干扰sorcin抑制乳腺癌细胞的侵袭转移.pdf

干干扰扰 抑抑制制乳乳腺腺癌癌细细胞胞的的侵侵袭袭转转移移蔡培英 丁 洁 姜 博 马新梅 王一婷 李双静 基基金金项项目目:山山东东省省自自然然科科学学基基金金(编编号号:)山山东东省省博博士士后后创创新新基基金金(编编号号:)作作者者单单位位:山山东东省省聊聊城城市市人人民民医医院院 通通讯讯作作者者:李李双双静静 【摘要】目的研究 干扰()对乳腺癌细胞 侵袭和迁移的影响 方法 利用 将 及阴性对照转染至 细胞 和 方法检测 的干扰效率 方法检测细胞对化疗药物的敏感性细胞划痕实验、小室法检测细胞的迁移和侵袭能力 和 方法检测 钙黏蛋白()表达 结果 干扰可显著降低 细胞中 表达干扰 后 细胞对化疗药物敏感性提高细胞迁移和侵袭能力显著下降 表达在 水平和蛋白水平均显著性升高 结论干扰 后可显著性抑制 细胞的侵袭迁移能力其机制可能是与上调 的表达有关 【关键词】乳腺癌小干扰 肿瘤转移 :./.中图分类号:.文献标识码:文章编号:().【】()().【】(:)乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一且发病率有逐年上升趋势 乳腺癌的侵袭转移是目前治疗失败的主要原因寻找到与乳腺癌侵袭转移相关的基因将为乳腺癌治疗的提供新的治疗靶点对于克服乳腺癌的转移具有重要意义 是一个 的耐药相关钙离子结合蛋白其在乳腺癌、卵巢癌、肺癌、白血病等多种耐药的恶性肿瘤中高表达与耐药的形成密切相关 研究表明肿瘤耐药和肿瘤转移具有直接相关性 可参与乳腺癌耐药的形成但 在乳腺癌侵袭转移中的作用尚不明确本文研究干扰 对人高侵袭转移能力的乳腺癌细胞系 的侵袭转移能力的影响及其机制 材材料料与与方方法法.细胞株 人乳腺癌细胞株 由本室保存 于含 胎牛血清的 培养基中 饱和湿度培养箱中培养.主要材料与试剂 、逆转录试剂盒购自 公司 购自 公司 小室、基质胶购自 公司抗 抗体购自 公司抗、实用癌症杂志 年 月第 卷第 期 .抗体购自 公司 标记的山羊抗兔、兔抗山羊抗体购自中杉金桥生物技术有限公司.仪器 细胞培养箱(德国 公司)倒置显微镜(日本 公司)型稳压稳流电泳仪(北京市六一仪器厂)实时定量 仪(公司)台式低温离心机(美国 公司).转染 细胞 采用本实验室设计好并验证的 的 其干扰 的靶序列 取对数生长期的 细胞铺到 孔板中待细胞汇合度达到 时将培养基吸去加入.无血清 进行转染 将 和 分别用 无血清 稀释室温静置 后等量混合室温静置 加入到细胞中 饱和湿度培养箱中培养 后吸去 加入 含 的 培养基转染 后细胞用于以下各组实验.检测、表达 各组细胞转染 后收集细胞加入 裂解提取细胞总 各取 逆转录为 用于 使用的引物序列为内参 上 游 下 游 上 游 下游 上 游 下 游 反应条件为 (个循环)溶解曲线 反应完成后用 自带软件进行分析.检测、蛋白表达 各组细胞转染 后收集细胞加入 裂解提取细胞总蛋白 法进行蛋白定量各组取 进行 电泳 电泳完毕后 恒流将蛋白转移至脱脂 膜上 脱脂奶粉室温封闭 分别加入抗、抗体 孵育过夜 洗膜 遍加入 标记的二抗室温孵育 洗膜 遍 试剂盒显色 光胶片曝光显影.法检测细胞对化疗药物敏感性 各组细胞转染 后铺到 孔板中(个/孔)培养过夜 将阿霉素()及依托泊苷()稀释到相应浓度加入到 孔板中每孔加 饱和湿度培养箱中培 后每孔加入 浓度为./的 培养箱中放置 弃上清每孔加入 溶解紫色结晶振荡器振荡使其充分溶解后用酶标仪在 波长下检测每孔的吸光度值(值)生长抑制率(加药组平均 值/对照组平均 值)按 法计算机程序求出半数抑制浓度.细胞划痕实验 各组细胞转染 后用无菌枪尖沿孔中心直线划一道痕迹 冲洗干净加入新鲜的培养基倒置显微镜下 倍视野下(倍物镜 倍目镜)拍照培养箱中培养 后倒置显微镜下观察细胞向划痕迁移情况并拍照.实验 各组细胞转染 后吸去培养基加入无血清 培养基饥饿细胞 消化细胞用无血清 培养基重悬细胞调整细胞密度为 个/每个 小室(侵袭实验小室预先铺上基质胶迁移实验不铺基质胶)中加入 细胞悬液下室加入 含 胎牛血清的 培养基培养 后取出小室用棉签擦去上层小室中未迁移的细胞.结晶紫染色 冲洗干净各取 个 视野(倍物镜 倍目镜)显微镜下拍照数出每个视野下迁移的细胞数统计处理.统计学处理 应用 .统计学软件数据以 表示采用 检验比较各组间差异 结结果果.对 细胞中 表达的抑制作用 结果显示:干扰组与空白对照组()及阴性对照组()相比 表达水平显著降低空白对照组()与阴性对照组()相比无统计学差异(图)结果与 结果一致 干扰组与空白对照组()及阴性对照组()相比 蛋白表达水平显著降低空白对照组()及阴性对照组()相比无统计学差异(图)实用癌症杂志 年 月第 卷第 期 .为 细胞转染 后 转录水平表达 为 细胞转染 后 蛋白表达图 细胞转染 后 干扰效率检测.干扰 提高 细胞对化疗药物敏感性 实验结果显示 降低 表达后 细胞对化疗药阿霉素()及依托泊苷()的敏感性与空白对照组()及阴性对照组()相比显著下降空白对照组()与阴性对照组()相比无统计学差异(图)为阿霉素的 值 为依托泊苷的 值 值是由三次独立药物敏感性实验计算得出图 法检测 细胞转染 后对化疗药物的敏感性.干扰 抑制 细胞迁移、侵袭能力 细胞划痕实验结果显示划痕 小时后空白对照组()及阴性对照组()的细胞划痕处已经基本汇合而 干扰组细胞迁移受到显著抑制划痕处细胞迁移较少并未愈合 与划痕实验结果一致 小室法结果显示 干扰组与空白对照组()及阴性对照组()相比细胞的迁移能力及侵袭能力显著降低空白对照组()与阴性对照组()相比无统计学差异.干扰 抑制 细胞 的表达 实验结果显示 干扰组与空白对照组()及阴性对照组()相比 的 及蛋白表达水平均显著升高 空白对照组()与阴性对照组()相比无统计学差异(图)讨讨论论 是一个钙离子结合蛋白可以通过调控心脏肌质网的钙平衡来调节心脏的兴奋收缩偶联并与肿瘤耐药密切相关 我们实验发现下调 表达可以增加 细胞对化疗药阿霉素及依托泊苷的药物敏感性与文献报道的 可以参与乳腺癌耐药形成结果一致 研究主要集中在其与肿瘤耐药的关系最近研究发现 在肝癌、胃癌及结肠癌的转移中均具有一定作用 我们研究发现 也能够调控乳腺癌的侵袭转移划痕实验中在乳腺癌细胞系 中干扰 后可以显著抑制细胞向划痕处的迁移同样在实验中干扰后也可以实用癌症杂志 年 月第 卷第 期 .为 细胞转染 后 转录水平表达 为 细胞转染 后 蛋白表达图 细胞转染 后 的表达情况显著抑制 细胞的迁移以及侵袭能力 是表达于上皮细胞的单链跨膜糖蛋白其与相邻上皮细胞上的 具有同源黏附作用形成了上皮细胞间粘附连接的核心 与肿瘤的侵袭转移密切相关大量文献报道 的表达降低或消失促进了多种肿瘤体内外的侵袭转移能力是肿瘤细胞发生上皮间质转化的重要标志 研究表明 在乳腺癌中表达降低与乳腺癌转移相关可以显著促进乳腺癌的腋窝淋巴结转移 在 细胞中干扰 后 在 水平及蛋白水平均显著性升高细胞间的黏附能力增强从而抑制了细胞的迁移和侵袭能力 综上所述在乳腺癌高转移细胞系 中干扰 可能通过上调 表达抑制其侵袭迁移能力 因此 可能成为乳腺癌的潜在治疗靶点参考文献 .:.():./.():./.():.():.():.():.():./.():.():.().():.:.()():.():.(下转第 页)实用癌症杂志 年 月第 卷第 期 .胃癌中的研究进展.中国现代普通外科进展():.:.():.严晨强.阿司匹林抗肿瘤研究进展.武警医学():.蔡忠林马骥王朝阳等.阿司匹林预防肿瘤的研究进展.现代肿瘤医学():.:.():.黄 娜王贝魏明莉等.阿托伐他汀对人肺腺癌细胞的凋亡作用及其调控机制研究.临床肺科杂志():.俞 俊段晶晶张 晔.阿司匹林联合阿托伐他汀协同抑制非小细胞肺癌细胞增殖及其机制研究.药学实践杂志():.李万奎.阿司匹林联合阿托伐他汀钙对内皮细胞氧化损伤及炎症因子的影响.实用医药杂志():./.():.梁宏彬崔晓波傅松滨./信号通路在卵巢癌耐药中的研究进展.国际遗传学杂志():.倪明立谢玲秦贝贝./信号通路在非小细胞肺癌组织的表达及意义.广东医学():.:.():.:.():.田春阳刘晓政.阿托伐他汀调控上皮间质转化抑制结肠癌细胞生长的机制研究.现代肿瘤医学():.(收稿日期 修回日期 )(编辑:吴小红)(上接第 页).():.():.():.():.():.():.():.:.:.():.():.(收稿日期 修回日期 )(编辑:吴小红)实用癌症杂志 年 月第 卷第 期 .