高效液相色谱法测定香花秋海棠药用成分含量.pdf

第 42 卷第 9 期2023 年 9 月中 国 野 生 植 物 资 源Chinese Wild Plant ResourcesVol.42 No.9Sept.2023高效液相色谱法测定香花秋海棠药用成分含量陶仕珍1，罗茜2，张静美1，刘强1*（1.云南林业职业技术学院，云南 昆明650224；2.云南现代民族药工程技术研究中心，云南 昆明650501）摘要 目的：测定香花秋海棠（Begonia handelii）黄酮类、酚酸类药效成分含量。方法：利用高效液相色谱法测定。结果：测出人工栽培香花秋海棠的5种药效成分分别是芦丁、表儿茶素、儿茶素、原儿茶酸、原儿茶醛。其中，茎的各成分含量为：芦丁2.17 g/g、表儿茶素1.11 g/g、儿茶素2.73 g/g、原儿茶酸4.56 g/g、原儿茶醛1.08 g/g；叶的各成分含量为：芦丁13.44 g/g、表儿茶素（-）、儿茶素4.02 g/g、原儿茶酸2.01 g/g、原儿茶醛5.86 g/g。叶中检测出的芦丁、儿茶素、原儿茶醛的含量均大于茎的含量，原儿茶酸的含量小于茎的含量。结论：测定结果可为传统药材香花秋海棠的成分鉴定和药效评价提供参考，为该植物今后的药用资源开发利用提供理论依据。关键词 香花秋海棠；成分测定；高效液相色谱法中图分类号：Q949.9 文献标识码：A 文章编号：1006-9690（2023）09-0031-04Determination of Medicinal Ingredients in Begonia handelii by High Performance Liquid ChromatographyTao Shizhen1，Luo Qian2，zhang Jingmei1，Liu Qiang1*（1.Yunnan Forestry Technological College，Kunming 650224，China；2.Center for Drug Discovery&Technology Development of Yunnan Traditional Medicine，Kunming 650501，China）Abstract Objective：To identify the medicinal ingredients contents of flavonoids and phenolic acids in B.handelii.Methods：Using the high performance liquid chromatography（HPLC）method to measure the contents of the above components.Results：Five medicinal components，namely rutin，epicatechin，catechin，protocatechuic acid，and protocatechuic aldehyde，were determined in the cultivated plants of B.handelii.The content of each component in stems is that rutin 2.17 g/g，epicatechin 1.11 g/g，catechin 2.73 g/g，protocatechuic acid 4.56 g/g，and protocatechuic aldehyde 1.08 g/g；The content of each component in leaves is that rutin 13.44 g/g，epicatechin（-）and catechin 4.02 g/g，protocatechuic acid 2.01 g/g，and protocatechuic aldehyde 5.86 g/g.The content of rutin，catechin，and protocatechuic aldehyde detected in leaves was higher than that in stems，while the content of protocatechuic acid was lower than that in stems.Conclusion：The result can provide a reference for the identification of the components and efficacy evaluation of traditional medicinal herb B.handelii.Meanwhile，it also provides a theoretical basis for the medicinal resource development and utilization of this species.Key words Begonia handelii；Composition determination；HPLC秋海棠属（Begonia）植物种类繁多，分布广泛，位列全世界第6大被子植物科属，目前全世界对秋海棠属的研究、开发和应用主要集中在系统分类学、地理分布、分子生物学、资源保护和园艺观赏等方面 1。在我国，对秋海棠属植物的传统利用，除了观赏应用外，在其产地还将它们作药用、食用 2。管开云doi：10.3969/j.issn.1006-9690.2023.09.006收稿日期：2022-06-13，录用日期：2023-08-04基金项目：云南省教育厅科学研究基金项目（编号2020J1069）。作者简介：陶 仕 珍（1970-），女，布 依 族，云 南 罗 平 人，副 教 授，硕 士。研 究 方 向 为 植 物 栽 培 教 学 研 究。E-mail：*通讯作者：刘强（1980-），男，甘肃陇西人，教授，博士。研究方向为兰科植物资源保护教学研究。E-mail： 31中 国 野 生 植 物 资 源第 42 卷等 2 对国产26种秋海棠的调查研究发现，有24种作药用，其中8种既被作为民间中药、野生蔬菜和饮料，也被作为饲料加以利用，其中香花秋海棠有药用的记录，可用于止痒，治疗皮肤疥疮，在广西、广东以全草入药，云南仅以根茎入药。在我国220多种秋海棠中有药用用途记载的就有32种，既有内服、也有外用 3。目前从秋海棠属几种植物全草或根茎中分离得到的主要化学成分有黄酮类、皂苷、强心苷、甾醇等，有关秋海棠属植物成分的研究还较少，应加强对秋海棠属植物化学成分、药理作用、活性成分等方面的研究，才能更广泛地开发其药用、食用价值 4。据相关文献记载，香花秋海棠全草可利咽、消食、消肿，用于咽喉肿痛、食滞、跌打损伤5，还可用于清热散瘀、消食健胃3，但对其生药成分的测定至今未见报道。高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）法是化学化工和药物行业最常用的仪器分析手段，由于其具有高压强、高效率、高速度、高灵敏度、操作方便、极易回收、可降低样品消耗量等特点，已广泛应用于中药材活性成分测定6，7，在秋海棠属药材含量的测定中也有应用8-10。本研究采用HPLC法对香花秋海棠中黄酮类、酚酸类化学成分的含量进行测定，以期深入了解香花秋海棠生药成分和药用价值，为其药用资源的开发提供参考。1实验材料1.1试药香花秋海棠（Begonia handelii），又叫大香秋海棠、短茎秋海棠，为秋海棠科（Begoniaceae）秋海棠属植物，是多年生肉质草本，根状茎匍匐，无直立茎，雌、雄异株，花呈白色或粉红色，有芳香气味。生长于海拔 1001 500 m的森林里遮蔽潮湿的环境中；在我国主要分布于云南、广东、广西、海南；国外在老挝、缅甸、泰国、越南也有分布11-12。本实验所用样品香花秋海棠材料来自于云南林业职业技术学院金殿校区林木种苗培育温室内扦插繁殖的植株。1.2试剂耗材甲醇（批号：1107720708）和乙腈（批号：210365）均购自默克股份两合公司，甲醇和乙腈均为色谱纯。对照品信息：芦丁（批号：100080-20181，纯度：91.7%）和儿茶素（批号：110877-202005，纯度：95.1%）购自中国食品药品检定研究院，表儿茶素（批号：80460050）购自诗丹德，原儿茶酸（批号：C12977937，纯度：97.0%）和 原 儿 茶 醛（批 号：C12326334，纯 度：98.0%）购自麦克林。微孔滤膜0.45 m。2实验方法2.1色谱条件色谱柱：Z0RBAX SB-Aq（4.6 mm 150 mm，5 m）；流动相：表儿茶素、芦丁测定为乙睛 0.2冰醋酸水溶液=18 82，原儿茶酸、原儿茶醛、儿茶素测定为乙睛 0.2冰醋酸水溶液=32 68；流速：1 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：25；进样量：10 L。2.2溶液的制备2.2.1对照品储备溶液的制备精密称取对照品原儿茶酸11.94 mg，原儿茶醛10.82 mg，儿茶素 5.50 mg，表儿茶素 10.47 mg，芦丁10.15 mg，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得储备液。2.2.2对照品溶液的制备分别精密量取原儿茶酸对照品储备液330 L，原儿茶醛对照品储备液110 L，儿茶素对照品储备液1 mL，表儿茶素对照品储备液0.5 mL，芦丁对照品储备液60 L置于同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，即得含有原儿茶酸38.219 94 g/mL、原儿茶醛 11.663 96 g/mL、儿茶素 52.305 00 g/mL、表儿茶素52.350 00 g/mL和芦丁5.584 53 g/mL的混合对照品溶液。2.2.3供试品溶液的制备精密称取香花秋海棠药材粉末5.0 g置于具塞锥形瓶中，准确加入200 mL 70甲醇溶液，水浴回流提取1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加适量的水溶解，过聚酰胺柱（0.600 mm 0.150 mm，柱内径1.5 cm，湿法装柱），分别用水、95%乙醇各100 mL洗脱，收集乙醇洗脱液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至25 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，通过0.45 m微孔滤膜，取续滤液，可得供试品溶液。2.3测定方法参照蒋佳雯和刘卉等人建立的秋海棠属植物成分测定方法8，9，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 L，注入高效液相色谱仪，测定。根据公式（1）计算得测定样品各成分含量。X（gg-1）=对照品溶液浓度 稀释倍数 定容体积 供试品峰面积供试品取样量 对照品平均峰面积（1）32第 9 期陶仕珍，等：高效液相色谱法测定香花秋海棠药用成分含量3实验结果3.1各对照品溶液的峰面积各对照品溶液重复测定6次峰面积取平均值，见表1。各对照品平均峰面积用于计算供试样品的对应成分含量。3.2香花秋海棠茎5种药用成分含量取双样，同时对香花秋海棠茎的化学成分峰面积进行两次重复测定，通过与对照品进行比对，检测出5种化学成分分别是芦丁、表儿茶素、儿茶素、原儿茶酸、原儿茶醛，经上述公式计算各成分的含量，取其平均值，相对偏差为 0.00%0.15%，均 2%，测定结果有效，见表2。3.3香花秋海棠叶5种药用成分含量取双样，同时对香花秋海棠叶的化学成分峰面积进行两次重复测定，通过与对照品进行比对，检测出4种化学成分分别是芦丁、儿茶素、原儿茶酸、原儿茶醛，经上述公式计算各成分的含量，取其平均值，相对偏差为0.01%0.12%，均 芦丁（茎），儿茶素（叶）儿茶素（茎），原儿茶醛（叶）原儿茶醛（茎），原儿茶酸（叶）原儿茶酸（茎），表儿茶素只在茎中检测到，见表2、表3。将香花秋海棠茎、叶混合使用药效成分比单一使用丰富，且各成分含量也增高，有利于提高用药疗效。芦丁具有抗病毒、抑菌、抗炎、镇痛、清除自由基、增强免疫力、抗衰老、抗脂质过氧化、抗急性胰腺炎、抗自由基活性等作用13-14。表儿茶素及儿茶素具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、保护心血管、调节糖脂代谢、调节免疫力、保护神经系统等表1对照品溶液的峰面积测定Tab.1Mean peak areas of control samples序号123456平均峰面积芦丁峰面积36.418 7037.095 1337.141 1436.390 0837.366 2038.091 8037.083 84表儿茶素峰面积875.053 77876.326 42881.932 25876.170 90874.140 75873.595 58876.203 28儿茶素峰面积365.342 41361.983 43367.303 28366.306 79366.049 41365.961 85365.491 20原儿茶酸峰面积584.058 65584.400 94576.933 17582.752 01583.903 26583.468 93582.586 16原儿茶醛峰面积568.932 19556.458 19569.429 50566.328 06571.195 62561.952 21565.715 96表3香花秋海棠叶5种药用成分含量测定Tab.3Determination of five medicinal ingredients in the leaves of Begonia handelii所测成分芦丁表儿茶素儿茶素原儿茶酸原儿茶醛取样量（g）5.004 05.003 45.004 05.003 45.004 05.003 45.004 05.003 45.004 05.003 4峰面积17.776 6917.960 280.000 000.000 005.597 315.633 8117.520 5318.242 3919.461 7019.573 46含量（g/g）13.37413.5140.0000.0004.0014.0282.0042.0165.7425.979含量均值（g/g）13.440.004.022.015.86相对平均偏差（%）0.070.000.010.060.12表2香花秋海棠茎5种药用成分含量测定Tab.2Determination of five medicinal ingredients in the stems of Begonia handelii所测成分芦丁表儿茶素儿茶素原儿茶酸原儿茶醛取样量（g）5.017 25.016 85.017 25.016 85.017 25.016 85.017 25.016 85.017 25.016 8峰面积2.813 272.962 663.818 383.631 503.844 063.811 3313.939 6913.939 5010.367 3810.663 05含量（g/g）2.1112.2231.1361.0812.7412.7184.5564.5571.0651.095含量均值（g/g）2.171.112.734.561.08相对平均偏差（%）0.060.030.010.000.15 33中 国 野 生 植 物 资 源第 42 卷作用15-16。原儿茶酸具有抗氧化、抗炎、抗高血糖、抗纤维化以及保护心血管和神经系统的作用，还有抗菌、祛痰平喘、解蛇毒的功效17。原儿茶醛具有抗菌、抗炎、扩张冠状动脉和抑制血小板凝聚作用18-19。香花秋海棠茎叶中测定出了以上5种药用成分，初步验证了香花秋海棠清咽、消肿、清热散淤、止痒的药用功效，对其药效的进一步研究有一定的参考作用。其疗效是否还与别的化学成分有关，由于无对照品，本次试验无相关的测定，有待后续进一步的研究。对香花秋海棠5种药用成分芦丁、表儿茶素、儿茶素、原儿茶酸、原儿茶醛的含量测定，为香花秋海棠民间传统药用疗效找到了相应依据，可为今后深入研究该植物药用价值提供一定理论依据。4.2与近缘物种药用成分的比较分析因本次调查采样地位于保护区，且香花秋海棠只是零散分布，数量少，为了保护野生种质资源，只采了几个叶片作为人工繁殖材料供本次实验用。香花秋海棠与秋海棠（Begonia grandis）、中华秋海棠（Begonia grandis subsp.sinensis）的药用功效相近 19-21。本次测定出人工繁殖栽培香花秋海棠的5种药用成分含量与涂志超等20测定的产于湖北宜昌、恩施野生秋海棠以及产于湖北京山市、钟祥市中华秋海棠相比较，人工温室栽培香花秋海棠各药用成分平均含量明显低于野生的秋海棠和中华秋海棠。这反映出药材的产地不同、生境不同，其成分含量有差异，也说明道地药材是药材品质的重要保障，在中药材生产中用尽可能完善的仿野生栽培技术，才能保证药材的品质、药效不降低。香花秋海棠药效成分含量是否与产地、生长环境、栽培技术等因素有关，还有待下一步做深入的测定分析。参考文献:1 税玉民，陈文红.中国秋海棠 M.昆明：云南科技出版社，2018：1-5.2 管开云，山口裕文，李景秀，等.中国秋海棠属植物的传统利用 J.云南植物研究，2007，29（1）：58-66.3 蒋佳雯.贵州民族药红孩儿的质量标准提升研究 D.贵阳：贵阳中医学院，2011：43-48.4 范文娟，高昂，巩江，等.全球秋海棠属药学研究概况 J.辽宁中医药大学学报，2011，13（2）：59-61.5 张惠源.中国中药资源志要 M.北京：科学出版社，1994：664-667.6 汤国茂.高效液相色谱测定中药夏枯草活性成分含量 J.北方药学，2016，13（4）：4-5.7 胡玉.前处理技术的建立和优化下高效液相色谱法在中草药中的分析测定 D.重庆：西南大学，2020：1-2，39-41.8 蒋佳雯，徐文芬，杨亮，等.秋海棠属药材的质量标准研究J.中国实验方剂学杂志，2011，17（1）：40-42.9 刘卉，李华.UPLC法测定不同产地秋海棠中5种药效成分的含量 J.中国药师，2016，19（4）：780-782.10徐文芬，蒋佳雯，吴连花.盾叶秋海棠药材的HPLC指纹图谱研究 J.中国民族医药杂志，2012，18（7）：41-44.11吴征镒.中国植物志（第45卷）M.北京：科学出版社，2009：153-207.12管开云，李景秀.秋海棠属植物纵览 M.北京：北京出版社，2020：201-203.13李玉山.芦丁的资源药理及主要剂型研究进展 J.氨基酸和生物资源，2013，35（3）：13-16.14龙全江，杨韬.芦丁的研究概况及展望 J.中国中医药信息杂志，2002，9（4）：392-421.15侯丹，邵胜荣，陈小强，等.儿茶素稳态化及其应用研究进展J.食品工业科技，2017，38（22）：325-330.16刘超，陈若芸.儿茶素及其类似物的化学和生物活性研究进展J.中国中药杂志，2004，29（10）：1017-1021.17Kakkar S，Bais S.A review on protocatechuic acid and its pharmacological potentialJ.2014，https：/dx.doi.org/10.1155/2014/952943.18Khan A K，Rashid R，Fatima N，et al.Pharmacological activities of protocatechuic acidJ.Acta Pol Pharm，2015，72（4）：643-650.19季宗彬.中药有效成分药理与应用 M.北京：人民卫生出版社，2011：789.20涂志超，李丹平，聂晶，等.UPLC法测定秋海棠和中华秋海棠中5种成分的含量 J.中药材，2015，38（9）：1890-1893.21刘利琴，彭潇，马雪，等.贵州产红孩儿药材的质量标准提升研究 J.中国药房，2020，31（12）：1458-1462.34