第三章污染物的生物效应检测.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第三章 污染物的生物效应检测,本章将讨论以下内容,生物测试及方式,一般毒性试验,生物的分子和细胞水平检测,生物致突变、致畸和致癌效应检测,第一节 生物测试及方式,一、生物测试（Bioassay）的概念：,指系统地利用,生物的反应,测定一种或多种污染物或环境因素单独或联合存在时所导致的影响或危害。,注释1：所利用的生物反应包括分子、细胞、组织、器官、个体、种群、群落、生态系统各级水平上的反应。,注释2：生物测试不同于常规的物理、化学检测。前者能够测定污染物对生物机体的影响，而后者只能测定污染物的浓度。,例如：通过水污染的生物测试可获得以下数据：各种环境因素如DO、pH、温度、混浊度等对生命的有利以及不利的浓度或强度；污染物对受测生物的毒性；各种水生生物对污染物的相对敏感性；废水所应处理的程度；允许的污染物排放浓度等。,（二）受试生物的选择,（1）对试验毒物或者因子要具有敏感性,（2）具有广泛的地理分布和足够的数量，并在全年中在某一区域范围内可获得,（3）是生态系统的重要组成，具有重大的生态价值,（4）在实验室内易于培养和繁殖,（5）具有丰富的生物学背景资料，人们已经清楚了解受试生物的生活史、生长、发育、生理代谢等等,（6）受试生物对试验毒物或因子的反应能够被测定，并具有一套标准的测定方法或技术,（7）受试生物应具有重要的经济价值和旅游价值，应考虑与人类食物链的联系。,影响生物测试结果的因素,受试生物：年龄，生活阶段，尺寸大小，季节等。,试验条件：温度，水质，水流速度等。,实验室差异：人员造作水平，仪器设备，统计分析方法。,（三）生物测试的标准化,（1）不同的实验室进行许多有用的测试并把一致的测试结果选择出来,（2）增加数据的准确性,（3）测试可以被其他实验室重复,（4）各种人员容易进行该试验,（5）可方便的将数据进行比较,（6）可为环境管理，环境立法提供可靠的数据或者结果,第二节 一般毒性试验,一、生物毒性的基本概念,毒物（Toxicant）的概念,任何能以较小剂量作用于机体，通过化学作用造成机体损害乃致死亡者，称毒物。,毒物与非毒物之间不存在绝对的界限，通常一种物质只有达到中毒,剂量,时才是毒物。,中毒（Intoxication）,生物体受到毒物作用引起功能或器质性改变后出现的疾病状态。,中毒是各种毒性作用的综合表现，包括急性中毒、亚急性中毒、慢性中毒。,毒性（Toxicity）,指一种物质引起机体损伤的能力。,毒性作用或毒效应（Toxic Effect）,剂量效应关系和剂量反应关系曲线图,剂量,100,50,反应强度（）,图31剂量反应曲线（直线型）,剂量,100,50,死亡率（）,图32 剂量反应曲线（抛物线型）,对数剂量,100,50,死亡率（）,图33 剂量反应曲线（S形线型）,死亡率（概率单位）,对数剂量,100,50,图34 剂量反应曲线,最大无作用剂量（Maximum Noeffect Level）：指化学物质在一定时间内，按一定方式与机体接触，用现代的检测方法和最灵敏的观察指标不能发现任何损害作用的最高剂量。与阈剂量一样，最大无作用剂量也不能通过试验获得。,每日容许摄入量（Acceptable Daily Intake）,最高容许浓度（Maximum Allowable Concentration）,毒作用带：是一种根据毒性和毒性作用特点综合评价外来化合物危险性的指标：,急性毒作用带（Acutetoxic Effect Zone）：又称一次作用带，是指半数致死浓度（剂量）与急性阈浓度之比值。该值与外来化合物一次作用的危害性成反比关系。急性毒作用带越宽，说明该化合物外来引起急性致死性中毒的危害性越小。,慢性毒作用带（Chronic toxic Effect Zone）：急性阈浓度（剂量，Limac）与慢性阈浓度（剂量，limch）之比值，以此表示外源性化合物的蓄积性及机体代偿能力。慢性毒作用带愈宽，Zch值愈大，说明该化合物引起慢性中毒的可能性就愈大。,半数效应浓度（EC,50,）：能引起50%受试生物的某种效应变化的浓度。通常指非死亡效应。,半数抑制浓度（IC,50,）：引起受试生物的某种效应50%抑制的浓度。,二、急性毒性试验（Acute Toxicity Test）,急性毒性试验（Acute Toxicity Test）,研究化学物质大剂量一次染毒或24小时内多次染毒动物所引起的毒性的试验。,其目的是短期内了解该物质的毒性大小和特点，并为进一步开展其他毒性试验提供设计依据。,急性毒性试验类型,哺乳动物急性毒性试验,水生生物急性毒性试验,蚯蚓急性毒性试验,动物急性毒性试验（1）,动物急性毒性试验方法如下：,按试验要求选择受试生物,常用成年大鼠或小鼠，雌雄动物同时试验，对试验动物预先观察几天后标记编号并随机分组。,预备试验和确定剂量组,选用少量动物进行预备试验，找出引起动物90（或全部）死亡的剂量（即最高剂量组剂量）和引起动物10死亡（或不死亡）的剂量（即最低剂量组剂量）。,在最高剂量组剂量和最低剂量组剂量的范围内，按等比级数插入若干个中间剂量（一般46组），从而确定正式试验的剂量组。,染毒方式和受试物的配制,一般用灌胃法和人工熏气法。,受试物的配制：配制试验所需的最高剂量浓度溶液，然后依次稀释到所需浓度。,动物急性毒性试验（2）,观察指标,中毒症状：一般观察2448小时，最好观察到绝大多数动物出现典型中毒症状。,动物死亡数目和死亡时间,病理检查：对于试验时立即死亡的动物，可解剖，分析死亡原因，看是技术事故还是中毒引起的死亡。,确定半数致死量（LD,50,）,试验结果,LD,50,值越小，毒性越大。,急性毒性试验结果只能粗略地表示某化学物质的毒性，而不能全面反映其毒性。,由于动物种属、性别、染毒方式的不同，所表现的毒性也不一致，故表示LD,50,应注释明动物种类和染毒方式。,2、实验动物的选择,亚慢性毒性作用研究一般要求选拔两种实验动物，一种为啮齿类，另一种为非啮齿类，如大鼠和狗，以便全面了解受试物的毒性特征。,由于亚慢性毒性试验期较长，所以选择被动物的体重(年龄)应较小，如小鼠应为15g左右，大鼠100g左右。,3、染毒途径,亚慢性毒性试验接触外来化合物途径的选择，应考虑两点：一是尽量模拟人类在环境中接触该化合物的途径或方式，二是应与预期进行慢性毒性试验的接触途径相一致。具体接触途径主要有经口、经呼吸道和经皮肤三种。,4、观察指标,（1）一般性指标,1）.一般综合性观察指标，这类指标是非特异性观察指标，它是外来化合物对机体毒性作用的综合性总体反映。,动物体重：实验动物在亚慢性方式接触外来化合物过程中，有多种因素均可影响动物体重的增长，包括食欲变化、消化功能变化、代谢和能量消耗变化等。体重变化的表示方式，可将接触组与对照组同期体重绝对增长的重量加以比较和统计学处理。也可将接触组与对照组同期体重百分增长率(以接触化合物开始时动物体重为100%)进行统计和比较。,食物利用率：亚慢性试验期间必须注意观察并记录动物的饮食情况，在此基础上计算食物利用率，即动物每食入100g饲料所增长的体重克数。分析比较接触组与对照组食物利用率，有助于分析受试化合物对实验动物的生物学效应。,2）一般化验指标主要指血象和肝、肾功能的检测，在亚慢性试验中研究外来化合物对实验动物的毒性作用，使用这类指标，一般为筛检性和探讨性。通常血象检测包括红细胞计数、白细胞计数和分类、血红蛋白定量等。肝、肾功能也是一种常规指标，如SGOT、SGPT、血清尿素氮、尿蛋白定性或定量、尿沉渣镜检等。,（2）病理学检查：亚慢毒性试验中应重视病理学检查。凡是在染毒过程中死亡的动物均应及时解剖，肉眼检查后再进行病理组织学检查。必要时作组织化学或电镜镜检。,（二）慢性毒性试验,1、概念：慢性毒性是指以低剂量外来化合物长期给予实验动物接触，观察其对实验动物所产生的毒性效应。,2、目的：慢性毒性试验是确定外来化合物的毒性下限，即长期接触该化合物可以引起机体危害的阈剂量和无作用剂量。为进行该化合物的危险性评价与制定人接触该化合物的安全限量标准提供毒理学依据，如最高容许浓度和每日容许摄入量等。,3、慢性毒性试验期限：一般认为工业毒理学慢性试验动物染毒6个月或更长时间；而环境毒理学与食品毒理学则要求实验动物染毒1年以上或2年。也有学者主张动物终生接触外来化合物才能全面反映外来化合物的慢性毒性效应，以及求出阈剂量或无作用剂量。,5、接触途径：慢性毒性试验多为经口与经呼吸道接触。经呼吸道接触，每日接触时间，依试验要求而定。工业毒物的试验通常每日吸入46小时。环境污染物一般要求每日吸入8小时或更长。,6、剂量的选择与分组：为制定外来化合物卫生标准而进行慢性毒性试验时，一般设3个染毒剂量组和1个对照组，必要时另设一个溶剂对照组，即无作用剂量组、阈剂量组、发生比较轻微毒性效应的剂量组(此为最高剂量组)。以求出明确的剂量反应关系。,染毒组剂量的选择可参考三组数据。一是以亚慢性阈剂量为出发点，即以亚慢性阈剂量或其1/5 1/2剂量为慢性毒性试验的最高剂量，以这一阈剂量的1/501/10为慢性毒性试验的预计阈剂量组，并以其1/100为预计的慢性无作用剂量组；一是以急性毒性的LD50剂量为出发点，即以LD50的1/10剂量为慢性试验的最高剂量。以LD50 的1/100为预计慢性阈剂量，以LD50 的1/1000为预计的无作用剂量组。各染毒剂量组之间的剂量间距应当大些，有利于求出剂量-反应关系，也有助于排除实验动物个体敏感性差异。组间剂量差一般以510倍为宜，最低不小于两倍。,7、观察指标,体重、食物摄取、临床症状、行为、血象和血液化学、尿的性状及生化成分以及重点观察在亚慢性毒性试验中已经显现的阳性指标。,注意三点：,一是试验前应对一些预计观察指标，尤其是血、尿常规及重点测定的生化指标进行正常值测定，废弃个体差异过大的动物；,二是在接触外来化合物期间进行动态观察的各项指标，应与对照组同步测定；,三是各化验测定方法应精确、可靠、且进行质量控制。,（二）试验方法,蓄积系数法：蓄积系数是指多次染毒使半数动物出现毒性效应的总有效剂量(ED50（n）)与一次染毒的半数有效量（ED50（1）之比值，毒性效应包括死亡。,蓄积系数K,1、固定剂量法：,2、递增剂量法：,生物半减期法：,由于生物的代谢作用，环境污染物在机体或器官内的量减少到原有量的一半所需要的时间，又称代谢半减期或生物半衰期(T),生物半减期T,第三节 生物的分子和细胞水平检测,加合物的测定,DNA加合物的测定,蛋白加合物的测定,一般代谢酶的活性测定,乙酰胆碱酯酶,腺三磷酶,解毒系统酶类诱导作用的检测,混合功能氧化酶的诱导作用,谷胱甘肽硫转移酶,抗氧化防御系统检测,过氧化氢酶,谷胱甘肽过氧化酶,第四节 生物致突变、致畸和致癌效应检测,一、致突变试验,（一）基本概念,突变：生物体的遗传物质发生了基因结构的变化。,致突变作用：某些物质引起生物体的遗传物质发生基因结构改变的作用。,致突变物：具有引起生物体遗传物质发生基因结构变化的物质。（二）分类,基因突变：只涉及染色体的某一部分的改变，不能用光学显微镜直接观察。,染色体畸变：可设计到染色体的数目或结构发生改变，可用光学显微镜直接观察。,（二）试验方法（Ames试验）,原理：鼠伤寒沙门氏菌与被检测化学物质接触，如果该化学物质具有致突变性，则可使突变性微生物发生回复突变，成为野生型微生物。野生型微生物具有合成组氨酸的能力，可在低营养的培养基上生长，而突变性不具有合成组氨酸的能力，不能在低营养的培养基上生长。,致突变试验的目的,致突变试验的目的是为了检查受试物对机体遗传过程有无影响的方法。,致突变试验方法,基因突变试验，例如Ames试验，下文以鼠伤寒沙门氏菌/哺乳动物微粒体酶试验法为例介绍。,染色体畸变试验,DNA损伤试验,二、致畸效应,（一）概念,畸形：胚胎发育过程中，由于受到某种因素的影响，使胚胎的细胞分化和器官形成不能正常进行，并出现肉眼可见形态结构异常者。有畸形的胚胎或者胎仔称为畸胎。,致畸物：凡能引起胚胎发育障碍而导致胎儿发生畸形的物质称为致畸物或者致畸源。,致畸作用：致畸物通过母体作用于胚胎而引起胎儿畸形的现象称为致畸作用。,致畸作用的毒理学特点,胚胎与致畸物接触时因胚胎处于不同的发育阶段而呈现不同的敏感性。,种属差异较为明显。,化学致畸作用机理,突变引起胚胎发育异常；,对细胞的生长分化较为重要的酶类受到抑制；,母体正常代谢过程被破坏；,细胞分裂过程的障碍,（二）致畸试验,1、目的：检测环境污染物能否通过妊娠母体引起胚胎畸形。,2、受试生物的选择：一般试验动物要求其对化学物质的代谢过程与人相似，胎盘结构也相似，还要求孕期短，产仔多，经济实用，如家兔、大鼠、小鼠等。,3、剂量分组：正式试验最少应设3个剂量组，另设对照组。如受试物溶于某种溶剂中给予动物，则另设溶剂对照组。有时为了更好地验证试验结果，另设阳性对照组。原则上，最高剂量组该剂量一般不超过LD50的1/5-1/3，应引起母体轻度中毒，即进食量减少、体重减轻、死亡不超过10%；最低剂量组可为LD50的1100l/30，不应观察到任何中毒症状，；中间剂量组可以允许母体出现某些极轻微中毒症状，其剂量与高剂量和低剂量成等比级数关系。最高剂量组能引起母体轻度中毒，仍未观察到致畸作用，则可确认为该因素不具有致畸作用。,4、动物交配处理 将性成熟雌雄动物按雌雄1:1或2:1的比例同笼交配。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照组。确定受孕方法是阴栓检查或阴道涤片精子检查，出现阴栓或精子之日即为受孕“0”日，也有人作为第l日。,5、胎仔检查 自然分娩前12日将受孕动物处死剖腹，取出子宫及活产胎仔，记录死胎及吸收胎。一般大鼠在受孕后第1920天，小鼠第1819天，家兔在第29天。胎仔在临近出生期间，发育进展极为迅速。相差半日，发育情况即有显著差异，骨骼发育尤为显著。,6、,下列几方面进行畸形检查：,外观畸形肉眼检查,，例如露脑；,肉眼检查内脏及软组织畸形，,例如腭裂；,骨骼畸形检查,，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限活产胎仔。,7、结果评定,活产幼仔平均畸形出现数,:,即根据出现的畸形总数，计算每个活产幼仔出现的畸形平均数。,畸形出现率,:,即作为畸胎的幼仔在活产幼仔总数中所占的百分率。,母体畸胎出现率,:,即出现畸形胎仔的母体在妊娠母体总数中所占的百分率。,8、致畸作用的评价,注意与自然变异区分；,注意种属差异；,注意试验的阈剂量与人类实际可能摄入量之间的差别。,三、致癌效应,概念,化学致癌作用：指化学物质引起肿瘤的过程。,化学致癌物：指诱发肿瘤的化学物质。,细胞癌变学说,（1）体细胞突变学说：致癌因素包括化学，物理和生物因素等。作用于体细胞的遗传物质DNA,使其发生了突变，其结果使细胞的功能发生异常改变而致癌。即癌变形成的基础是体细胞发生了突变。,（2）分化障碍学说：细胞癌变不一定需要体细胞遗传物质发生突变，而只是细胞分化过程中有关的基因调控过程受到致癌因素的干扰，使细胞分化和增殖发生紊乱而出现癌变。,（3）癌基因学说：所有细胞DNA分子中都存在有癌基因的遗传信息，在正常情况下癌基因处于阻遏状态，只有细胞内有关的调节机制遭到破坏的情况下，基因才能表达，从而使细胞发生癌变，形成肿瘤。,癌变过程,引发阶段：,致癌物直接作用于DNA的初级序列，引起基因突变，使单个细胞或少量细胞发生永久性的、不可逆的遗传性改变，此种细胞称为“启动细胞”（,initiated cell,），诱发细胞突变的因素称为启动剂。,促进阶段：,细胞在致癌作用的第一阶段变成启动细胞后，在某些因素作用下，以相对于周围正常细胞的选择优势进行克隆扩增，形成镜下才能观察到的或有时肉眼可见的细胞群，即良性肿瘤，这就是致癌作用的第二阶段，称为促进阶段，起促进作用的因素称作促进剂或促癌剂。,浸润和转移阶段:已形成的肿瘤不断发展，逐渐侵害周围的正常组织，并扩散到较远的部位。,致癌试验,致癌试验是检验受试物及其代谢产物是否具有致癌效应或诱发肿瘤作用的慢性毒性试验法。,短期筛检方法,长期动物诱癌试验,致突变试验,细菌回复突变试验（Ames试验）、染色体畸变试验、微核试验、姐妹染色单体交换试验（SCE）,细胞恶性转化试验,细胞形态、生长能力、生化等表型改变 移植于动物体内形成肿瘤的能力,常用叙利亚仓鼠胚胎细胞 小鼠成纤维细胞 皮肤、器官、肝等器官组织上皮细胞体外培养,短 期 试 验,转染细胞和转基因动物试验,转染细胞 将原癌基因或活化癌基因导入细胞，观察致癌物对细胞生长的影响,将人类的,P,450,基因导入动物来源的缺乏此酶系的细胞中，形成具有与人相同的对潜在化学致癌物代谢能力的细胞,转基因动物 通过增强或抑制某个基因的表达，了解这个基因的功能,人为地把某个基因及其相关基因组插入或者把某个基因从基因群中去除，这样得来的新品种称为转基因动物,通过比较转基因动物和正常动物的生理、生化和病理指标，来确定这个基因的功能,优点,人类接触受试物后往往需要,20,年左右的潜伏期，动物试验一般进行,1-2,年可获阳性结果,能严格控制试验条件，排除流行病学不易控制的许多混杂因素的影响,缺点,动物试验结果外推至人存在不肯定性,动 物 致 癌 试 验,受试物优先选择短期致癌试验阳性的化学物质,动物种属的选择，应考虑受试物可能作用的靶器官,大鼠 肝癌,小鼠 呼吸道和肺肿瘤,金黄仓鼠,(,或称金黄地鼠,)、,狗或猴 膀胱癌,靶器官无法估计 大鼠和小鼠,染毒剂量 应为最大耐受剂量,(MTD),或,1,2MTD,试验组 包括空白和溶剂对照,染毒途径 选用与人类接触相同的方式,动物应选择自发肿瘤率低并且对致癌作用不应过分敏感,每剂量组每性别动物不得少于,50,只,哺乳动物长期致癌试验,长期试验期限依据不同种属寿命而定，一般小鼠,1.5-2,年，大鼠,2-2.5,年,转癌基因或前癌基因小鼠,一种有望代替长期动物致癌的试验系统,可观察致癌物与基因相互作用以及不同致癌阶段所起的作用,这类方法对确认致癌物以及理解致癌机制很有帮助,不适于作危险性评估,啮齿类动物短期致癌试验,小鼠肺肿瘤诱发试验,大鼠肝转移灶诱发试验,小鼠皮肤肿瘤诱发试验,雌性大鼠乳腺癌的诱发试验,促癌剂的检查,选用适当的低剂量启动剂，启动后1-2周开始用受试物染毒,肿瘤流行病学调查,以肿瘤的发病率或病死率作为观察终点,多采用分析流行病学的方法（回顾性定群调查、病例对照调查的方法）,调查结果为阳性+剂量,-,反应关系+得到动物试验的验证 该化合物为人类致癌物,调查结果为阴性 不能完全确定受试物为非致癌物，可能是接触时间短或剂量低所致,流 行 病 学 调 查,生物标记物流行病学调查,内剂量,测定细胞、组织、体液内某些致癌物或其代谢产物的含量，衡量接触的水平,生物有效剂量,进入体内的致癌物本身或其代谢产物与细胞内大分子相互作用的程度,测定致癌物,-DNA,加合物/致癌物,-,蛋白质加合物，反映这些物质在体内作用于靶分子的水平,生物效应标记,反映致癌物对靶器官所造成的可能和肿瘤形成有关的损伤,常见的损伤,SCE,、微核、染色体畸变、肿瘤基因突变、癌基因活化等,敏感性标记,衡量致癌物作用个体差异的指标,参与致癌物活化与灭活的酶系多态性,主要有细胞色素,P,450,(I,相反应,),和谷胱甘肽硫转移酶,(,相反应,),，这些酶系的个体差异可达十至数百倍，同样的接触水平所产生的生物有效剂量以及相应的生物效应会有很大差异，可以从无反应到严重反应,(,肿瘤形成,),第五节 微宇宙法,微宇宙（Microcosm）,是研究污染物在生物种群、群落、生态系统和生物圈水平上的生物效应的一种方法，又称模型生态系统法（Model Ecosystem）,可分为自然微宇宙和人工微宇宙或分为水生微宇宙和陆生微宇宙。,标准化水生微宇宙（Standardized Aquatic Microcosm，SAM）,用于在实验室测定有毒物质在多物种水平对淡水生态系统的影响。,试验时间64天，容器为4L的玻璃广口瓶，试验生物包括10种藻、4种无脊椎动物、1种细菌。对温度、光照强度、pH值等理化参数均有具体要求。,烧杯水生微宇宙（Mixed Flask Culture，MFC）,又称烧杯混合培养，试验时间1214周，容器为1L的玻璃广口瓶，试验生物包括4种藻、2种无脊椎动物、一些细菌和原生动物。对温度、光照强度、pH值等理化参数均有具体要求。,与SAM不同的是通过加入,来自生态系统浸出液,提供给微宇宙中生物群落所需的基质。,室外水生微宇宙（Outdoor Aquatic Microcosm）,又称中宇宙（Mesocosm），试验单元6 m,3,，试验生物包括浮游植物、浮游动物、鱼类、大型水生植物和无脊椎动物。,土壤核心微宇宙（Soil Core Microcosm，SCM）,该法采用野外环境的土壤核心，将其设置在环境条件控制的实验室中，试验生物因土壤核心采集场所不同而不同，可研究化学物质和营养元素对农业生态环境的影响及其环境归趋。,模拟农田生态系统,该系统模拟农田条件，无陆生动物，为同时测定农药在土壤、植物、水溶液和空气中的残留而设计，采用0.75 m,3,的矩形玻璃室，可打入足够数量的空气，通过玻璃室模拟微风并能收集挥发的农药。,生物测试与常规的物理、化学检测有何不同？,表示毒性的常用参数有哪些？能否解释其含义？,何谓Ames试验？它的原理是什么？,在学习了本章内容之后，请思考以下问题：,