第五章-酶的非水相催化-to-学生.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第五章 非水相生物催化,1,酶的非水相催化体系,有机介质中的酶催化：,1、微水有机介质体系、,2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系、,3、胶束和反胶束体系；,气相介质中的酶催化体系,超临界流体介质中的酶催化体系,离子液介质中的酶催化体系,2,有机介质中的酶催化,1、微水有机介质：,由有机溶剂和微量的水组成的反应体系。微量的水主要是酶分子的结合水，它对维持酶分子的空间构象和催化活性至关重要。另外一部分水分布在有机溶剂中。,2、与水溶性有机溶剂组成的均一体系：,由水和极性较大的有机溶剂互溶组成的反应体系，水和溶剂含量均较大，酶和底物以溶解状态存在于均一体系。,3,3、胶束和反胶束体系：,胶束又称,正胶束,或正胶团，是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的,”水包油”,型的微小液滴。反应时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性的底物或产物在胶束的内部。反应在胶束的两相界面中进行。,4,反胶束,反胶束又称反胶团，,在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面活性剂后形成的,”油包水”,型的微小液滴。催化反应在两相的界面中进行。,在反胶束体系中，由于酶分子处于反胶束内部的水溶液中，稳定性较好。,5,气相介质中的酶催化体系,气相介质中的酶催化反应是指酶在气体或者能够转化为气体物质的酶催化反应。气体介质密度低，扩散容易。,6,超临界流体介质中的酶催化体系,超临界流体:温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体，,具有和液体同样的凝聚力、溶解力；,扩散系数又接近于气体，是通常液体的近百倍。,7,超临界流体的有关性质（P-V-T）,流体名称,乙烷,丙烷,丁烷,戊烷,乙烯,氨,CO,2,二氧化硫,水,临界温度,（）,32.3,96.9,150.0,296.7,9.9,132.4,31.1,157.6,374.3,临界压力,（Mpa）,4.26,3.8,3.38,5.12,11.28,7.38,7.88,22.11,4.88,临界密度,(g/cm3),0.220,0.228,0.232,0.227,0.236,0.460,0.525,0.326,0.203,如：纯净的CO,2,被加热或压缩到高于其临界点（临界温度31.1，临界压力7.28Mpa)时的状态。该流体具有无毒、无臭、不燃等优点。,8,非水相介质(有机相)中的酶学性质,1、酶在有机溶剂中之所以能发挥催化功能是因为在有机溶剂体系中能够保持整体结构和活性中心的完整性。,2、有机溶剂在很大程度上也会影响酶的稳定性和酶底物的特异性。,3、由于有机溶剂改变了疏水相互作用间的精细平衡，从而影响酶的结合部位，改变了底物的存在状态，使得自由能改变，影响酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性和催化功能等。,11,1.非水相介质中酶的热力学稳定性,试验证明：有机溶剂中酶的热稳定性和储存稳定性都比水溶液中高。,例如：猪胰脂肪酶(PPL)在苯中催化脂交换反应。有机相中100C半衰期10h以上，而在水相中100C马上失活。,原因：有机溶剂中缺少使酶失活的水分子，而水会引起酶分子中一些氨基酸的脱氨基、水解、二硫健的破坏、半胱氨酸的氧化、AA异构化等蛋白质热失活使得热不稳定。,12,有机介质中酶热稳定性提高：酶结构刚性增强和水含量有限。,水溶液中，酶分子亲水区位于酶表面，官能团与水溶液的水分子形成氢键，使蛋白质具有“柔性”的开放结构；有机介质中，酶的疏水区暴露出来，带电基团的相互作用是酶蛋白活性的“封闭”构象，酶分子的刚性增强，对受热而引起起的折叠抗性增强，热稳定性提高。,水是酶分子变性的主要参与者，含水量的减少会使变性受到抑制，从而提高酶的热稳定性。,13,2.非水相中酶的底物特异性,（1/2）,酶与底物的特异性结合取决于：酶-底物结合能和酶、底物及溶剂相互作用能的能差，因此酶与底物的结合受溶剂的影响：,如凝乳蛋白酶催化N-乙酰AA酯水解反应(AA:疏水的苯丙氨酸/亲水的丝氨酸)：,水溶液中，苯丙氨酸乙酰酯的水解速度是丝氨酸乙酰酯的5X10,4,倍，,辛烷中，丝氨酸酯的水解速度快3倍。,原因：,水溶液中，酶与底物的结合主要是疏水作用，,有机相中，这种疏水作用已不重要。,酶能够利用与底物结合的自由能来加速反应，总的结合能的变化是酶-底物结合能和酶-水分子结合能的差值。,因此，介质改变时，酶的底物专一性（Kcat/Km）和催化效率会发生改变。,14,2.非水相中酶的底物特异性,（2/2）,另一方面，底物/反应介质与酶活性中心之间分配的变化，也是影响酶的底物专一性及催化效率的因素之一，而底物和介质的疏水性直接影响底物在两者之间的分配。,15,3.非水相酶的对映选择性,（1/2）,（1）.酶的对映选择性使指酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的能力，这种选择性是由于酶和两种对映体形成复合物的能量差造成的。,（2）.有机溶剂中酶对底物的对映体选择性随着介质的亲、疏水性的变化而变化。有机溶剂中酶的立体选择性降低是由于底物的两种对映体把水分子从酶分子的疏水结合位点置换出来的能力不同。总的结果是酶的立体选择性随介质疏水性增加而降低。,16,3.非水相酶的对映选择性,（2/2）,（3）.溶剂的几何形状也影响酶的对映体选择性。一般来讲增加体系的水含量会提高酶的对映体选择性。因为增加体系水含量，在某种程度上会使酶恢复其天然构相，快反应与慢反应的速度差加大，从而提高酶得映体选择性。,17,4.非水相酶的位置选择性,有机溶剂中的位置选择性即：酶介质能够选择性的催化底物中某个区域的基团发生反应。,一些反应说明：脂肪酶催化脂交换反应时的反应位置选择因子（,Kcat/Km),与溶剂的疏水性常数lgP有较好的相关性。,18,5.非水相酶的,化学键选择性,化学键的选择性也是非水介质中酶催化的一个显著特点，一些实验证明：,酶的化学键选择性与氢键参数有关。利于形成氢键的基团不利于亲核进攻，不利于形成氢键的，有利于亲核进攻，进行催化反应。,19,pH值特性,水溶液中，pH决定酶分子活性中心基团和底物分子的解离状态，影响酶与底物的结合和催化反应；,有机介质，无质子的获得或丢失，pH和催化反应？,pH记忆或印记：有机介质中，酶所处的pH环境与酶在冻干或吸附在载体之前所使用的缓冲溶液pH制相同。酶分子在缓冲溶液中所处的pH状态被保留在有机介质中。,控制缓冲溶液pH值，控制有机介质酶催化反应的最适pH范围。,20,6.PH,记忆和PH忘记（1/2）,有机溶剂中的酶能够“记忆”它冻冰干燥或丙酮沉返前所在缓冲溶液的PH值和离子强度密切相关，成为“PH记忆”。其最适PH于水相中的最适PH时一致的。,原因：缓冲液中酶的解离取决于环境，有机相中酶不存在质子化和去质子化的条件，酶从水相转移到有机相时，保持了原有的离子化状态，有机相环境不能改变这种解离状态。,利用酶的这种特性可以控制有机相中酶催化的最适 PH值。,21,6.PH,记忆和PH忘记（2/2）,随着研究的不断深入，发现有机溶剂中的酶的最适PH与水溶液中相差较大，有机溶剂中酶活力不仅和冷冻干燥前缓冲溶液的PH相关，却与缓冲液的种类和离子强度、有机相中的水含量相关。,同时发现微水有机溶剂中疏水性的酸或碱与他们相应的盐组成的混合物，可作为有机相缓冲液（organic phase buffer）,他们以中性或离子对形式能够充分溶于有机相，而不能进入水或其他极性溶液。,这两种存在形式的比例控制着有机相中酶的解离状态，使酶完全忘记干燥前他所处的水溶液的PH值。这就是“PH忘记”,22,酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，,水是不可缺少的成分,之一。,有机介质中的水含量多少对酶的,空间构象,、酶的,催化活性,、酶的,稳定性,、酶的,催化反应速度,等都有密切关系，水还与酶催化作用的,底物和反应产物的溶解度,有关。,有机相中水对酶催化活性的影响,23,一个典型的非水相酶体系中水的含量仅占0.01%，水含量微小的差别会导致酶催化活性的较大改变。,酶需要少量的水保持活性的三维构象状态，水影响蛋白质结构的完整性，活性位点的极性和稳定性。,酶周围水的存在，能降低酶分子的极性氨基酸的相互作用，防止产生不正确的二级构象结构。,24,必需水,酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。,因此，酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。,维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水（essential water）,。,25,酶周围的水化层作为酶表面和反应介质之间的缓冲剂，是酶微环境的主要成份，,有机溶剂与酶键合水(结合水)之间的相互作用影响了酶的活力，当加入许多极性添加剂时，因剥夺了酶的水化层而使非水介质中的酶失活。,在一个完全“干”的体系中，酶基本是无活性的，随着酶水合程度的增加，酶的活性也不断提高。,26,必需水与酶分子的结构和性质有密切关系。不同的酶，所要求的必需水的量差别很大。如每分子凝乳蛋白酶分子必需水，每分子多酚氧化酶3.510,2,。,因为必需水是维持酶分子结构中氢键、盐键等副键所必需的，而氢键和盐键又是酶空间结构的主要稳定因素。酶分子失去水，空间构象和催化能力受破坏。,有机介质中，通过必需水的调控，可调控酶的催化活性和选择性。,27,有机溶剂中的水分和水活度,体系中，水在溶剂、酶、底物和产物之间分配，,含水量分布在酶、溶剂、固定化载体及杂质中。,与酶紧密键合的结合水是决定酶活力的关键因素。,在结合水不变的情况下，体系中水含量的变化对酶的催化活性影响不大。,对同一种酶，系统的最适水含量与溶剂的种类、酶的纯度、载体性质和修饰剂等多因素相关。,28,有机相中含水量与酶活力,Zaks和Klibanov研究了多种酶在不同溶剂中水含量对酶活力的影响：,催化活力随溶剂中水含量的增加而增加；,与亲水性有机溶剂相比，在疏水性强的溶剂中酶表现最大活力所需要的水量很低；,29,酶束缚水量,溶剂中含水量相同时，酶束缚的水量却不同，酶活力与酶束缚水量之间有很好的相关性（酶活力随束缚水量的增加而增大）。,30,体系中水含量受各种因素的影响，,不同溶剂中酶活力对酶束缚水量的依赖是相似的，系统的含水量则变化很大。,为了排除溶剂对最适含水量的影响，Halling建议用反应系统的热力学活度来描述有机相中酶活力与水的关系。,利用水活度更能准确地描述有机介质反应体系中水和酶催化活性间的关系。水活度确定结合水的多少。,31,水活度的定义：系统中水的逸度与纯水逸度之比（水的逸度在理想条件下用水的蒸汽压代替）,a,w,可以用体系中水的蒸汽压与同样条件下纯水的蒸汽压之比来表示,公式：a,w,=,w,.x,w,=P/P,0,x,w,:水的摩尔比；,w,：活度系数,32,一般情况下，最适水含量随着溶剂极性的增加而增加。同一种酶在不同有机溶剂中需水量不同，溶剂疏水性越强，需水量越少。,水活度有助于预测和研究相中酶活力与水的作用：,不控制水活度时，最佳水含量会随着溶剂的极性增加而增加,而溶剂的极性有己烷变成苯或戊醇时，最佳水活度几乎不变0.55。,说明：最佳水活度与溶剂的极性几乎无关。,水活度对酶活的影响,33,水活度可反应出酶的结合水量。,如：用一种水合盐（Na2CO3.10H2O）控制悬浮于与有机相的胰凝乳蛋白酶水活度，尽管所有成分均不溶于有机相，但是酶催化肽的合成仍在进行，最合理的解释就是反应发生在酶分子周围的水化层。,不同的酶所需要的水活度也不同。,34,在不同有机溶剂中获得恒定的水活度非常重要，可分为下列三种方法：,1.用一个饱和盐水溶液分别预平衡底物溶液和酶制剂。,2.相反应体系中直接加入一种水合盐。,3.向每一溶剂中加入不同量的水。,保持恒定的水活度的方法,35,有机溶剂对酶催化活力的影响是非水催化酶学所要阐明的另一重要因素,溶剂不但直接或间接地影响酶的活力和稳定性,而且也能够改变酶的特异性通常有机溶剂通过与水、酶、底物和产物的相互作用来影响酶的这些性质.,有机溶剂对酶催化活力的影响,36,1,有机溶剂对酶的结合水影响,虽然一些有机溶剂对酶的结合水影响较小,但一些相对亲水性的有机溶剂却能够夺取酶表面的必需水,从而导致酶的失活.,当酶分散于各种有机溶剂时,酶均会在这些溶剂中发生脱水现象.酶失水的情况与溶剂的介电常数(,)和疏水性参数(lgP)有关.,由于酶与溶剂竞争水分子,体系的最适含水量与酶的用量及底物浓度有关.,37,2、有机溶剂对酶结构的影响,酶分子表面结构：,与溶剂接触，酶分子表面结构变化。如结合水数的减少。,酶活性中心结合位点：,溶剂进入活性中心，与底物竞争活性中心结合位点；,溶剂进入活性中心，降低中心极性，增加酶和底物的静电斥力，降低酶与底物结合能力。,38,3.溶剂对底物产物的影响,溶剂能直接或间接的与底物和产物相互作用，影响酶的活力。,研究发现：溶剂对底物和产物的影响主要体现在底物和产物的溶剂化上，这种溶剂化作用会直接影响到反应的动力学和热力学平衡。,39,溶剂能改变酶分子必需水层中底物或产物的浓度，而底物必须渗入必须水层，产物必须移出此水层，才能使反应进行下去。,底物,溶剂必需水层酶活性中心,产物必需水层溶剂,溶剂极性太小、疏水性太大、底物在溶剂中的溶解度大、浓度高，难于进入必需水层，活性中心结合底物浓度低、降低催化速度。,溶剂极性过大、亲水性太强、底物在溶剂中的溶解度低，降低催化速度。,适宜溶剂 lgP,40,需掌握内容,1.非水相催化体系包括哪些？如何定义？,2.与水相催化相比，非水相催化体系中哪些性质会发生改变？,3.pH记忆和pH忘记？,4.非水相体系中，水含量如何影响酶催化性质。,5.水含量和水活度如何影响酶活力？,6.什么是必需水？,7.有机溶剂如何影响非水相体系的酶活力?,41,