生物化学06蛋白质研究技术.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,蛋白质研究技术,-,蛋白质分离纯化,-,层析,-,电泳,-,氨基酸序列分析,-,肽的化学合成,(also suit for,AA analysis),1,1.,蛋白质,分离纯化,(separation&purification),三阶段纯化策略,(,纯化所涉及的具体步骤最终要取决于样品的性质，但具有共同的可参考阶段,),-,捕获阶段 初步澄清、浓缩和稳定目标,/,靶蛋白,-,中度纯化阶段 除去大多数杂质，包括非靶蛋白及核酸等,-,精制阶段 除去残余的痕量杂质,蛋白质的性质,方法,电荷,(,等电点,),离子交换,分子量,凝胶过滤,疏水性,疏水剂,特异性结合,亲和试剂,可依据蛋白质的特殊性质而采用不同的分离方法,2,所用步骤及重复次数取决于纯度要求和蛋白的最终用途,3,-,透析,/,超过滤法常用于去除,各种盐类和小分子杂质,(,eg,.after grade-purified,by ammonium sulfate),4,2.,层析,(,chromato,graphy),-,逆流分溶原理,K,d,=,q,(,动相,),p,(,静相,),分配系数：,slow,fast,5,3.,电泳,(electro,phoresis,),带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动之现象,-,电泳介质现多采用各种凝胶,(,eg,.,琼脂糖、丙烯酰胺等,),-,介质,pH,一般维持在碱性区，使蛋白质大多带负电荷而,向阳极迁移,-,蛋白质迁移速率与其相对质量和荷电状态等密切相关,(,cf,.p36),8,-SDS-PAGE,(,十二烷基硫酸钠,-,聚丙烯酰胺凝胶电泳,),SDS,是阴离子表面活性剂，能破坏氢键和疏水互作并与蛋白分子结合,(1.4g SDS/g,protein),，使各种蛋白质,-SDS,复合物都带上,相同密度,的负电荷，其数量远远超过蛋白质分子原有的负电荷，从而,掩盖了,不同蛋白质之间原有的电荷差别，使蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于其分子量大小,(,构象解体,),M,r,在,15,000200,000,之间时，蛋白质,/,多肽链的电泳迁移率与其分子量的对数值线性,反相关,SDS/2AA,(,cf,.Fig.2-22 2-24),9,-,等电聚焦电泳,(IFE),利用特定,两性电解质,构建的缓冲液在电场作用下于凝胶内沿电场方向建立的,pH,梯度,，使样品中具有不同,pI,的各种蛋白质最终均迁移至凝胶中相应的,pH,处而达到分离之目的,Ampholytes:,例如脂肪族多胺多羧类化合物的混合物,(,cf,.p37),10,可以将相对分子质量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而相对分子质量不同的蛋白质分开,-,双向电泳,(two-dimensional electrophoresis),(,cf,.Fig.2-25),11,4.,氨基酸序列分析,Frederick Sanger(1918-),the only one,who got NP for,Chem.in twice,(1958&1980),-,各种蛋白质均具有其独特的,AA,序列，,可决定多肽链以何种方式折叠、盘绕,成独特的,3D,构象,(,功能基础,),-,AA,序列异常有可能导致,遗传病,(by 1 AA 1/3),eg.,sickle cell anemia:,链,Glu,6,Val,6,-,不同物种的相似功能蛋白质常具有,类似的,AA,序列,(p45),eg.,Ser-proteases,的,催化三联体,泛蛋白,的全部76,AA,对果蝇,和人均完全相同,(,cf,.p39),12,对酸水解远,比肽键稳定,短肽,可采用自动法测序,Sanger,法,鉴别肽链,N-,端残基,DNP-Aa,(,cf,.p40),Edman,降解法测定,短肽链的,AA,序列,PTC,基,PTH-Aa,(270nm absop.),苯异硫氰,PITC,PTC,基的引进可降低,相邻肽键的稳定性,TFA(,三,氟乙酸,),helps to,cleave N-terminal A,A,but leaves rest of polypeptide chain intact,.,(,cf,.Fig.2-27),(,cf,.Fig.2-28),13,氨肽酶法,Ala,Val,Gly,羧肽酶法,-,肽链末端亦可用酶法测定,(,cf,.p44),14,-,Edman,法的测定长度取决 于每轮循环降解的有效率,以,N-,末端为,Gly-Pro-Lys-,的肽链为例，如果每轮循环切除的有效率为,97%,，则,1,st,Gly Pro-Lys-97%,Gly-Pro-Lys-3%,cycle PTH-AA shortened peptide,2,nd,Pro 97%Lys-97%,Gly 3%Pro-Lys-2.9%,Gly-Pro-Lys-0.1%,3,rd,Lys 97%,Pro 2.9%,Gly 0.1%,目前的降解有效率,99%,，可一次性连续测定出,6070 AA,序列的肽段,Pehr Edman,1916-1977,15,大蛋白需分解成小肽段后再测序,-,断开二硫键,过甲酸氧化/二硫苏糖醇还原,-,分割多肽链,eg,.,胰蛋白酶+溴化氰,-,肽段测序,Edman,降解法,-,肽段整合,比较两,/,多套肽段的重叠肽序列,-,确定二硫键部位,断裂二硫键前、后的,电泳图谱比较,(,cf,.p39),在以常规法确定了完整肽链的,AA,组成,(,酸水解,),和,N-,末端残基,(DNFB),的基础上,16,5-26,Cys,断开二硫键,-,过甲酸氧化,-,二硫苏糖醇还原,+,碘乙酸保护,(,cf,.p40&Fig.2-28),磺基丙氨酰,(,负电荷增加,),17,t5-7,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶,胃蛋白酶,溴化氰,(CNBr),(,cf,.p41&Tab.2-2),常用的分割肽链法,分割原则：,-,断点少,-,专性强,-,反应率高,肽酰高丝氨酸内酯,(,cf,.Fig.2-30),18,5-27,两个,Cys,仅有一种,形成二硫键的可能,DNP-Glu(E),-,Glu,为,N-,末端残基,trypsin,切割成,四个肽段,CNBr,切割成,三个肽段,C-1,C-2,Similarly,38 AA,肽段测序及整合例解,(,cf,.Fig.,2-31,&p44),19,用互补,DNA,法推断蛋白质的,AA,序列,待测定蛋白,质作为抗原,抗 体,合成,抗原,的,多核糖体,mRNA,cDNA,氨基酸序列,mRNA,Protein,分,离,反转录,测序,推断,免疫处理,沉淀,20,W1.11,多肽液相合成,X,常用苄氧甲酰基,Y,常用叔丁酯,用,PCl,5,激活参与肽键形成的羧基，现在多采用更温和的叠氮、混合酸酐和活化酯法,Emil Fischer,1852-1919,(NP in Chemistry,1902),5.,肽的化学合成,21,羧基挂接,氨基去保护,缩合,释放,羧基活化,保护氨基,P6-13,多肽固相合成,Bruce Merrifield,1921-2006,二环己基碳二亚胺,(NP in Chemistry,1984),H,2,N,1962 synthesized,bradykinin(9 AA)in 27h,(ty.85%),22,Protect,a,-amino group with Fmoc,(9-fluorenylmethoxycarbonyl group),LINKAGE CAN BE CLEAVED,BY MILD BASE,甲氧羰基芴(二苯并五环),P6-12,23,t5-8,化学合成肽的主要限制因素之一在于每轮合成的效率,-,化学法合成出,100 AA,的肽段需要数天，,而,(,细菌,),细胞的生物合成仅需,5 min,24,要点提示,可以依据各种蛋白质的溶解度、电荷、大小以及结合,特异性上的差异，从生物资源中提取纯化蛋白质；,常用法包括各种层析及电泳技术,柱层析可根据固相介质的不同划分：凝胶层析按照,蛋白质相对分子质量的大小进行分离，大分子先被,洗脱；离子交换层析按照分子所带电荷的不同进行,分离；亲和层析则需要特异配体，其纯化效率最高,电泳也是依据蛋白质分子所带电荷的不同进行分离：,SDS-PAGE,在将蛋白质原有的电荷屏蔽后可按照分子,大小进行分离；等电聚焦电泳是完全依据蛋白质,pI,的,不同进行分离；这两种电泳法可组合构成分辨率更高,的双向电泳,25,要点提示,(续1),多肽的氨基酸序列可以通过,Edman,法降解确定；,大的多肽序列测定可利用蛋白酶和化学试剂先,有选择地水解成一些小肽段后再进行，然后通过,比较两套更多套具有交叉重叠肽段的序列而推断,出整条多肽链的氨基酸序列,26,1),分子筛,/,排阻层析与,SDS-PAGE,的基本原理都是按照多肽链,的相对质量进行分离的，但为什么大、小分子的分离顺序,正好相反？,2),通过分子排阻层析确定了某一纯化蛋白质的分子质量约为,60 kD,，在有尿素存在的条件下进行层析可产生单一的,30 kD,产物，但在有尿素和巯基乙醇同时存在时的层析,结果却是单一的,15 kD,产物。试分析该分子的结构如何？,3),有一个七肽，经分析其氨基酸组成为：,Lys,Leu,Arg,Phe,Ala,Tyr,和,Ser,；未经蛋白酶处理时，该七肽与,FDNB,反应不,产生,-DNP-AA,；经糜蛋白酶作用后断裂成两个肽段，其氨,基酸组成分别为,Ala,Tyr,Ser,和,Leu,Phe,Lys,Arg,；这两个,肽段与,FDNB,反应可分别产生,DNP-Ser,和,DNP-Lys,；该七肽,与胰蛋白酶反应亦产生两个肽段，其氨基酸组成分别为,Arg,Leu,和,Phe,Tyr,Lys,Ser,Ala,；试分析该七肽的一级结构。,作 业,27,一、选择,3,5,8,14,17,20,二、填空,1,4,7,8,10,1618,四、判断,2,8,12,五、问答与论述,1,3,7,12,复习题,(,考研精解,p1620),28,