消毒剂使用及效力验证.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,消毒剂的使用及效力验证,概述,清洁和消毒工艺的监控与评价是良好的微生物控制系统的体现，药品不仅在生产过程中会遭到微生物的污染，在检验过程中也会被污染，除非生产和实验室设施的微生物污染处于受控制状态或者完全被消除（如采用隔离技术）。,破坏细菌营养体（细胞）或抑制细菌生长（细胞增殖）是控制微生物生长繁殖的两种最基本方法。而在实际的控制过程中，可采取物理方法、化学方法来控制或处理。,习惯上，我们将能够杀灭或抑制微生物生长的试剂（通常不能杀死芽孢）统称为消毒剂，而这种方法与措施称之为毒。能杀灭所有微生物含杀死芽孢的方法与措施称之为灭菌。,一、消毒剂与灭菌剂的划分,二、微生物对消毒因子的敏感性,三、消毒剂的效力等级与消毒效力评价,四、影响消毒剂效力的主要因素,五、消毒剂的作用方式,六、细菌对消毒剂的耐受性,七、消毒剂的选择和交替使用,八、制药工业常用的消毒剂,九、消毒剂的效力确认,十、消毒剂稀释液的效期确认,十一、培训和安全教育,一、消毒剂与灭菌剂的划分,卫生处理（sanitization）是指用化学试剂减少活性微生物数量的过程。用于卫生处理的化学试剂称为卫生洗涤剂（sanitizers）。,（一）、卫生处理与卫生洗涤剂,普通微生物细胞,5,个对数单位,（,99.999%,）,致病微生物细胞,30s,3,个对数单位,（,99.9%,）,卫生洗涤剂不能杀灭芽胞，并且在土壤存在的条件下不能杀灭活性微生物。,(二)、消毒剂及抗菌剂,消毒（disinfection）是指用化学试剂抑制或杀灭致病微生物的过程。消毒时所有的化学试剂称为消毒剂（disinfectant）,致病微生物数量,410min,5,个对数单位,（,99.999%,）,30s,3,个对数单位,（下降,99.9%,）,它不能杀灭芽胞和所有的病毒。消毒剂与卫生洗涤剂的主要区别在于，消毒剂具有更强的杀菌效果并且能杀灭致病微生物，土壤中亦能发挥杀菌作用。,常用消毒剂有70%乙醇或异丙醇溶液、0.040.1%新洁尔灭、3%过氧化氢溶液等。与消毒剂十分类似的另一种化学试剂叫抗菌剂（antiseptics），当用于对粘膜和皮肤消毒时，抗菌剂对粘膜和皮肤安全并且无害，这正是抗菌剂与消毒剂的主要区别所在。例如，0.05%碘伏溶液是一种常见的抗菌剂。,（三）、化学灭菌剂,灭菌（sterilization）是指用物理或化学手段完全杀灭或消除活性微生物的过程。从定义上来看，灭菌是一绝对概念，一件物品要么无菌，要么有菌。化学灭菌剂（sterilants）是指能够杀灭包括芽胞在内的一切污染性微生物的试剂。化学灭菌剂的腐蚀性很强，处理时务必要小心，注意安全。此类产品能损坏不锈钢、塑料和软金属。常见灭菌剂有：戊二醛、氧化性试剂（如环氧乙烷、过氧乙酸、过氧化氢、二氧化氯）和甲醛等。,返回,二、微生物对消毒因子的敏感性,(1)亲脂病毒(有脂质膜的病毒)，例如乙型肝炎病毒、流感病毒等。,(2)细菌繁殖体,例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等。,(3)真菌，例如白色念珠菌、黑曲霉等。,高,低,微生物对消毒因子的敏感性从高到低的顺序,(4)亲水病毒(没有脂质包膜的病毒)，例如甲型肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒等。,(5)分枝杆菌，例如结核分枝杆菌、龟分枝杆菌等。,(6)细菌芽孢，例如炭疽杆菌芽孢、枯草杆菌芽孢等。,(7)朊毒(感染性蛋白质)。,返回,三、消毒剂的效力等级与消毒效力评价,根据消毒剂对不同类别的微生物的杀灭效果，可将消毒剂分为三个级别：,高效消毒剂（HLD），可以杀灭一切细菌繁殖体(包括结核分枝杆菌)、病毒、真菌及其孢子等各种微生物，对细菌芽孢杀灭达到消毒效果的消毒剂；,中效消毒剂（ILD），可以杀灭和去除细菌芽孢以外的各种病原微生物的消毒剂，包括碘类消毒剂；,低效消毒剂（LLD），只能杀灭细菌繁殖体和亲脂病毒的消毒剂，包括单链季铵盐类(苯扎溴铵等)、双胍类消毒剂如氯己定等。(碘伏、碘酊等)、醇类、醇类和氯己定的复方、醇类和季铵盐(包括双链季铵盐)类化合物的复方、酚类等；低效消毒剂（LLD），,表41：依微生物类型确定消毒剂的效力等级,效力级别 细菌芽胞 细菌营养细胞 真菌 真菌孢子,低（LLD）,中（ILD）1 ,高（HLD）2 2,表示几乎没有或没有杀灭效果；+表示有相当杀灭效果；表示杀灭效果较温和；1某些中级消毒剂，如次氯酸盐，也能杀灭芽胞胞；像乙醇或酚类等其他消毒剂，则不能杀灭芽胞；2用高级消毒剂杀灭高数量的细菌芽胞或真菌孢子时，须延长其接触时间。,返回,四、影响消毒剂效力的主要因素 有许多因素可以影响消毒剂的消毒效果，了解影响消毒剂效力的主要因素，有助于在配制、贮存和使用过程中对消毒剂加以妥善正确处理，以确保其维持最强的杀菌效力。,(一)pH值,一是对消毒剂的作用,，可以改变其溶解度、离解程度和分子结构；,二是对微生物的影响,，大多数微生物能生长的,pH,值范围是,6,8,，,pH,值过高或过低对微生物的生长均有影响。,(二)温度 温度是影响消毒剂效力的另一重大因素，消毒速度一般随温度的升高而加快，但温度变化对各种消毒剂影响的大小不同。一般来说，如果温度按等差级数增加，则杀菌速度按几何级数增加,(三)有机物 有机物常以血清、血液、脓液、痰液、泥土、食物残渣、粪便、培养基成分等形式出现，其存在可干扰消毒剂的杀微生物作用，原因主要有两方面：(1)有机物在微生物的表面形成一层保护层，妨碍消毒剂与微生物的接触，或延迟消毒剂的作用，甚至使微生物逐渐产生对药物的适应性；(2)有机物可中和一部分消毒剂，消毒剂被有机物消耗后，则对微生物的作用浓度降低。,(四)表面活性剂和金属离子,大分子聚合物和非离子表面活性剂可以降低对羟基甲酸脂类和季铵盐类消毒剂的作用，在有吐温存在时，需要加大消毒剂的浓度。阴离子表面活性剂可以降低季铵盐类和洗必太的消毒作用，因此应注意不能将新洁尔灭等消毒剂与肥皂及阴离子洗涤剂合用。,金属离子的存在对消毒效果也有一定的影响，可以降低或增加消毒作用。在存在低浓度二价阳离子时，阴离子表面活性剂对葡萄球菌的抗菌作用加强，在存在Mg2+、Ca2+、Ba2+离子时，长链脂肪酸的杀菌作用大大降低。由于Mg2+、Ca2+离子对一些消毒剂的消毒效果有影响，所以目前在消毒学试验中广泛使用硬水，以便使研究的消毒剂在硬水地区也能使用。,/,(五)水,消毒剂配制用水的质量会影响消毒剂的杀菌效力。水的硬度、微生物和化学物质均会对消毒剂的效力产生不良影响，因此，建议用纯化水配制消毒剂；由于消毒剂达的稳定性和杀菌效力会随其浓度和储藏条件而变化，因此，使用者必须按照生产商的要求配制、储存和使用消毒剂。,返回,五、消毒剂的作用方式,杀菌剂的杀菌效力是多个因素作用的结果，既包括消毒剂本身的作用，也包括待清洁表面所含有的微生物数量和总类。通常应考虑的主要因素是消毒剂是否易于杀灭营养态的细菌细胞或是否能杀灭对消毒剂具有着很强耐受力的芽胞。另一个必须要考虑并需强调的因素是在细菌存在的地方是否还有其他物质存在，如血，粪便和有机物等。这些污染物的存在指示了该表面并不清洁，并且能够迅速钝化一些杀菌剂，减弱它们的效力，如次氯酸盐等。,然而，从消毒剂本身的作用来看，杀菌剂既可通过袭击细菌细胞的某一特殊部位而发生作用，也可通过破坏它的某一组分来挥发作用。根据它们对细菌的作用方式，可把消毒剂分为以下四类：,（一）、使菌细胞蛋白变性、凝固 如重金属盐类、酸、碱等化学消毒剂，可以破坏蛋白质的结构，也就是使生物蛋白质变性，同时就意味着蛋白质的生物学功能丧失。蛋白凝固变性，丧失了生命力，自然就会死亡。细菌含大量蛋白质，蛋白质的变性导致细菌结构的破坏和功能的丧失，最后导致细菌的死亡。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,（三）、阻断食物摄取和废物排泄,某些杀菌剂，如季铵盐类化合物，它们在水溶液中带正电荷，能把自己附着在细胞膜上的某个特殊位置，攻击细胞上带负电荷的部分，最终的结果是季铵盐基团阻断了营养物质运输到细胞内，并阻止了堆积在细胞内的废物向外排泄。实际效果是，细胞饥饿死亡和被细胞内堆积的废物毒死。,（二）、破坏与损伤细胞膜类,杀菌剂，如次氯酸钠和过氧乙酸，它们都是强氧化剂，能够引起细胞膜的全面破坏，导致细胞内的关键功能结构流失，这个过程导致了细胞的真正死亡。,（四）、钝化关键酶类,酶是一切生物的活性催化剂，细胞的生长和为细胞生长和裂殖提供能量的代谢活动都和细胞内的一些酶活性有关，这些酶能够支持细胞的生长和代谢活动（代谢能够提供给细胞生长和裂殖提供能量）。一些消毒剂，如苯芬酚，酚醛类等，它们能够进入细胞内并和某些关键酶发生化学反应，从而使酶活性丧失，导致细菌的生长和代谢受阻，然而假如钝化作用不够完全，酶活性有可能会被修复，这样受伤的细菌在几个小时以后能够恢复生长能力并重新污染表面。,返回,六 细菌对消毒剂的耐受性,当细菌细胞暴露于消毒剂中时,细胞中的多种结构就会受到不可逆转的损害。细菌细胞增殖能力的永远丧失通常就被称为是微生物死亡。但是在消毒过程中，一些细菌细胞往往能够乃受消毒剂的作用，尽管它们的增殖能力能够暂时丧失，但是过一段时间之后，它们的增殖能力又会恢复，从而使消毒过程无效。细菌产生对消毒剂的耐受性与多种因素有关，细菌对消毒剂产生耐受性的方式是：,（一）具耐受性的细菌和不能完全致死的消毒剂剂量,在一特定的群体中，细菌对于某一特定的消毒剂剂量敏感范围很宽。在正常的接触条件下，消毒剂能够杀灭99.999%的细菌。从本质上讲，清洁前含1 000 000/cm2 的个细菌的表面有望在消毒后仅含10个细菌。在这个假想的条件下，细菌数量减至了安全水平，达到了消毒过程目的。问题在于10个耐受住了消毒程序的残存菌，会成为再次污染的潜在因素。对表面进行充分的润洗，那么这10个残存菌会耐受住第二个消毒过程而残存下来，其他种类的细菌也会发生这个过程。过了一段时间并经历了几次消毒和清洁过程之后，具有了耐受力的残存者们有能力进行增殖。当这个过程发生以后，工厂就得重新寻找办法处理那些对这种杀菌剂已经不再有反应的细菌。,(二)分泌多聚糖样物质粘附细菌，共同形成生物膜,生物膜的形成是细菌耐受消毒剂的另一种机制，正如前面所指出那样，有效清毒之前必须要进行正确清洁。某些细菌能分泌一种多聚糖样的物质，这种多聚糖组成了一层薄膜。这些分泌物有着很强的粘性，能把细菌本身牢固地粘附在金属上面。这样就形成了一层含有细菌的膜，也就是我们所指的生物膜。形成生物膜的细菌本身也许是无害的或者不是病原菌，然而，由它们的分泌物形成的凝胶矩阵却能够把它们自己粘附牢并且能够把病原菌包埋其中，如李斯特菌。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,尽管这些病原菌对于生物膜的形成没有任何作用，然而它们却能污染和该表面接触的产品。,凝胶矩阵对于化学去除剂有着非常好的耐受性，因此生物膜一旦形成就难于去除生物膜，通常需要高于正常浓度的碱试剂或是具有强氧化性的次氯酸钠才能奏效，而完全失去除生物膜通常需要几种方法并用。,（三）、清洁剂之间的交互作用,大部分清洁剂既含有非离子型的表面活性剂（乳化剂和清洁剂），也含有阴离子型的表面活性剂或者是两者组合成的混合物。在溶液中，非离子型的表面活性剂电性为中，但是阴离子型的表面活性剂却带有负电荷。当该清洁剂被直接用于含有土壤的表面上时，大部分效力在1520 min之内耗尽。然而，极少量消毒剂，也就是那些在水溶液中呈现阴离子状态并最先作用于表面的消毒剂成分却留在了表面上。,在施用季铵盐类消毒剂之前，假如该表面没有被充分润洗，那么带正电荷的季铵基团就会带负电荷的残留消毒剂发生中和反应，这些消毒剂就会被完全钝化，形成了阴离子-季铵基团复合物或无杀菌作用的膜，消毒剂完全丧失了效力，更有甚者，在形成的季铵盐复合膜中也会含有一些利于细菌生长的营养物质。假如没有仔细检查，这样的符合物实际上就能支持细菌的裂殖.,返回,七、消毒剂的选择和交替使用,理想消毒剂的7条标准是：杀菌谱广，作用快速；性能稳定，便于储存和运输；无毒无味，无刺激，无致畸、致癌、致突变作用；易溶于水，不着色，易去除，不污染环境；不易燃易爆，使用安全；受有机物、酸碱和环境因素影响小；作用浓度低，使用方便，价格低廉。,选择消毒剂时务必考虑以下因素：需消毒表面与消毒剂本身的适应性、产品的完整性、人员的安全性、环境中微生物的菌群、消毒剂的使用方法频率等。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,另一个重要因素是消毒剂要交替使用。定期交替使用不同消毒剂是为了防止环境中的微生物因对同一种消毒剂产生抗性而影响实际的消毒效果。不得将非同种类的消毒剂联合或混合使用，否则，很可能会引发危险的或致命的化学反应并产生有毒化合物。,很多消毒剂在使用后都有残留，经过不断积累并给消毒效果造成不良影响。此外，残留于设备或设施的消毒剂会影响外观，使设备看上去很脏。因此，在消毒剂的使用过程中，应定期用纯水或乙醇为溶媒的试剂对有消毒剂残留物的设备/设施表面加以清洗。尤其是当交替使用的消毒剂的化学性质不兼容时，清洗就显得更加重要。有一些消毒剂的效力能被另一种消毒剂的残留物钝化（减弱杀菌效果），季铵盐类化合物和苯酚类化合物尤为如此。清洗用水或试剂在使用前要经过灭菌或除菌处理，以避免已被消毒过的表面因清洗而发生二次污染。,返回,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,八、制药工业常用的消毒剂,(一)醇类 醇类消毒剂具有悠久的历史，也有其重要的地位。短链脂肪醇具有快速杀灭微生物的作用，其杀菌效果属于中等水平，主要用于皮肤消毒，由于其价格低廉，无色，使用方便，所以得到了广泛的应用，并以乙醇为最好，其次是异丙醇。,机理主要是使微生物的蛋白质变性，而且乙醇具有很强的渗透作用，比较容易渗透到菌体内，使得细菌细胞破坏溶解，乙醇还可通过抑制细菌物酶系统，特别是脱氢酶和氧化酶等，阻碍细菌的正常代谢，从而抑制其生长繁殖。,在没有水的情况下，蛋白质不易被变性，因此，加入一些水会使杀菌效力更佳，70%(w/w)乙醇比其他浓度的乙醇更为有效，实际上70%(W/W)的浓度相当于77%(V/V)的浓度，为配制方便起见，可改为80%(V/V)或75%(V/V)的浓度，大部分药厂都用75%(V/V)的乙醇或异丙醇来消毒工作台面、物料和操作者手套。以乙醇为基质的化合物被制药企业普遍使用是因为它们蒸发后没有任何残留。乙醇能够迅速杀灭细菌繁殖体，在较高体积分数(80%)时，具有很好的杀病毒作用，乙醇对真菌也有抑制和杀灭作用。然而，乙醇的杀菌效力是有限的，特别是它对从人体表面散发到环境中的一些微生物的消毒效果并不理想，乙醇只能够抑制细菌芽孢发芽，但并不能杀灭芽孢，并且乳胶手套上的微孔会削弱乙醇类消毒剂的杀菌效力。要想使洁净区内微生物得到有效控制，务必要使用比乙醇消毒效力更强的消毒剂与乙醇消毒剂交替轮换使用。,由于乙醇易挥发且易燃，在实验室要按照易燃易爆物品的保管要求予以保存。,(二)酚类化合物 酚类消毒剂是消毒剂中种类较多的一类，而且其使用已有一百多年的历史了。此类化合物的抑菌谱很广，包括对G细菌和G细菌以及真菌均有杀伤作用。酚类消毒剂适宜用水溶液或含乙醇的水溶液配制，多数产品的使用有效浓度为400百万分之一到1300百万分之一之间。酚类化合物对芽孢的杀伤力不强，不宜用作杀芽孢剂。酚类化合物对有机物具有较好的耐受性，但水中钙镁离子会降低其杀菌效果。酚类消毒剂会产生残留物，但能被生物降解，该特性对环境保护、废物处理和生态环境的影响非常重要，研究表明，所有的酚类化合物都能被生活在土壤、堆肥和废水池中的某些微生物降解。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,目前，在制药业使用最多的酚类消毒剂主要有两种，即酸性酚类消毒剂和碱性酚类消毒剂。国内较常用的酚类消毒剂是煤酚皂溶液(liquid of cresol with soap)又称为来苏尔(Lysol)，其主要成分是甲酚，约占50%，其他成分是植物油、氢氧化钠等，经皂化作用制成。酚类消毒剂适用于消毒地面、墙壁以及那些不与药品接触的表面，它们对人体的毒性较低并且对多数材料的腐蚀性也相对较小。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,(三)季铵盐类化合物,季铵盐类化合物是一类阳离子表面活性剂，季铵盐消毒剂在低浓度下即有抑菌作用，较高浓度时可杀灭大多数种类的细菌繁殖体和部分病毒，但不能杀灭细菌芽孢，属低效消毒剂。季铵盐类消毒剂因其性质稳定、易于贮存、毒性腐蚀性较小、刺激性小，被广泛应用，目前，大约有30%的制药公司使用季铵盐类消毒剂，新洁尔灭（苯扎溴铵）是一种常见的季铵盐类消毒剂。这类消毒剂的杀菌效力会被肥皂、阴离子型去污剂和有机物钝化，会因产生泡沫而引发一些问题。如果季铵盐类消毒剂的配制水中含菌量过高，那么其消毒效力就会被削弱。由于季铵盐类消毒剂对G细菌（包括绿脓杆菌）的杀伤力较差，G细菌不仅可在此类消毒剂中存活，而且可能增殖，,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,因此，通常需要在这类产品中加入表面活性剂EDTA以增强其杀伤效力，季铵盐类消毒剂也不能杀细菌芽孢和真菌孢子，尽管它在液态下很稳定，但是，使用液在配制后的34个星期即变得不稳定。,(四)液体灭菌剂和杀芽孢剂 有些化学试剂在高浓度下延长消毒时间就能将芽孢或真菌孢子杀灭。可用作杀芽孢或孢子的消毒剂有二氧化氯、戊二醛、甲醛、过氧化氢、过氧乙酸、次氯酸钠等。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,表42：液体消毒剂的杀菌效力等级表,类型 常用浓度 消毒效力 酚类 0.4%0.3%中效,季铵盐类 0.1%0.2%低效,醇类（乙醇、异丙醇）75%中效,戊二醛 2%高效,甲醛 1%8%高效,次氯酸钠 10002000百万分之一 高效,过氧化氢 3%6%高效,过氧乙酸 0.2%0.5%高效,二氧化氯 10250百万分之一 高效,返回,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,九、消毒剂的效力确认,作为使用者，每个公司都应当为消毒剂在各种不同的使用条件下的消毒效果进行评价，因为消毒剂的杀菌效果会受到被消毒表面的类型、与被消毒的接触时间以及相关设施中的微生物种群的影响。消毒剂的生产供应商常用从环境中分离的常见微生物做效力评价测试，而这些实验菌株可能与用户实际环境中的微生物有较大差别。因此，制药企业还应当用从自己环境中分离的微生物来测定消毒剂对这些微生物的杀灭效果。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,（一）、确认时需要考虑的因素,在消毒确认试验的准备过程中，企业应考虑以下几个方面的问题：(1)基于消毒剂本身的消毒能力进行评价。(2)选择合适的试验方案。(3)审计生产/供应商。,对于消毒效力已被得到公认的消毒剂而言。选取适当的试验方法和挑战菌株是非常重要的。例如，某种消毒剂已被认为是低效力的并且不能杀灭芽胞，那么，就不能将枯草芽胞杆菌作为该消毒剂效力测试的试验菌株。,由于没有特定的测试方法要求的测定方法，不同企业可采用不同的实验方案。试验方案要与自身的消毒表面类型以及环境中的微生物种群相结合。理想的做法是将试验方案分为实验室考察现场考察两部分。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,二、现场考察,现场考察试验用以评估消毒剂对相应设施的实际消毒效力。此类试验是通过监测清洁/消毒前、后的环境微生物学质量进行的。经历一段时间后才能积累用以评估消毒和清洁程序的数据（建议至少3次试验）。为了获得更好的评价结果，可以在最差条件下（如预防性维修之后）检测环境的污染状况，因为此时环境中的微生物种类和数量有上升的潜在可能性。一般说来，试验方法要求，在清洁后环境中微生物数量应控制在警戒限度以内。尽管消毒剂效力确认试验的完整性。,三、实验室考察,实验室对消毒剂的杀菌效力测定方法通常是参照美国政府农业化学师学会（AOAC）制定的消毒剂效力测定法。用于消毒剂效力测试的标准方法见AOAC Official Method 960.09”Germicidal and Detergent Sanitizing Action of Disinfectants”；用于灭菌剂或杀芽孢剂效力测试的标准方法见Method 966.04”Sporicidal Activity of Disinfectants”。当然，有时限于实验室的实际实验条件，可以对标准方法做适当的调整和修改。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,美国政府农业化学师学会(AOAC)方法建议使用铜绿假单胞菌（ATTCC 15442）金黄色葡萄球菌（ATCC 6538）和沙门菌（ATCC 10708）作为挑战菌，为了对消毒剂进行更充分的评估，还可增加一些试验菌，如大肠杆菌（ATCC 8739）白色念珠菌（ATCC 1031）黑曲菌（ATCC 16404）枯草牙胞杆菌（ATCC 6633）以及控制性环境中的主要分离菌等。当然，亦可用CMCC系列菌种测试消毒剂的杀菌效力。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,在我国，消毒剂的效力验证还可以参照中华人民共和国国家标准GB15981-1995消毒与灭菌效果的评价方法与标准以及中华人民共和国卫生部的消毒技术规范。通常建议使用金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538作为细菌繁殖体中化脓性球菌的代表；大肠杆菌（Escherichia coli）8099作为细菌繁殖体中肠道菌的代表；白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）8032作为空气中细菌的代表；龟分枝杆菌脓肿亚种（Mycobacterium chelonae subsp.abscessus）ATCC 93326作为人结核分枝杆菌的代表；枯草杆菌黑色变种芽孢(Bacillus subtilis var.niger)ATCC 9372作为细菌芽孢的代表；白色念珠菌（Candida albicans）ATCC 10231和黑曲霉菌（Aspergillus niger）ATCC 16404作为致病性真菌的代表；脊髓灰质炎病毒-I型疫苗株(Poliovirus-I)作为病毒的代表。在此基础上，根据消毒剂特定的用途或试验特殊需要，还可增选其他菌、毒株。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,(四)定量悬浮试验 定量悬浮试验是评价消毒剂杀菌效果常用的一种定量试验方法。,1.试验原理 将定量的指示菌悬液加入消毒剂溶液中，作用一定时间。经中和剂去除残留的消毒剂影响后，定量接种于平皿上，倾注培养基，经培养后计算其菌落数。与未经消毒剂作用的对照菌液平皿计数相比较，计算出杀菌率。,2.试验器材 试验菌种、培养基、中和剂、稀释液、电动混合器、秒表、刻度吸管、恒温水浴箱。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,3.试验步骤 (1)用无菌蒸馏水或磷酸盐缓冲液配制试验用菌悬液，浓度为11085108CFU/ml。(2)将消毒剂用蒸馏水稀释至待测浓度，置201水浴备用。(3)吸取试验菌液0.5ml，加入含消毒剂溶液4.5ml的试管中，迅速混匀并立即计时。(4)待试验菌液与消毒剂相互作用至预定时间，吸取0.5ml菌药混合液，加入4.5ml经灭菌的中和剂中，迅速混匀。(5)中和10 min后，进行系列10倍稀释，分别吸取1.0ml样液（原液、稀释液），按活菌培养计数方法测定存活菌数，每管样液接种2个平皿。(6)同时用稀释液代替消毒液，进行平行试验，作为阳性对照。(7)细菌营养体试验样本在37温箱培养48 h，观察最终结果；细菌芽孢试验样本在37温箱培养72 h，观察最终结果；真菌试验样本在30温箱培养4872 h，观察最终结果。(8)试验重复3次，计算各组的活菌数，计算杀菌率。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,细菌悬液,（,10,7,cfu/ml,）对照管,0.5ml,0.5ml,消毒液,稀释液,4.5ml,4.5ml,（预定时间）,0.5ml,0.5ml,4.5ml,中和剂,4.5ml,（中和,10min,）,1ml,1ml,1ml 1ml 1ml,1ml 1ml,1ml,9ml 9ml 9ml,稀释液,9ml 9ml 9ml,1ml 1ml 1ml,1ml 1ml 1ml,10,0,10,3,10,2,10,1,10,1,10,2,10,3,10,0,定量悬浮试验示意图,定量悬浮试验示意图,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,定量悬浮试验不仅用于常规消毒效果测定，也可用于消毒剂的杀菌作用及其影响因素的试验。消毒剂浓度、作用时间、试验菌株以及是否加入有机物等可根据试验目的设计。,4.消毒效力评价 一般采用杀菌率表示消毒剂杀菌能力。,杀菌率（对照组平均活菌数-试验组活菌数）对照组平均活菌数100,同时亦有用平均杀菌率及95可信限表示。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,例1：如某消毒剂进行的定量悬浮试验得出以下（表43）试验结果，求其杀菌率是多少？,表：43 定量悬浮试验结果,对照管 试验管,生长菌落数 生长菌落数,原液 无法计数 无法计数,101 无法计数 88,102 无法计数 6,193 110 0,杀菌率（对照组平均活菌数-试验组活菌数）对照组平均活菌数100,(110000880)110000 100992,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,例2：某消毒剂消毒前菌数为400000ml，消毒后两次试验101稀释液生长菌落数分别为38和34ml，求其平均杀菌率及95可信限。,m(38+34)/210360,poisson分布的均数等于方差，当均数（m）增加到k倍时，方差（2）增加k2倍，Sm m/n k2,代入公式Sm m/n.k2,36/2 102,424,式中Sm为标准误，m为均数，n为样品数。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,消毒后菌数（m）95可信区间mtSm,36019642.4/ml277443/ml,杀菌率的95可信限消毒前菌数消毒后菌数消毒前菌数,(400000443)/400000(400000277)/400000,0998909993,答：该消毒剂的杀菌率为42.4；杀菌率的95可信限为0.99890.9993。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,(五)载体浸泡定量试验,1.试验原理 原理与定量悬浮试验相类似，本试验先将指示菌悬液定量接种到载体上，再将载体加入到消毒剂中作用至约定时间后，把载体取出加入中和剂内中和，定量接种于平皿上，倾注培养基，经培养后计算其菌落数。与未经消毒剂作用的对照菌液平皿计数相比较，计算出杀菌率。,2.试验器材 试验菌种、载体、培养基、中和剂、稀释液、电动混合器、秒表、刻度吸管、恒温水浴箱。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,3.试验步骤,(1)用无菌蒸馏水或磷酸盐缓冲液配制试验用菌悬液，浓度为11085108CFU/ml。(2)用相应方法将载体染菌（滴染法、浸染法、喷染法等），每片载体回收菌数应为51055106CFU/片（按活菌培养计数所得结果），染菌载体可置37温箱内干燥备用。(3)将消毒剂用蒸馏水稀释至待测浓度，置201水浴备用。(4)按每片5.0ml的量吸取消毒剂注入无菌小平皿中，用无菌镊子取3片预先制备的菌片放入平皿中，并使之浸透于消毒液中。(5)待菌药相互作用至约定时间，用无菌镊子将菌片取出分别移入含5.0ml中和剂试管中。用电动混合器混合20 s，使菌片上的菌体被洗脱进入中和液中，再放置5 min 以上，使中和作用充分。最终进一步混匀后，进行系列10倍稀释，分别吸取1.0ml样液（原液、稀释液）接种平皿，每管接种2个平皿，测定存活菌数。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,6)另取一平皿，注入10.0ml稀释液代替消毒液，加入2片菌片，作为阳性对照组。其随后的试验步骤和活菌培养计数与上述试验组相同。(7)细菌营养体试验样本在37温箱培养48 h，观察最终结果；细菌芽孢试验样本在37温箱培养72 h，观察最终结果；真菌试验样本在30温箱培养4872 h，观察最终结果。(8)试验重复3次，计算各组的活菌数，计算杀菌率,计算公式同定量悬浮试验。,返回,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,十、消毒剂稀释液的效期确认,假如企业配制了消毒剂以备将来使用，那就必须证明该稀释过的消毒液在储藏期间是稳定的并且杀菌效力不变。此类确认实验务必要考虑供应相关消毒剂的使用、配制和储藏方面的建议。一般说来，在确认消毒剂的有效期时，总是将配制目的消毒效力测定结果与预定效期日的效力检测结果作对比性评价。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,多采用工作液直接接种法或载体试验法确认消毒剂的效期。,为了确定消毒液在有效期依然有效，试验结果应证明，在有效期末的消毒剂工作液能使细菌的活细胞的下降数量不低于3-5个对数单位；对杀孢子剂而言，消毒剂的工作液应能使芽孢的下降数量不低于3-4个对数单位。,用于消毒液效期确认的试验方法须经过验证。,返回,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,很多化学消毒剂的有效成分是易于分解或挥发的，因此，制药工业对消毒剂的使用和确认已经并越来越引起法规部门的重视，制药企业也越来越意识到验证清洁/消毒程序的必要性。然而，在验证方法的选择上依然有很多灵活性，并且在多数情况下都是依照自己的实际条件来制定测试方法。最好是将实验室考察与现场考察相结合。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,研究表明，Letheen 肉汤(含%大豆卵磷脂和0.7%聚山梨酯)适用于中和酚类和季铵盐类消毒剂,硫代硫酸钠(常用浓度0.5%)适用于中和次氯酸盐类消毒剂,其他的氧化性试剂可用硫乙醇酸盐液体培养基中和。,此外，企业还应重视清洁/消毒方案的变更管理。经常评估清洁/消毒程序并将环境监测数据作趋势分析。最好每年进行一次回顾总结，以确保是否需要进行额外的培训、确认试验和清洁消毒方案的修订等。,返回,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,各企业必须对员工进行消毒剂的管理规程培训和安全教育，可通过定期或不定期的不断培训与进行教育，以确保操作人员了解这些知识，并能在工作中正确执行。同时确保在消毒剂的使用现场有消毒剂的管理规程（SOP），内容应包括配制、贮存、使用、以及使用后的废液处理等，此外，限制性地合理使用消毒剂。不仅确保安全而且也会降低成本。,十一、培训和安全教育,返回,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,十二、消毒剂消毒效果验证实验（定量悬浮试验）实例,(一)验证原理 将定量的指示菌悬液加入消毒剂溶液中，作用一定时间。经中和剂去除残留的消毒剂影响后，定量接种于平皿上，倾注培养基，经培养后计算其菌落数。与未经消毒剂作用的对照菌液平皿计数相比较，计算出杀菌率，以评估消毒剂的杀菌效力。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,(二)验证材料,(1)消毒剂：结合工厂实际自选。(2)指示菌：大肠杆菌（Escherichia coli）8099；金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538；枯草杆菌黑色变种芽孢(Bacillus subtilis var.niger)ATCC 9372；白色念珠菌（Candida albicans）ATCC 10231。(3)培养基:营养琼脂培养基、营养肉汤培养基。(4)中和剂：1的卵磷脂；1的卵磷脂01聚山犁酸80；硫代硫酸钠（5)稀释液:无菌蒸馏水或磷酸盐缓冲液(PBS)。(6)电动混合器。(7)恒温水浴箱。(8)秒表。(9)分度吸管及试管等。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,(三)验证方法（定量悬浮试验）,指示菌（细菌繁殖体）悬液的制备（1）取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适量营养肉汤，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5.010.0ml营养肉汤培养基试管，滴入少许菌种悬液，置37培养1824 h。用接种环取第一代培养的菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基平板上，于37培养1824 h。挑取上述第二代培养物中典型菌落，接种于营养琼脂斜面，于37培养1824 h，即为第三代培养物。,（2）取菌种第三代第四代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物（1824 h），用5.0ml吸管吸取3.05.0ml稀释液加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔。随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合20s，使细菌悬液均匀。,（3）初步制成的菌悬液，先用细菌浓度比浊测定法粗测其含菌浓度，然后以稀释液稀释至所需使用的浓度。（4）细菌繁殖体悬液应保存在4冰箱内备用。应当天使用不得过夜。（5）怀疑有污染时，应以菌落形态、革兰染色与生化试验等方法进行鉴定。,2.中和剂鉴定试验（1）目的观察所用中和剂是否对测试消毒剂有良好的中和作用，对试验用细菌以及其恢复期培养是否有害或不良影响。,资料整理金田瑞麟 净化设备 空气过滤器 净化工程 风淋室 高效空气过滤器 初效过滤器 空调过滤器 风淋室 FFU风机过滤单元,（2）试验分组,第1组：消毒剂菌悬液培养 观察消毒剂对试验菌有无杀灭或抑制能力。,第2组：（消毒剂菌悬液）中和剂培养观察残留消毒剂被中和后受到消毒剂作用