发酵产物的提取与精制.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,本课内容,发酵产物的提取与精制,固液分离,菌体破碎,产物的分离提取,产品的成品化处理,无菌处理,干燥、浓缩,冷藏保存,发酵工程,发酵工程可分成三个部分：,上游工程,：,优良菌株的选育、制作,最适发酵条件的确定：,pH,、温度、溶氧、营养成分,培养基的制备,发酵,：,培养基、发酵罐、空气的灭菌,生产过程中的加料、实时监测、计算机自动控制,下游工程,：,固液分离、细胞破碎,目标产物的分离、纯化,废液处理,产品的精制、包装,生物产品的分离纯化,与普通的化学工业产品不同，发酵产品多数是与人类生命直接相关的食品、药品，对安全性、纯度的要求较高。,必须使用与普通化学工艺不同的分离纯化方法，以有效获得高纯度的产品。,所以发酵工业生产对下游加工过程有着特殊的要求，并且占据了大部分的生产成本（,5070%,）。,此外，随着生物工业的快速发展，废水污染问题也越来越突出，为了可持续发展，清洁生产已是一个重要的要求。,发酵下游加工过程的特点,产品种类繁多：,有乙醇、氨基酸等小分子物质，也有酶、蛋白质等生物大分子。,小分子产品稳定性好，分离技术可选范围较宽，大分子稳定性差，制约了下游技术的选择范围。,产物浓度低,：尽管可以利用基因工程改造而获得高产菌株，但是在生产中，多数目的物在发酵液中仍然以很低的浓度存在（如,Ile,，,2.4%,；胰岛素，几十毫克,/,千克）。,一般情况下，浓度越低，提取成本越高；步骤越多，提取收率就越低。,发酵下游加工过程的特点,杂质多,：发酵液中含有大量可溶性和不溶性的杂质，种类多，含量高，给下游加工过程带来困难。,活性易丢失,：许多生物产品一旦离开生物体活性很容易被破坏，特别是酶、蛋白质类的产品，对分离提取过程中的条件特别敏感，往往使能够采用的方法十分受限。,质量波动大,：由于生物的某些不确定因素，不同批次发酵液中产物的收率和质量会有很大波动，因而要求下游技术的适用面要宽，操作弹性要大。,安全要求高,：特别是药品、食品，必须完全除去有害物质、热原,(pyrogen),以及来源于原材料或培养基的异种蛋白质、病毒颗粒与核酸。,生物产品分离的一般流程,发酵液,预处理,固液分离,细胞破碎,产物的粗分离,精制,成品制作,加热、调,pH,、絮凝,离心、过滤,机械法、酶解法,浓缩、沉淀、吸附、萃取、超滤,层析法、结晶,浓缩、干燥、杀菌,发酵液的预处理,降低黏度,：发酵液的黏度大，使下面的过滤步骤速度很慢。通过加水稀释（啤酒、黄酒、酱油等）或加热（如链霉素，,70,半小时），可使黏度大大下降，过滤速率增大许多倍。,调整,pH,：能影响某些成分的表面电荷性质和电离度，改善发酵液的过滤特性（,Lys,，,pH4.0,）。,凝聚与絮凝,：向发酵液中添加化学药剂（电解质、絮凝剂），改变菌体细胞及蛋白质等胶体粒子的分散状态，使其凝结成较大颗粒，有利于过滤。,固液分离,首先要将发酵液中的菌体和液体进行分离，方法有两种：基于密度差的离心法和基于颗粒直径大小的过滤法。,离心法,：利用高速转动产生的离心力分离液体中的固体颗粒。优点是分离速率快、液相澄清度好，缺点是设备投资高、能耗大。,工业生产中应用最广泛的离心机是,碟片式离心机,，最大处理量达到,300m,3,/h,，适用于细菌、酵母菌等多种微生物细胞的大规模分离。,细胞内高分子,细胞外分泌产物,目标产物：细胞,离心,上清,缓冲液冲洗,离心,上清,脱水、干燥,离心,上清,纯化,或,离心,上清,或,细胞破碎,离心,上清,沉淀,纯化,包涵体,复性,破碎菌体,微生物的代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢物。此外细菌产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶等也分泌到细胞外。,但大多数酶、蛋白质、脂类和部分抗生素等都位于细胞内，要提取这些产物，首先必须将细胞破碎，使产物释放出来。,微生物细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，细胞壁的形状和强度取决于其组成以及它们之间相互交联的程度。细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高的是最难破碎的。,革兰氏阳性菌,革兰氏阴性菌,酵母菌,霉菌,壁厚,nm,2080,1013,100300,100250,层次,单层,多层,多层,多层,组成,肽聚糖（,40-90%,）；胞壁酸,肽聚糖（,5-10%,）；脂多糖,葡聚糖（,30-40%,）,多聚糖（,80-90%,）,肽聚糖,常用破碎方法,机械法,：,珠磨法,：细胞悬浮液在碾磨腔中与极细的玻璃珠（直径,1mm,）一起快速搅拌研磨，使细胞破碎。,高压破碎法,：利用高压（,55-70MPa,）使细胞悬浊液通过针型阀，造成细胞破碎。是大规模破碎细胞的常用方法，破碎速度快，破碎率高。,适用于大多数微生物，但丝状菌和较小的革兰氏阳性菌容易造成阀门堵塞，产生包涵体的基因工程菌易损伤匀浆阀。,非机械法,：条件温和，但破碎效率较低。,酶解法,：常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、壳多糖酶等。,产物分离方法,沉淀法,吸附法,膜分离法,层析法,结晶法,沉淀法,沉淀法是生物生产工艺最具代表性的分离纯化方法之一，是纯化的第一阶段,粗分离,时常用的方法。,沉淀法的本质是通过改变条件，使溶质分子或胶体颗粒在液相中的溶解度降低，分子发生聚集，从而达到分离、澄清、浓缩的目的。,优点：过程简单、成本低、原材料易得、便于小批量生产等。缺点：沉淀中杂质较多，产品纯度低，需重新精制。,沉淀法广泛用于抗生素、有机酸、蛋白质等的工业生产。,沉淀法,常用的沉淀法有：盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。,盐析法,：低浓度盐离子会使蛋白质的溶解度增大,盐溶；但是盐浓度继续增大时，蛋白质的溶解度开始降低，从溶液里沉淀析出,盐析。,通常是向蛋白质溶液中添加高浓度的,(NH,4,),2,SO,4,、,Na,2,SO,4,等无机盐，使蛋白质达到过饱和而析出。,盐析广泛地用于各类蛋白质和酶的初级纯化和浓缩。对杂质含量较高的发酵液，可采用反复盐析沉淀并结合其它沉淀法进行高度纯化。,沉淀法,有机溶剂沉淀法,：将能与水互溶的有机溶剂添加到蛋白质溶液中，蛋白质会沉淀析出。一般使用丙酮、乙醇，还可以用,DMSO,、异丙醇等。,其优点是沉淀不需进行脱盐处理，缺点是容易使蛋白质变性，并且溶剂的消耗量大，回收率低。,为了防止蛋白质变性，要在低温（,0,）下进行操作，温度越低，收率越高。,因为形成沉淀的推动力是蛋白质分子间的静电引力和偶极子的范德华力，所以溶液的,pH,值要控制在等电点附近（蛋白质分子间排斥力最小）。,吸附法,吸附,：用固体吸附剂处理液体或气体混合物，将其中所含的一种或几种组分吸附在固体表面，从而使混合物的组分彼此分离。,在生物产品的生产中，常用吸附剂进行脱色、脱臭、去热原、组胺等少量杂质，也用于蛋白质、核酸、抗生素等的分离。,优点：操作简便，设备简单；可不用或少用有机试剂；生产过程,pH,变化小；适用于稳定性较差的生物产物。,缺点：选择性差，得率不太高。,吸附法,常用的吸附剂包括有机类（活性炭、纤维素、合成树脂）和无机类（硅胶、氧化铝、氢氧化铝）。,活性炭,：多孔含碳物质的颗粒粉末，吸附力强，价格便宜（万能吸附剂）。常用于脱色、除臭，以及糖、氨基酸、多肽等的分离。,硅胶,：多孔的,SiO,2,，吸附性能高、热稳定性好、化学性质稳定、有较高的机械强度。可用于氨基酸、萜类、生物碱等的分离。,膜分离技术,膜分离,：利用具有选择透过性的薄膜，根据膜孔径的大小使物质透过或被截留，从而达到物质分离的目的。基本上是一个非常节省能量的过程。,方法,膜结构,应用,微孔过滤,0.0210,m,无菌过滤；细胞的分离浓缩,超滤,0.0010.02,m,蛋白、多糖等高分子的分离浓缩,纳米过滤,2nm,脱盐,反渗透,1nm,氨基酸等低分子物质的分离浓缩；海水淡化,透析,大分子溶液的脱盐,电渗析,氨基酸分离；去离子；海水淡化；废水处理,砂滤,微孔过滤,超滤,初筛,超滤,ultrafiltration,超滤在生物制品的浓缩和纯化中应用广泛：柠檬酸、抗生素、氨基酸、蛋白质。,滤膜,反渗透,RO,半透膜,污水,始态,终态,半透膜,渗透压,119.99 US$,膜分离技术,在生物工艺中，可以利用这些膜分离方法从分子大小大的物质开始，依次回收。,例如：从发酵液中制备分泌到菌体外的酶时，首先用微孔过滤除去培养液中的菌体和固体培养基成分，滤过液中含有蛋白质等高分子物质。,接着，将滤过液用超滤法处理，回收高分子物质。必要时，进一步用反渗透法从滤液中分离回收小分子物质。,层析技术,层析法,：是一种移动速度差分离法。被分离物质由于物理、化学和生物学特性的不同，在,流动相,和,固定相,之间的分配系数不同，导致它们的移动速度不同而彼此分离。,最大的特点是分离效率高，能分离各种性质极相类似的物质。在蛋白质类生物产品的高度分离纯化中发挥着重要作用。,层析法既能用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的纯化制备。,纸层析,柱层析,层析法,固定相,：是层析的基质，可以是固体或液体，能与待分离物质进行可逆的吸附。常用的材料有硅胶、琼脂糖、葡聚糖等。,流动相,：层析过程中推动固定相上待分离物质朝着一个方向移动的液体、气体等。称为洗脱剂。,不同的层析法主要利用分子的四种特性：,大小（分子量）：凝胶过滤层析,电荷性质：离子交换层析,生物学亲和性：亲和层析,疏水性质：疏水相互作用层析,层析法,疏水相互作用层析,：也称反相层析法。其固定相是非极性的，而流动相是极性的。,基质常是用,8C,或,18C,的烷烃链所修饰的二氧化硅，疏水性的分子会倾向于被吸附到疏水性的基质上，亲水性分子先被洗脱下来。,增加流动相的疏水性、降低盐浓度、增加去污剂都可以把疏水性的分子洗脱下来。,树脂颗粒,结晶法（晶析）,结晶是由分子规则排列形成的，晶析的目的是从溶液中以结晶形态回收目标产物。,生物制品如氨基酸、蛋白质、药品原药等，其最终产品形态多是在最后阶段通过晶析操作生产的晶体性粉末。,优良的晶体：纯度高、粒子半径较一致、容易过滤、保存稳定性好、流动性好。,胰岛素,上图：美国航天飞机和俄国空间站上所长出的蛋白质和病毒晶体，包括,canavalin,、,thaumatin,。,左图：不同的雪花，,Wilson Bentley,，,1902,J-STAR Research,Inc.,专门提供药物结晶流程的研究服务,API,：活性药物成分,客户品质保证,药物产品,生物利用率,有效性,安全性,晶体,纯度,固体形态：多态性，盐，水合物,颗粒大小分布、形态、密度、吸湿性、颜色,物理和化学稳定性,结晶法,为了使化合物以结晶状态析出，常常要使溶液过饱和。生物产品的晶析常用方法有：,冷却结晶法,：把在温度比较高的情况下饱和的溶液的温度降低，使其析出晶体。适用于溶解度随温度降低而明显降低的物质。,蒸发结晶法,：加热蒸发溶剂，使溶质过饱和而析出。,贫溶剂结晶法,：贫溶剂是指能与溶剂互溶，但却难以溶解目的物质的溶剂。向溶液中添加贫溶剂，可以使目的物质过饱和而析出。,反应结晶法,：如,Ca,2+,溶液和,CO,3,2-,溶液混合就会析出,CaCO,3,。,结晶法,选择晶体作为生物制品的最终产品形态是因为它们具有以下优点：,容易保证一定的产品纯度；,比液体等其他形态的化学、生物学稳定性高；,保存或使用方便。,另一方面，结晶法不仅仅是获得最终产品的手段，还是高效分离纯化目的产物的非常有用的方法。,结晶法与其它分离纯化方法相比具有下列优点：,结晶化过程中的分子识别是三维的，选择性高；,结晶法,目的物质的结晶本身就具有分离的功能，不需要吸附剂、膜等材料；,分离过程中目的物质不被稀释，最后得到固体；,可以在生理状态的温度、,pH,值下进行操作，适用于易分解的物质；,不需要特别复杂的设备。,所以晶析法在分离性能、能源消费、环境负担、设备投资等方面都是有利的。,生产中的晶析操作的对象一般是低、中分子量的有机物（氨基酸、多肽类），高分子的蛋白质结晶难，稳定性差。,结晶法,蛋白质纯化的主要步骤是层析法，但在实际生产过程中未必总是可以采用昂贵的层析法。,对于那些必须以低价格供应的酶，如洗涤剂用酶、食品加工用酶、酒精发酵中的淀粉酶、纤维素酶等，则要采取与药品不同的分离纯化战略。,结晶法可以在这里发挥重要的作用。如洗涤剂用的蛋白水解酶和枯草杆菌蛋白酶的结晶回收就是个很好的范例。,枯草杆菌蛋白酶：,Subtilisin,，来自,Bacillus subtilis,，一种非特异的,Ser,蛋白酶。,枯草杆菌蛋白酶的纯化流程,1st2,，,382aa,，,39kDa,发酵,固液分离,320g/L,subtilisin,超滤浓缩,40100g/L,晶析,洗净、压滤,产品,高收率、高可生产性、低成本,390,元,/,公斤,产品的无菌化处理,生物制品中如果混入微生物，可能导致腐败、变质、分解，甚至可能会危及人的生命。所以产品的无菌化处理是基本且必需的过程。,种类,目标,方法,杀菌,杀灭存在的所有微生物,加热,、,化学药剂,、紫外线、超声波、超高压、放射线、光脉冲、电脉冲,抑菌,抑制其生长和增殖,化学药剂,、低温、干燥、浓缩、真空、乳酸发酵,除菌,除去体系中的菌体颗粒,过滤,阻断,使产品与体系外微生物隔离,密封包装,干燥与浓缩,干燥：,是要制作固体产品，目的是为了贮存和运输方便，通过蒸发脱水达到容量减少，并使产品稳定性上升,稳定化,。,常用的干燥方法为加热和真空冷冻干燥（,-30,）。干燥时往往会发生许多不希望发生的变化，影响产物品质，需要严格选择方法并控制条件。,浓缩,：把稀溶液浓缩制成相应产品。加热、冷冻、晶析、超滤法都可以用于浓缩操作。,冷藏保存,冷藏保存的原理是依靠低温效果抑制化学反应和微生物生长，解冻后可以很好地恢复到原来的状态，是生物材料保存很好的方法。,一般在冷冻过程中，被冻的成分只是水，生成微细的冰晶，其它成分被浓缩。通过冷冻，食品中的水分活度降低。,此外，象蛋白质、酶的日常保存需要加入蔗糖、甘油等进行稳定化，主要是使凝固点下降，同时还能降低水的活度。,483,元,/100,g,