短柄五加祛风湿酒的加工工艺.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,毕业论文（设计,),（,2013,届本科）,短柄五加祛风湿酒的加工工艺初探,学院：生命科学与技术学院,专业：生物科学,班级：生物科学（,2,）班,作者姓名：苏金龙、张小惠、范建龙,指导老师：张博 职称：讲师,完成日期：,2013,年,5,月,20,日,陇东学院,短柄五加祛风湿酒加工工艺初探,苏金龙，张小慧,范建龙,（陇东学院生命科学与技术学院，甘肃 庆阳,745000,）,摘要,：本试验通过用不同浓度的乙醇为溶剂，在常温下对短柄五加茎皮内的物质进行提取，将提取液与黄酮类化合物的特征反应物质进行显色反应，证明了短柄五加茎皮含有黄酮类化合物。再用芦丁标品与提取物进行紫外、可见光谱分析，利用单因素试验及正交试验测定在不同提取方法下得到的黄酮类化合物的含量，进而得出其最佳浸提条件为：料液比,1:10,、乙醇浓度,60%,和浸提时间,20,天。依据以上条件，参考治疗风湿病运用较多的配方，以短柄五加茎皮、防风、香加皮、关白附、威灵仙、赤药、独活为原料，以纯粮食酒为提取液，泡制成具有宝石红色、酒药协调，但有苦、涩味特征的短柄五加茎皮祛风湿药酒。,关键词：,短柄五加茎皮；祛风湿；黄酮类化合物；,引言：,短柄五加,(,Acanthopanax,brachypus,Harms,.),又名倒耙牛，为五加科五加属植物，始载于,神农本草经,，常作为中药五加皮而广泛使用,1,。在中药典籍中，其茎皮作为五加皮入药；,本草纲目,有云：“宁得一把五加，不用金玉满车”，足见其悠久的药用历史；在,神农本草经,、,全国中草药汇编,和,中药志,中将短柄五加、细柱五加、红毛五加、糙叶五加和轮叶五加的根皮或茎皮统称为“南五加皮”，主要用于治疗：风寒湿痹、筋骨痿软、小儿迟行、身体羸弱、水肿、脚气、皮肤湿疹、阴囊湿痒、神经衰弱等病。,甘肃省中药材标准,将短柄五加收载为地方标准，命名为甘肃刺五加（,Rhizoma,et Radix,Acanthopanacis,），也是属于濒危植物之一，其生于海拔,1000-1500m,的灌木林中或向阳山坡上，分布于我国陕西北部，宁夏六盘山和陇东至天水，临潭一带，子午岭林区,2-3,。,药用其干燥的根、根茎及茎，具有健脾益气，补肾安神，祛风湿，强筋骨的功能；主用于肾阳虚，体弱乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多梦，心悸健忘，头晕，头痛，筋骨痿软，四肢拘挛,4,。目前对其在根茎化学成分,5-8,、生殖生物学和生态学方面研究较多,9,，但其开发利用研究较少。风湿病是一种侵犯关节、骨骼、肌肉、血管及有关软组织或结缔组织为主的疾病，多数为自身免疫性疾病，发病多较隐蔽缓慢，病程较长，且大多具有遗传倾向。在临床上，风湿给患者造成的主要危害在关节中，同样风湿性关节炎在发病期间也会对患者的关节形成极大的威胁，给人们的生活带来许多烦恼,10,。据中国中西医药结合学会风湿类疾病委员会抽样调查结果显示：在中国被抽样调查的,106678,人当中，风湿病患者达到,18552,人，占调查总数的,17.4%,。目前对于这类病的治疗，大多数的医学专家主张非手术治疗，即大多采用中药理疗的方法来治疗。,在主要通过药物治疗风湿病的现状下，本研究结合当地短柄五加资源丰富的特点、短柄五加茎皮的药理功能、参考用于治疗风湿病的现成配方，另辟蹊径，采用纯粮食酒作为提取液，进行摸索和探讨短柄五加祛风湿酒的加工工艺，为用短柄五加茎皮为主料治疗风湿病酒的研发提供一定的理论基础。,1,短柄五加研究状况,1.1,短柄五加生物学特性,短柄五加为五加科五加属植物，分布范围极其狭窄，主要分布在我国西北黄土高原上的陕北、宁夏六盘山、甘肃陇东一带的灌木林中。叶有小叶,3-5,；叶柄甚短，长仅,2-4,毫米；小叶片纸质，倒卵形至倒卵状长圆形，长,3-6,厘米，宽,1-2.5,厘米，先端圆形或短尖，基部狭尖，两面均无毛，边缘全缘，侧脉,3-5,对，上面不甚明显，下面隆起，明显，网脉在上面略下陷，下面不明显；无小叶柄或仅有长,3,毫米的小叶柄,伞形花序单生或,2-4,个组成顶生短圆锥花序，直径,1-1.5,厘米，有花多数；总花梗长,1-2,厘米，花后延长，无毛；苞片卵形，紫色，长约,1,毫米，先端丛生锈毛，边缘疏生纤毛；花梗长,1-1.5,厘米，无毛；花淡绿色；萼有短柔毛，边缘有,5,小齿；花瓣,5,，卵形，先端尖，长约,2,毫米，开花时反曲；雄蕊,5,，花丝长约,2,毫米；子房,5,室；花柱全部合生成柱状，长约,0.8,毫米。果实近球形，有,5,深棱，长约,5,毫米，宿存花柱长约,2,毫米。花期,8,月,11,。,1.2,短柄五加的化学成分研究概况,目前对短柄五加的化学成分的研究并不是很多，据胡浩斌等对短柄五加化学成分的研究，已经证实的化学成分有香草醛、丹皮酚、香草酸、没食子酸甲酯、,6,7,10-,三羟基,-8-,十八烯酸、丁二酸、扁枝衣二酸、左旋贝壳杉,-16-,烯,-19-,酸、白桦脂酸、天麻苷、丁香苷，金丝桃苷，丁香苷，刺五加苷,B1,，右旋芝麻素，,16-,羟基,-,贝壳松,-19-,酸，左旋对映贝壳松烯酸，,-,谷甾醇，,-,谷甾醇葡萄糖苷，硬脂酸，棕榈酸，亚麻酸，维生素,A,、,B1,等,12-13,。,目前对短柄五加的化学成分的研究并不是很多，据胡浩斌等对短柄五加化学成分的研究，已经证实的化学成分有香草醛、丹皮酚、香草酸、没食子酸甲酯、,6,7,10-,三羟基,-8-,十八烯酸、丁二酸、扁枝衣二酸、左旋贝壳杉,-16-,烯,-19-,酸、白桦脂酸、天麻苷、丁香苷，金丝桃苷，丁香苷，刺五加苷,B1,，右旋芝麻素，,16-,羟基,-,贝壳松,-19-,酸，左旋对映贝壳松烯酸，,-,谷甾醇，,-,谷甾醇葡萄糖苷，硬脂酸，棕榈酸，亚麻酸，维生素,A,、,B1,等,12-13,。,1.3,短柄五加的药理作用研究概况,短柄五加是我国特有的民间药用植物，其药用部位主要是茎皮和根，具有益气健脾、养心安神、活血化瘀、通窍经络作用。据研究表明五加茎皮有祛风湿、活血去瘀、治风寒湿痹、壮筋骨、筋骨挛急抗炎、镇痛、镇静、腰痛、阳痿、脚弱、小儿行迟、水肿、脚气、疮疽肿毒作用，能提高血清抗体的浓度、促进单核巨噬细胞的吞噬功能，有抗应激作用，能促进核酸的合成、降低血糖，有性激素样作用，并能抗肿瘤、抗诱变、抗溃疡，且有一定的抗排异作用,14-16,。,2,材料与方法,2.1,仪器、药品和材料,2.1.1,仪器,PC-1000,数显式电热恒温水浴锅，上海跃进医疗器械厂；,UV757CRT,紫外可见分光光度计，棱光仪器公司；电子天平,ISO9001,北京赛多利斯科学仪器有限公司；,SHB-3,型循环水多用真空泵，郑州杜甫仪器厂；,KQ-500DE,型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发器，巩义市予华仪器有限责任公司；,DHG-9070A,型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；冰箱,BCD-220MLVP,苏州三星电子。,2.1.2,药品,芦丁,:,上海生化试剂二厂,乙醇、石油醚、乙醚、硼氢化钠、水杨酸、,H202,、,FeSO4,、,AlCl3,、,NaOH,、,HCL,、,FeCl3,、镁粉、,NaNO2,、,A1(NO3)3,，以上化学药品均为分析纯。,2.1.3,实验材料,采自甘肃省正宁县中湾林场段子午岭林区的短柄五加。,2.2,短柄五加茎皮有效成分提取方法,精确称取,2.00g,短柄五加茎皮粉末，利用单因素分析法，分别研究料液比、提取时间和提取液浓度对短柄五加茎皮的有效成分提取效果的影响。采用正交试验法得出短柄五加祛风湿酒的最佳提取工艺。,2.3,提取液中黄酮类化合物的定性分析,2.3.1,提取物的颜色反应,取一定量短柄五加茎皮提取液，减压浓缩，再用石油醚脱脂，烘干得黄酮类粗品，分别与硼氢化钠、,A1Cl,3,、,Mg,粉,+HCL,、,NaOH,反应。,2.3.2,吸收光谱分析,取短柄五加茎皮提取液,4ml,、芦丁标准品,10mg,分别加入,70,的乙醇定容至,100ml,、各取一定体积测其紫外、可见光谱。取上述经过稀释的提取液及芦丁标品各,20ml,，加,1.2ml5,NaN0,2,，摇匀，静置,6min,，再加,10,Al(NO,3,),3,1.2ml,，摇匀，静置,6min,，再加入,4,NaOH,8ml,，加水,0.8ml,，摇匀，静置,15min,，以,70,的乙醇为空白对照。在,210,410nm,范围内,间隔,2Onm,测其紫外光谱和在,410,810nm,范围内间隔,100nm,测其可见光谱。,2.3.3,短柄五加茎皮提取液黄酮含量的测定,吸取芦丁标准液,0.0,、,1.0,、,2.0,、,3.0,、,4.0,、,5.0,、,6.0,、,7.0,、,8.O ml,分别加,70%,乙醇定容至,20ml,，按,2.3.2,测铝盐光谱的操作进行，选择,2.3.2,所测得的芦丁铝盐可见光区吸光度最大时的波长作为入射波长测吸光度，用最小二乘法得工作曲线。同样操作，测短柄五加茎皮黄酮类化合物提取液的吸光度，代入工作曲线求黄酮类化合物浓度，然后代入公式,m=VV2C,V1,计算，即可计算出短柄五加茎皮黄酮类化合物提取量。式中，,V,为短柄五加茎皮乙醇提取液总体积；,V1,为从总黄酮提取液中取出测吸光度的黄酮液体积；,V2,为,V1,经稀释后的体积；,C,为回归方程算出的黄酮类化合物浓度；,m,为提取的短柄五加茎皮的质量。,2.4,短柄五加茎皮祛风湿药酒的制作方案,2.4.1,短柄五加祛风湿酒的配方,短柄五加茎皮,250g,防风,250g,香加皮,125g,关白附,100g,威灵仙,250g,赤芍,150g,独活,125g,2.4.2,配方中各材料的药理作用,17,短柄五加 茎皮,祛风湿，补肝肾，强筋骨。用于风湿痹痛，筋骨痿软，小儿行迟，体虚乏力。,防 风,解表祛风，胜湿，止痉。用于感冒头痛，风湿痹痛，风疹瘙痒，破伤风。,关白附,祛风、燥湿。用于中风痰壅，口眼歪斜，偏正头风，风痰 眩晕，痰厥头痛。,威灵仙,祛风湿，通经络，止痹痛。用于风湿痹痛，肢体麻木，筋脉拘挛，屈伸不利,.,赤 芍,清热凉血，散瘀止痛。用于吐血衄血，目赤肿痛，肝郁胁痛，癥瘕腹痛，跌扑损伤。,独 活,祛风除湿，通痹止痛。用于风寒湿痹，腰膝疼痛，少阴伏风头痛。,香加皮,祛风湿，强筋骨。用于风寒湿痹，腰膝酸软，心悸气短，下肢浮肿。,2.4.3,短柄五加祛风湿酒的加工流程,18,短柄五加茎皮,分选,清洗,剥皮,自然风干,称量、加入配料,第一次浸提,粗滤,滤渣,第二次浸提,粗滤,滤渣,第三次浸提,粗滤,滤渣,粗 滤 液,过滤,装瓶,包装,短柄五加茎皮祛风湿酒,3,结果与分析,3.1,短柄五加茎皮提取液中的黄酮类化合物的定性分析,取短柄五加茎皮乙醇提取的浓缩液分别加入以下试剂后，结果见表,1,。,表,1,短柄五加茎皮乙醇提取物的颜色反应,综合短柄五加茎皮提取液的颜色反应结果，说明茎皮提取液中含有黄酮类化合物，这些黄酮类化合物中可能包含有黄酮醇及双氢黄酮,19-20,。,反应试剂,现象,硼氢化钠,溶液变为蓝紫色,三氯化鋁,紫外光下可见淡蓝色荧光,镁粉,+,盐酸,反应起始时的泡沫红色，溶液棕红色,氢氧化钠,溶液变为桔黄色,3.2,吸收光谱,按,2.3.2,操作，测出芦丁标品、短柄五加茎皮黄酮类化合物及其鋁盐络合物的紫外、可见吸收光谱，见图,1-4,。,图,1,芦丁、短柄五加茎皮黄酮类化合物的紫外光谱,图,2,芦丁、短柄五加茎皮黄酮铝盐的紫外光谱,图,3,芦丁、短柄五加茎皮黄酮类化合物可见光谱,。,图,4,芦丁、短柄五加茎皮黄酮铝盐可见光谱,通过对比芦丁标准液及短柄五加茎皮提取物的上述光谱曲线图，可见它们非常相似，二者在,280nm,、,380nm,及,5lOnm,处均有较高吸收峰，表明短柄五加茎皮提取液中含有黄酮类化合物。,3.3,标准曲线及提取液中黄酮类化合物含量的测定,根据上述色谱分析，选择,5lOnm,波长作为测试波长，用比色法测得工作曲线及回归方程（图,5,）。,浓度（,mg/ml,）,OD,值（,A510nm,）,图,5,芦丁标准曲线,取短柄五加茎皮提取液,2m1,，用,70,的乙醇定容至,20ml,，然后按照制作工作曲线同样的操作，在波长,51Onm,处测吸光度，代入工作曲线及公式即可计算出黄酮类化合物的提取量,。,3.4,提取条件的选择,3.4.1,不同浓度的乙醇提取剂对黄酮化合物提取量的影响,表,2,不同浓度的乙醇对短柄五加茎皮中黄酮类化合物的提取效果影响,由表,2,可知，不同浓度的乙醇提取剂对短柄五加茎皮黄酮类化合物的提取效果不同，用,35%,的乙醇提取效果最差,60%,的乙醇提取效果最好,故在短柄五加祛风湿酒的泡制中选择,60,的纯粮食酒作为酒基比较理想。粮食酒的浓度越高，提取效果可能会越好，但是会直接影响药酒的口感，而且市面中也很难找到这样的高浓度粮食酒。,提取剂的浓度,短柄五加茎皮质量（,g,）,黄酮得率（,%,）,35%,2.0,0.366,42%,2.0,0.396,52%,2.0,0.439,60%,2.0,0.547,3.4.2,不同料液比对黄酮类化合含量的影响,在常温下，选择,60%,的乙醇作为提取剂，以,1:8,、,1:10,、,1:15,、,1:20,的料液比提取,20,天，测得结果见图,6,。,图,6,不同料液比对短柄五加茎皮黄酮类化合物提取量的影响,一般来说，溶剂用量越大，提取效果就越好，但当溶剂的量增大到一定值时，黄酮类化合物的提取量会渐趋稳定。而过高的料液比会造成溶剂和能源的浪费，并增大了浓缩的工作量。由图,6,可见，随着料液比的增大，黄酮类化合物的提取量明显增大，至,1:10,后渐趋稳定。这可能是由于黄酮类化合物的溶出已达到最大故选择,1:10,作为短柄五加祛风湿酒的最佳泡制料液比。,3.4.3,提取时间对黄酮类化合物含量的影响,以料液比,1:10,加入,60%,的乙醇，在常温下浸提,10d,、,15d,、,20d,和,25d(,每间隔,1d,，人工摇动,5-10min),，得出提取时间与黄酮类化合物提取量的关系（,7,）。,图,7,时间对短柄五加茎皮黄酮类化合物提取量的影响,由图,7,可知，随着提取时间的增加，短柄五加茎皮中黄酮类化合物的提取量明显增加，,20d,后，黄酮类化合物提取量基本渐趋稳定。如果时间过长，乙醇的挥发量增多，提取液的浓度下降，同时，氧化分解的黄酮类化合物量也逐渐增多，对短柄五加茎皮中黄酮类化合物的提取量有一定的影响。因此选择,20d,作为短柄五加祛风湿酒的最佳泡制时间。,3.4.4,正交试验结果,在上述单因素试验的基础上，对影响短柄五加茎皮黄酮类化合物提取液的浓度、料液比、提取时间进行三因素四水平正交试验，其中,A,为料液比、,B,为提取时间、,C,为乙醇浓度，具体对短柄五加茎皮黄酮类化合物提取的影响因素水平见表,3,，正交试验方案及结果见表,4,。,表,3,短柄五加茎皮黄酮类化合物提取的影响因素,由表,4,可知，试验,(A2B3C4),黄酮类化合物提取量最高。对比,T,值、,R,值，得出短柄五加茎皮黄酮类化合物提取的最佳工艺条件是,A2B3C4,，即乙醇浓度,60,、料液比为,1:10,、提取时间为,20,天时，黄酮类化合物的提取量最高；由极差,R,大小得出料液比、提取时间、乙醇浓度三个因素对黄酮类化合物提取量的影响力由主到次为：提取时间,料液比,乙醇浓度,(,即,BAC),。,3.5,短柄五加祛风湿酒的加工配方及工艺,3.5.1,原料及方法,配方：参考治疗风湿病的成方，略有改动；提取液：,60,纯粮白酒购于西峰东湖酒厂；浸提时间：浸提时间为,20,天。,3.5.2,短柄五加祛风湿药酒加工工艺,按配方称取一定量的药材放入事先洗净的磨砂广口瓶中，然后加入,60,的纯粮食白酒,12500ml,常温浸泡,20,天（每间隔,1d,，人工摇动,5-10min,），粗滤，将滤渣重复提取两次，过,滤，合并滤液，细滤，静置，取上清液，得半成品药酒。,4,药酒的外观特征,4.1,感官指标,色泽：呈宝石红色，色泽和谐。风味：酒药协调，但口感苦、涩。组织形态,:,澄清液体；无杂质、无悬浮物。,4.2,理化指标：,酒度,60,4.3,卫生指标：,符合,GB27571981,标准（蒸馏酒及配制酒卫生标准）细菌总数,2,个,/ml,大肠杆菌,2,个,/10ml,致病菌未检出,5,讨论,本试验通过用不同浓度的乙醇为提取剂，采用冷浸法对短柄五加茎皮中的有效成分进行提取，并将提取液与黄铜类化合物的特征物质进行显色反应，证实了短柄五加茎皮中含,有黄酮类化合物。并且以芦丁为标品,通过单因子试验分析得出料液比、提取时间、乙醇浓度对短柄五加茎皮黄铜类化合物提取量的影响，进而通过正交试验得出提取的最佳工艺，即料液比为,1:10,、提取时间为,20,天、乙醇浓度为,60%,的粮食酒，本提取工艺与胡浩斌等（,2009,年）对短柄五加化学成分的提取方法很类似。我国传统的药酒泡制方法为冷浸法，方便简捷，此方法先将泡制所需的中药材处理成薄片或粗碎颗粒，置于密封的容器中,(,或先以绢袋盛药再纳入容器中,),，加入适量的白酒,(,按配方比例加入,),，浸泡,20,天左右，并经常摇动，待有效成分溶解到酒中以后，即可滤出药液。药渣可压榨，再将浸出液与榨出液合并，静置,15,天左右后再过滤即成。药酒用于防治疾病，在我国医药历史上已处于重要的地位，成为历史悠久的传统剂型之一，在国内外治疗与保健中享有很高的声誉。,太平圣惠方,药酒序,认为“夫酒者，谷蘖之精，和养神气，性惟憟悍，功甚变通，能宣利胃肠，善导引药势”，说明酒具有通经络、祛风散寒的功效。,现代化学认为酒是一种良好的溶剂，能溶解大部分水溶性物质，还能溶解水不能溶解的某些物质。又具有较好的穿透性，能使酒较容易进入中药材组织细胞中，将中药材里大部分各种不同的有机物质溶解出来，以发挥生药原有的治疗作用。目前国内治疗风湿类疾病在临床上运用较多的成方有“祛风通络汤”,21,（威灵仙、独活、防风各,12,克，赤芍,15,克、丹参,20,克、甘草,6,克、乳香各,9,克、附子,6,克），功效祛风通络活血，散寒除湿镇痛，补气养血，主治风湿性关节炎；“大风引汤”（,太平圣惠方,）（赤芍、防风、独活、附子、姜黄、当归、黄芪各,10,克，威灵仙各,15,克，芜活、桂枝各,6,克，桑枝、鸡血藤,8,克），其功效曲风散寒除湿，通络宜痹止痛，主治风湿性关节痛。由于短柄五加茎皮有祛风湿，补肝肾，强筋骨作用，所以本试验在以上配方的基础上略有改动，以短柄五加茎皮为君药，外加防风、香加皮、关白附、威灵仙、赤芍、独活为副料，用冷浸法提取。根据以上研究的最佳提取工艺，即,60,的纯粮食酒、料液比,1:10,、浸提时,间为,20,天，按照加工流程进行操作，最终得到短柄五加祛风湿药酒。本试验主要研究短柄五加茎皮祛风湿酒的加工工艺，五加茎皮祛风湿药酒理论上对风湿病有一定的治疗效果。但由于实验条件和时间的关系，未能对其治疗效果进行临床验证，其药理作用还有待进一步的验证。,参考文献,:,1,楼之岑，秦波,.,常用中药材品种整理和质量研究北方编,.,第,1,册,M.,北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，,1995:671.2,黑龙江省中医研究院主编,.,中国刺五加,M.,第,1,版,.,黑龙江：黑龙江人民出版社，,1987,：,231.3,郭小强,.,甘肃陇东地区野生药用植物资源及开发建议,J.,甘肃农业科技，,2004,，（,2,）：,49,51.4,甘肃省食品药品监督管理局主编,.,甘肃中药材标准,M.,第,1,版,.,甘肃：甘肃文化出版社，,2009,：,59,61.5 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