alcaligenes faecalis WT14 and its poten-tial application in ammonia-rich wastewater J.Environ-mental Engineering，39（2）：27-32.doi：10.13205/j.hjgc.202102005.陈猛，李安章，张明霞，朱红惠.2020.一株异养硝化好氧反硝化菌的分离鉴定及其对养殖废水中氮的去除特性 J.农业资源与环境学报，37（2）：270-279.Chen M，Li AZ，Zhang M X，Zhu H H.2020.Isolation and identifica-tion of a heterotrophic nitrifying and aerobic denitrifyingstrain and its removal characteristics of nitrogen in bree-ding wastewater J.Journal of Agricultural Resources andEnvironment，37（2）：270-279.doi：10.13254/j.jare.2019.0059.东秀珠，蔡妙英.2001.常见细菌系统鉴定手册 M.北京：科学出版社.Dong X Z，Cai M Y.2001.Handbook of sys-tematic identification of common bacteriaM.Beijing：Science Press.高宇轩，靳静晨，徐利杉，高雅娟，张闻天，李晨晨，张国伟，靳永胜.2022.耐盐异养硝化好氧反硝化菌Bacillusmegatherium N07的分离及脱氮特性 J.生物技术通报，38（7）：247-257.Gao Y 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