卫生毒理学化学毒物的一般毒性作用.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第六章 化学毒物的一般毒性作用,卫生毒理学教研室,2004.5,10/26/2026,1,第六章 基础毒性,1,急性毒性作用,2,蓄积毒性,3,亚慢性和慢性毒性作用,4,局部毒性作用,10/26/2026,2,1 急性毒性作用,一、急性毒性和急性毒性试验的目的,二、急性毒性试验,三、急性毒性分级,急性毒性作用,10/26/2026,3,一、急性毒性和急性毒性试验的目的,急性毒性,(acute toxicity)是指机体(人或试验动物),一次接触或24小时内多次接触,化学物后在,短期(最长到14天),内所发生的,毒性效应,，包括一般行为、外观改变、大体形态变化以及死亡效应。,急性毒性作用,10/26/2026,4,一、急性毒性和急性毒性试验的目的,目的,测试和求出化学毒物对一种或几种试验动物的致死量(以LD,50,表示)以及其它的急性毒性参数，了解急性毒作用强度。,并通过观察动物中毒表现和死亡的情况，了解急性毒作用性质、可能的靶器官和致死原因，提供化学毒物的急性中毒资料、初步评价对人体产生损害的危险性。,探求化学毒物急性毒性的剂量反应关系与中毒特征。,为亚慢性、慢性毒性作用试验的染毒剂量设计提供参考依据。,研究化学毒物急性中毒的预防和急救治疗措施。,为毒理学机制研究提供线索,。,急性毒性作用,10/26/2026,5,一、急性毒性和急性毒性试验的目的,急性毒性试验常用的毒性参数：,LD,50,/LC,50,Zac,（LD50/Limac）,LD84/LD16(或LC84LC16),剂量反应曲线斜率,急性毒性作用,10/26/2026,6,二、急性毒性试验,(一)试验动物,原则：,急性毒性试验要求选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的试验动物。,动物易于获得,品系纯化,价格较低和易于饲养等条件。,急性毒性作用,10/26/2026,7,二、急性毒性试验,3.试验动物的性别：,急性毒性试验的主要内容是求LD,50,，除特殊要求外，一般急性毒性试验对动物性别要求为,雌雄各半,。如果在预试验时发现化学毒物(如农药)对雌、雄动物毒效应的敏感性有明显差异，则应单独分别求出雌性与雄性动物各自的LD,50,。如果试验是为致畸试验作准备，也可仅作雌性动物的LD,50,测试。,急性毒性作用,10/26/2026,10,二、急性毒性试验,4.动物数量与随机分组：,大、小鼠等小动物 每组10只,狗等大动物 每组6只,分组原则随机化原则,5.禁食：,经消化道染毒时，要求试验前对动物禁食,大鼠、小鼠隔夜进食；染毒后禁食4h,大动物每日上午喂食前染毒,染毒后继续禁食24h，但在禁食时要保障饮水。,6.实验动物的预检：,选择健康动物,12周的检疫期,急性毒性作用,10/26/2026,11,二、急性毒性试验,（二）试验动物的饲养环境,恒定的温度：223,湿度：3070%,照度：昼夜各半,饲料合格、饮水合格、垫料合格,急性毒性作用,10/26/2026,12,二、急性毒性试验,（三）染毒途径的选择:,染毒途径（exposure routes）的选择需考虑：,模拟人在生活和生产环境中实际接触受试物的途径和方式,；,有利于不同化学物之间急性毒性大小的比较,；,受试物的性质和用途；各种受试物毒性评价程序的要求等。,最常用的染毒途径为,经口、经呼吸道、经皮及注射途径。,急性毒性作用,10/26/2026,13,二、急性毒性试验,经口(胃肠道)接触,:,灌胃:,小鼠0.2,1.0ml/只或0.1,0.5ml/10g,大鼠一次灌胃体积不超过5ml/只,家兔不超过10ml/2kg,狗不超过50ml/10kg,吞咽胶囊:,经呼吸道接触,:,静式吸入,动式吸入,经皮肤接触,:,注射途径接触:,急性毒性作用,10/26/2026,14,二、急性毒性试验,（四）染毒剂量与分组:,1查阅文献,了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔点、沸点、密度、闪点、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。,确定使用哪一种计算方法求LD,50,，然后再设计剂量分组。LD,50,的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍思法等。,找出与受试化学毒物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料，并以文献资料中相同的动物种系和相同接触途径所测得的LD,50,(LC,50,)值作为受试化学物的预期毒性中值。,急性毒性作用,10/26/2026,15,二、急性毒性试验,（四）染毒剂量与分组:,2预试验,设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组，并在该剂量的上下各设计l一2个剂量组作为预试验剂量。,根据确定的剂量组进行染毒。,根据预试验的死亡资料确定组距。,可根据以下公式计算出剂量分组：,i=(lgLD,90,-lgLD,10,)(n-1)或：i=(lgLD,100,-lgLD,0,)(n-1),式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)；,n为设计的剂量组数。,急性毒性作用,10/26/2026,16,二、急性毒性试验,（四）染毒剂量与分组:,3正式试验;,一般来说、根据试验设计所选用的LD,50,计算方法来确定组数。例如几率单位法、寇氏法一般设610个剂量组；霍恩法固定设4个剂量组。求得i值后以最低剂量组(LD,0,或LD,10,)的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得出各组剂量的真实值。,1 2 3 4 5 6,LgLD,0,LgLD,0,+i LgLD,0,+2i LgLD,0,+3i LgLD,0,+4i,急性毒性作用,10/26/2026,17,二、急性毒性试验,（,五）试验周期与毒效应观察,1.中毒症状,急性毒性作用,10/26/2026,18,二、急性毒性试验,（五）试验周期与毒效应观察:,2.体重,在观察试验动物中毒症状的过程中，应同时观察体重的变化。,体重可以反映动物中毒后的整体变化。,体重改变的原因很多，若化学毒物刺激或损伤消化道可出现试验动物饮食减少甚至拒食，表现为体重减轻。若化学毒物引起腹泻，将影响食物吸收和利用，体重也会减轻。如果化学毒物影响水的摄取或肾功能急性损伤，也可能在体重上反映出来。所以，对存活动物尤其是对低于LD,50,剂量组的存活动物应在观察期14天内称量其体重的变化以便了解受试物引起毒效应的持续时间。,急性毒性作用,10/26/2026,19,二、急性毒性试验,（五）试验周期与毒效应观察:,3.病理检查及其他指标:,急性毒性试验中，对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查，肉眼观察主要脏器的大体病理变化，如脏器大小、外观、色泽的变化，有无充血、出血、水肿或其它改变，对有改变的脏器进行取材做组织病理学检查。对存活动物在观察期结束时进行大体病理检查必要时做组织病理学检查。根据试验需要可进一步扩大观察项目如体温、心电图、脑电图或进行某些生化指标测定等。,急性毒性作用,10/26/2026,20,二、急性毒性试验,（,五）试验周期与毒效应观察,4.死亡和死亡时间,重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。分析中毒死亡时间的规律具有一定意义，可为深人研究化学物的毒作用机制提供参考。,急性毒性作用,10/26/2026,21,二、急性毒性试验,(六)经典急性毒性试验的局限性,1.消耗的动物量大,2.获得的信息有限,3.测得的LD,50,仅仅是一个近似值,4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。,急性毒性作用,10/26/2026,22,三、急性毒性评价,外源化学物急性毒性分级（WHO）,毒性分级,大鼠一次经口LD,50,(mg/kg),6只大鼠吸入4小时，死亡24只的浓度(ppm),兔经皮LD,50,(/mg/kg),对人可能致死的估计量,g/kg,总量(g/60kg),剧毒,1,10,5,15,1000,急性毒性作用,10/26/2026,23,三、急性毒性评价,我国食品毒理急性毒性分级法(1994),急性毒性分级,大鼠经口LD50(mg/kg),大致相当于70kg人的致死量,6级(极毒),1,稍尝,15000,1050克,急性毒性作用,10/26/2026,24,一、,基本概念,二,、,蓄积毒性试验方法及其评价,蓄积作用及其评价,2 蓄积毒性,10/26/2026,25,化学毒物进入机体后，经过生物转化以代谢产物或化学物原型排出体外。但是，当化学毒物反复多次给动物染毒，化学毒物进入机体的速度(或总量)超过代谢转化的速度和排泄的速度(或总量)时，化学毒物或其代谢产物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学毒物的,蓄积作用,(accumulation)。,蓄积作用及其评价,一、基本概念,10/26/2026,26,蓄积作用实际上有二个含义：,物质蓄积,(material accumulation),功能蓄积,(functional accumulation),蓄积作用及其评价,一、基本概念,10/26/2026,27,二、蓄积毒性试验方法及其评价,化学毒物的,蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础,，,因此研究化学毒物在机体内的蓄积性是评价化学毒物能否引起潜在慢性毒性的依据之一，也是卫生标准制订过程选择安全系数的主要依据。,蓄积毒性试验是研究化学毒物基础毒性的重要内容之一，,目的是通过试验求出蓄积系数K，了解化学毒物蓄积毒性的强弱，,并为慢性毒性试验及其他有关毒性试验的剂量选择提供参考。,蓄积作用及其评价,10/26/2026,28,(一),蓄积系数法,蓄积系数(accumulation coefficient)是多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量ED,50,(n)与一次染毒使半数动物出现相同效应(或死亡)的剂量ED,50,(1)的比值，即：,KED,50,(n)/ED,50,(1),KLD,50,(n)/LD,50,(1),蓄积作用及其评价,二、蓄积毒性试验方法及其评价,10/26/2026,29,1固定剂量法：,一般常选用大、小鼠灌胃或腹腔注射方法进行染毒。先求出LD,50,，然后选取相同条件的40只(或更多)实验动物，分为两组，一为染毒组，一为对照组，每组至少20只，雌雄各半。试验组在120l50LD,50,的范围内选定一个剂量，每日以固定剂量、定时和相同途径进行染毒,试验期间观察记录每组动物死亡数。当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。此时，计算累积总接触剂量LD,50,(n)，根据公式计算K值，然后依表65进行评价。但若接触剂量已累积达到5个LD,50,剂量，也可终止试验。,蓄积作用及其评价,二、蓄积毒性试验方法及其评价,10/26/2026,30,2剂量递增法：,在试验期间，当化学毒物引起动物累积死亡一半时即可终止试验，计算K值进行评价。一般来说，在试验第2l天也可结束试验，因为这之前如果动物没有死亡或死亡数不足一半，说明其累积剂量已达5.26LD,50,，即K5。使用本方法时要注意染毒期间定期(每4天一次)给动物称重，按实测体重，调整化学毒物的染毒绝对量。,蓄积作用及其评价,二、蓄积毒性试验方法及其评价,10/26/2026,31,3剂量固定的20天蓄积法：,它通常采用经口灌胃染毒方式，将动物随机分为5个组，包括阴性对照组和1/20 LD,50,、l/10 LD,50,、1/5 LD,50,和1/2 LD,50,四个剂量组，每组动物数10只，雌雄各半。每日染毒一次，连续染毒20天。观察每组雌雄合计的死亡动物数量。试验结束时根据下列标准进行评定：各剂量组均无死亡，即为蓄积性不明显；如仅1/2LD,50,剂量组有死亡，其他组均无死亡，则为弱蓄积性；如1/20LD,50,剂量组无死亡，其他各组间死亡数有剂量反应关系时，则为中等蓄积性；如1/20LD,50,剂量组有死亡，且有剂量反应关系，则为强蓄积性。,蓄积作用及其评价,二、蓄积毒性试验方法及其评价,10/26/2026,32,(二)生物半减期法：,生物半减期(biological half-life，t,1/2,)法是用毒物动力学原理描述化学毒物在机体内的蓄积作用。,化学毒物在体内蓄积的速度和量与机体单位时间内吸收该物质的速度以及清除速度有关。即使化学毒物以相等的时间间距恒速地吸收入血液，该物质在一定剂量范围内在机体的蓄积量也不呈直线无限地增加，而是呈曲线形上升并有一定的极限。这是因为化学物质吸收进入机体的同时体内也发生着代谢转化及清除的过程(包括血中化学毒物向组织脏器的分配过程)。当化学毒物的吸收过程与代谢转化清除的过程达到平衡时，其蓄积量基本上不再增加。,一般来说，t,1/2,d较短的化学毒物达到蓄积极限所需的时间也短，t,1/2,长者达到蓄积极限的时间也长。,蓄积作用及其评价,二、蓄积毒性试验方法及其评价,10/26/2026,33,一,亚慢性毒性作用：,亚慢性毒性的概念,亚慢性毒性试验的目的,亚慢性毒性试验的设计,二 慢性毒性作用：,慢性毒性的概念,慢性毒性试验的目的,慢性毒性试验设计,3 亚慢性和慢性毒性试验,亚慢性和慢性毒性试验,10/26/2026,34,(一)概念：,亚慢性毒性,(subchronic toxicity)是指人 或实验动物连续接触较长时间、较大剂量的外源化合物所引起的毒性效应。,慢性毒性,(chronic toxicity)是指人或实验,动物长期(甚至终生)反复接触低剂量的化,学毒物所产生的毒性效应。,亚慢性和慢性毒性试验,一、亚慢性和慢性毒性试验的概念、目的,10/26/2026,35,（二）试验目的：,1.确定受试物亚慢性和慢性毒性的效应谱，对在急性及亚急性毒 性试验中发现的毒作用提供新的信息，并发现在急性及亚急性毒性试验中未发现的毒作用；,2.研究受试物亚慢性和慢性毒作用的靶器官；,3.研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量反应(效应)关系，确定其观察到有害作用的最低剂量(LOAEL)和未观察到有害作用的剂量（NOAEL），提出此受试物的安全限量参考值;,4.研究受试物亚慢性和慢性毒性损害的可逆性;,5.亚慢性毒性试验为慢性毒性试验的剂量设计及观察指标选择提 供依据;,6.确定不同动物物种对受试物亚慢性和慢性毒效应的差异，为将毒性研究结果外推到人提供依据。,亚慢性和慢性毒性试验,一、亚慢性和慢性毒性试验的概念、目的,10/26/2026,36,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,（一）实验动物选择,亚慢性和慢性毒性试验,亚慢性毒性试验,年龄：,大鼠80100g,狗 812月,小鼠1015g,数量：,小动物20,大动物6,性别：,雌雄各半,慢性毒性试验,年龄：,大鼠 5070g,狗 8月,小鼠 初断乳,数量：,小动物40,大动物8,性别：,雌雄各半,10/26/2026,37,（二）实验动物染毒期限：,工业毒理学 36个月,食品毒理学 6个月1年,环境毒理学 6个月1年,致癌试验 接近或等于动物的预期寿命,亚慢性和慢性毒性试验,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,10/26/2026,38,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,（二）实验动物染毒期限,亚慢性和慢性毒性试验,10/26/2026,39,经消化道,经呼吸道,经皮肤,亚慢性和慢性毒性试验,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,（三）实验动物染毒方式,10/26/2026,40,亚慢性毒性的剂量选择,阴性对照组,低剂量组,中剂量组,高剂量组,急性毒性的阈剂量,1/201/5 LD,50,组距：310倍，最低不小于2倍,慢性毒性的剂量选择,阴性对照组,低剂量组,中剂量组,高剂量组,亚慢性阈剂量或其1/51/2,1/10,LD,50,组距：25倍，最低不小于2倍,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,（四）试验分组和剂量设计,亚慢性和慢性毒性试验,10/26/2026,41,（五）观察指标,亚慢性和慢性毒性试验,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,10/26/2026,42,1.一般综合性观察指标：,外观体征、行为活动、体重、食物利用率,2.一般化验指标：,3.系统尸解和病理学检查：,（1）,脏器湿重、脏器系数（,脏/体比值,）,（,如肝/体比，即(全肝湿重/体重),100,）,（2）,病理学检查,4.特异性指标：,亚慢性和慢性毒性试验,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,（五）观察指标,10/26/2026,43,亚慢性和慢性毒性试验,二、亚慢性和慢性毒性试验设计,10/26/2026,44,四、局部毒作用,1.皮肤原发性刺激试验,2.皮肤致敏反应试验,3.光致敏反应,4.光刺激试验,5.眼刺激试验,6.其他粘膜刺激试验,7.替代（体外）试验,局部作用,10/26/2026,45,第七章 外源化学物质突变作用,卫生毒理学教研室,2004.5,10/26/2026,46,遗传毒理学,第一节 基本概念,第二节 化学毒物致突变的类型,第三节 致突变作用机制和后果,第四节 机体对致突变作用的影响,第五节 观察化学毒物致突变作用,的基本方法,10/26/2026,47,基本概念,遗传毒理学,(Genetic Toxicology,),是毒理学的一个分支，研究外源化学物及其他环境因素对生物体遗传机构的损害作用及其规律。其主要目的是检测那些能引起DNA损伤的环境因素，研究其遗传毒作用的特点及对人类的潜在危害。,10/26/2026,48,基本概念,突变(,mutation),遗传结构本身的变化及其引起的变异称为突变，突变实际上是遗传物质的一种可遗传的变异,。,自发突变(,spontaneous mutation),由于自然界中诱变剂的作用或由于偶然的自制、转录、修复时的碱基配对错误所产生的突变。,诱发突变(,induced mutation),诱变剂诱发的突变。,10/26/2026,49,致突变作用或诱变作用,(,mutagenesis,),广义概念是外来因素，特别是化学因子引起细胞核中的遗传物质发生改变的能力，而且此种改变可随同细胞分裂过程而传递。简单地说，突变的发生及其过程即为致突变作用。,化学诱变剂(,chemical,mutagen,),基因突变(,gene mutation),一个或几个,DNA,碱基对的改变,染色体畸变(,chromosome aberration),染色体的结构及数目改变,基本概念,10/26/2026,50,DNA与基因:,基因(gene),基因组(genosome),染色质,(chromatin),与染色体,(chromosome),体细胞,(somatic cell),和生殖细胞,(germ cell),基因型(genotype)与表型(pheotype),细胞周期(cell cycle)、有丝分裂(mitosis)与减数分裂(meiosis),基本概念,10/26/2026,51,基本概念,10/26/2026,52,基本概念,10/26/2026,53,基本概念,10/26/2026,54,基本概念,10/26/2026,55,基因突变（gene mutation）,染色体畸变（chromosome aberration）,非整倍体和多倍体(aneuploidy and polyloid),化学毒物致突变的类型,10/26/2026,56,化学毒物致突变的类型,一、基因突变(gene mutation),1碱基置换,(basepair substitution),指某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。,转换(transition),颠换(transvertion),2移码突变,(frameshift mutation),指发生一对或几对（三对除外）的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸。,10/26/2026,57,一、基因突变,(gene mutation),化学毒物致突变的类型,10/26/2026,58,化学毒物致突变的类型,一、基因突变,(gene mutation),10/26/2026,59,二、染色体畸变,(chromosome aberration),指染色体的结构改变,染色单体型畸变(chromatid-type aberration),染色体型畸变(chromosome aberration),染色体畸变,裂隙(gap),断裂(break),断片(fragment)和缺失(deletion),微小体,(minute body),无着丝点环,环状染色体,双着丝点染色体,倒位(inversion),易位(translocation),插入(insertion)和重复(duplication),辐射体,化学毒物致突变的类型,10/26/2026,60,染色体缺失及环状染色体的形成图,染色体插入和重复示意图,10/26/2026,61,染色体的臂间倒位,染色体相互易位示意图,10/26/2026,62,二、染色体畸变,(chromosome aberration),化学毒物致突变的类型,10/26/2026,63,三、基因组突变,1非整倍体 非整倍体(aneuploid)指细胞丢失或增加一条或几条染色体。缺失一条染色体时称为单体(monosome)，增加一条染色体时称为三体(trisome)。染色体数目的改变会导致基因平衡的失调，可能影响细胞的生存或造成形态及功能上的异常。如21三体导致先天愚型(Down氏综合征)。,2整倍体 整倍体(euploid)指染色体数目的异常是以染色体组为单位的增减，如形成三倍体(triploid)、四倍体(tetroploid)等。在人体，3n为69条染色体，4n为92条染色体。在肿瘤细胞及人类自然流产的胎儿细胞中可有三倍体细胞的存在。发生于生殖细胞的整倍体改变，几乎都是致死性的。,化学毒物致突变的类型,10/26/2026,64,致突变作用的机制,一、DNA损伤与突变,(一)碱基损伤,1.碱基错配,2.嵌入DNA链,3.碱基类似物的取代,4.,碱基的化学结构改变或破坏,10/26/2026,65,一、DNA损伤与突变,（二）,DNA链受损,1.二聚体的形成,2.DNA加合物（DNA adducts）形成,3.DNA-蛋白质交联物(DNA-Protein,crosslinks，DPC)形成,二、,引起突变的细胞分裂过程的改变,三、其他的改变,对DNA合成和修复有关的酶系统作用可间接导致,DNA损伤，诱发基因突变或染色体畸变。,致突变作用的机制,10/26/2026,66,突变的不良后果,突变的不良后果,体细胞突变,生殖细胞突变,癌变,致畸,衰老,配子死亡,死胎,自发流产,先天畸形,10/26/2026,67,一、,机体修复DNA损伤的机制可分为两大类：,1.损伤耐受机制：指DNA遗传可绕过那些阻止DNA 复制的DNA损伤。,2.修复机制：,DNA修复,直接修复,切除修复,O,6,甲基鸟嘌呤修复,光修复,错配碱基修复,碱基切除修复,核苷酸切除修复,机体对致突变作用的影响,复制后修复,呼救性修复,10/26/2026,68,机体对致突变作用的影响,二、遗传因素对致突变作用的影响：,(一)代谢酶遗传多态性,(二)修复功能的个体差异,10/26/2026,69,观察化学毒物致突变作用的基本方法,一、观察项目的选择,1观察的效应终点类型,基因突变和染色体畸变的检测可直接反映化学毒物的致突变性，是评价化学毒物致突变性唯一可靠的方法。还有许多试验所观察到的现象并不反映基因突变、染色体畸变和染色体分离异常，而仅反映致突变过程中发生的其他事件。因此，将试验观察到的现象所反映的各种事件统称为,遗传学终点,(genetic endpoint),。,10/26/2026,70,观察化学毒物致突变作用的基本方法,一、观察项目的选择,遗传学终点分为5类：,DNA完整性的改变(形成加合物，断裂，交联)；,DNA重排或交换；,DNA碱基序列改变；,染色体完整性改变；,染色体分离改变。,其中实际上指基因突变，指染色体畸变。,10/26/2026,71,观察化学毒物致突变作用的基本方法,2成套的观察项目,遗传毒理学评价程序通常为一组体内、外遗传毒理学试验。因为：,化学毒物的种类和结构多种多样，其致突变的机制不尽相同，作用的靶细胞也不一样，有的是体细胞，或生殖细胞，或两者兼而有之，故在成套观察项目中既要用体细胞检测又要用生殖细胞；除了从分子水平还要从细胞水平来检测化学毒物的遗传毒性。,致突变物中仅少数具有直接致突变作用，大多数为间接致突变作用，即需要在体内代谢活化后，才具有致突变作用。体内试验具有完整的活化系统，而体外试验则通过加入模拟代谢系统，如S,9,来弥补缺乏活化系统的不足。这是体内与体外试验的主要差别。,化学毒物的致突变性有强，也有弱；有的在某一检测系统中是强致突变物，而在另一系统中可能是弱的致突变物。对于弱致突变物在某些系统中比较容易漏检，即出现假阴性。,10/26/2026,72,2成套的观察项目,关于遗传毒理学成套观察项目中那些试验可入选的原则有：,选择的遗传毒性试验应包括5种类型的遗传学终点。,通常的实验材料有病毒、细菌、真菌、培养的哺乳细胞、植物、昆虫及哺乳动物等。,体内试验与体外试验配合。,应包括生殖细胞和体细胞。,通常，对于一种受试物应当先用原核细胞或体细胞的体外试验按遗传学终点合理配套进行试验，并对有阳性结果的遗传学终点验证其在体内的真实性，再行选用生殖细胞致突变试验进行遗传危害的评价。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,10/26/2026,73,二、常用的致突变试验,(一)细菌回复突变试验(Ames试验),鼠伤寒沙门氏菌原养型(his,+,),组氨酸营养缺陷型突变株。(his,-,),正向突变,回复突变,代谢活化系统,受试物,观察化学毒物致突变作用的基本方法,10/26/2026,74,二、常用的致突变试验,(二)微核试验,微核(Micronucleus)的产生与染色体损伤有关，,是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内，因比主核小，故称微核。,在细胞质中微核来源有二：断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带苔丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。,微核试验(Micronucleus test，MNT)是观察受试物能否产生微核的试验。,其主要可检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,10/26/2026,75,观察化学毒物致突变作用的基本方法,(二)微核试验,10/26/2026,76,MN,NCE,观察化学毒物致突变作用的基本方法,10/26/2026,77,二、常用的致突变试验,(三)染色体畸变分析,(四)姐妹染色单体交换试验（SCE）,观察化学毒物致突变作用的基本方法,10/26/2026,78,二、常用的致突变试验,(五)果蝇伴性隐性致死试验,(六)显性致死试验,(七)程序外DNA台成试验,(八)转基因动物致突变试验,(九)哺乳动物细胞基因突变试验,观察化学毒物致突变作用的基本方法,10/26/2026,79,三、致突变试验中的一些问题,(一)阴性和阳性对照的设立,1阴性对照 它是空白对照，即不加任何处理。或者是溶剂对照。阴性对照除了无处理因素外，与实验组完全相同。其目的是获得实验的基础数据。例如，Ames试验的阴性对照可了解所用的细菌的自发回复突变率；证实除处理因素外无任何使回复突变率增加或减少的因素。,2阳性对照 是用某种已知能产生阳性反应的物质作为对照。其目的是通过对阳性物质的试验证明实验方法的可靠；验证实验者在本实验条件下，完成技术和鉴定致突变物的能力；证实经一段时间后，本实验的重复性。例如，Ames试验中阳性对照未出现阳性结果，应考虑突变菌株可能发生问题，另一种可能是代谢活化能力不足。所以，当阳性对照结果未呈阳性，其实验组的实验数据可靠性亦大大降低。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,10/26/2026,80,三、致突变试验中的一些问题,(二)体外试验的活化系统,1哺乳动物细胞介导 使用完整的细胞，特别是大鼠肝原代细胞，与测试细菌或细胞一起培养。这也是一种活化系统。它有完整的细胞结构和各种酶及内源性辅助因子，代谢能力优于无细胞系统如S9，但不如体内活化系统。,2S9 S9指经酶诱导剂处理后制备的肝匀浆，再经9000g离心分离所得上清液，加上适当的缓冲液和辅助因子。它主要含有混合功能氧化酶(MFO)，是国内常规应用于体外致突变试验的代谢活化系统，其缺点是S9随实验动物种属或器官不同而有差异；S9含有的大量亲核物质有可能影响试验的敏感性。,3纯化酶和基因工程 应用纯化细胞色素P-450、谷胱苷肽转移酶及过氧化物水解酶，可严格控制代谢产物诱发突变的条件，但技术难度大。利用基因工程，将人的细胞色素P-450基因，插入组合细胞内，用上述细胞进行致突变试验，使细胞具有代谢活化系统。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,10/26/2026,81,三、致突变试验中的一些问题,(三)致突变试验与致癌试验的关系,已知大多数化学致癌物具有致突变作用，遗传学改变在原癌基因激活和抑癌基因失活上起主要作用，致癌物诱致关键靶基因遗传改变的直接作用等在哺乳动物实验中证实。,发现人类接触致癌物与DNA加合物，同其肿瘤中癌基因和抑癌基因的特异碱基对突变之间具有相关性。,传统的长期致癌试验，花费大，周期长，不能适应化学物质快速增长的需要。此外，致癌试验所用动物数量有限，难以检出弱的致癌物。需要发展多种体内和体外短期试验，用于对化学物质致癌性进行筛检。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,10/26/2026,82,三、致突变试验中的一些问题,(四)试验结果在毒理学安全性评价中的作用,阴性结果判定条件：,最高剂量应包括受试物溶解度许可或灌胃量许可的最大剂量。如该剂量毒性很大，则体内试验和细菌试验应为最大耐受量。使用哺乳动物细胞进行体外试验，常选LD,50,或LD,80,为最大剂量。溶解度大、毒性低的化学物，在细菌试验中可以5000g皿作为最高剂量。,各剂量组的组间差距不应过大，以防漏检仅在非常狭窄范围内才有突变能力的某些化学毒物。满足上述条件，仍为阴性，才慎重下结论。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,10/26/2026,83,三、致突变试验中的一些问题,(四)试验结果在毒理学安全性评价中的作用,阳性结果应具有剂量反应关系，即随剂量增加，致突变作用增加；和在一组或多组的观察值与阴性对照比较有显著性差异。阳性结论，即表明受试物具有致突变性，而不同致突变试验的遗传学终点不同，其所表示的含义不一。如基因突变是具有导致遗传性疾病的突变，DNA修复的实际后果尚不明确。,观察化学毒物致突变作用的基本方法,10/26/2026,84,致突变试验举例,美国EPA毒物处(1936)提出了一个三阶段的试验方案，把遗传毒性检测和生殖细胞致突变性验证分阶段进行。,第一阶段测试化学物的遗传毒性，包括Ames试验、体外哺乳动物细胞基因突变试验、体内骨髓染色体损伤试验(微核试验或染色体畸变试验)；,第二阶段测试对生殖细胞的致突变作用；,第三阶段为哺乳动物生殖细胞致突变性标准试验。,在遗传危害性评价时，在体外基因突变试验中呈阳性的化学物应进行与哺乳类性腺DNA相互作用的试验，包括睾丸细胞的SCE、UDS、染色体畸变及碱性洗脱试验等，也可进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，需进行小鼠特异座位试验，可观察形态改变或生化改变；在体内骨髓细胞染色体畸变试验或微核试验中呈阳性的化学物需进行显性致死试验，在第二阶段中出现阳性反应，再进行小鼠可遗传易位试验。,10/26/2026,85,致突变试验举例,国际协调组织(1CH)(1997)对于药品的遗传毒性评价建议的检测试验组合为,细菌基因突变试验；,体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细胞比试验；,体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验(骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验)。,在对经标准试验组合得到的致突变作用结果进行进一步研究时，其他试验如DNA加合物测定、DNA链断裂检测、DNA修复和重组试验等都可作为供选择的试验。对于在三项标准试验中为阴性的化学物，通常可认为其无遗传毒性作用。但对于构效关系显示有可能具致癌性或致突变性，但在三项标准试验中为阴性的化学物，还需要改进试验方法或再增加试验项目。对于在三项标准试验中为阴性，但致癌试验显示有致癌效应，又无明确的证据说明该化学物是通过非遗传毒性机制发挥作用时，为了了解其作用方式，可再进行改变代谢活化系统的体外试验或应用肿瘤发生的靶器官进行遗传损伤试验(如肝脏UDS试验、DNA加合物检测、转基因突变检测、肿瘤相关基因的遗传改变检测)。,10/26/2026,86,致突变试验举例,我国卫生部在食品安全性毒理学评价程序(1994)中对遗传毒理学试验的要求是：,根据受试物的化学结构、理化性质以及对遗传物质作用终点的不同，并兼顾体外和体内试验 以及体细胞和生殖细胞的原则，在Ames路试验、小鼠骨髓微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验、小鼠精子畸形试验和睾丸染色体畸变试验中选择四项，如其中一项试验为阳性，还应在其他备选试验(V79细胞HGPRT基因突变试验，显性致死试验，果蝇伴性隐性致死试验，UDS试验)中再选择两项试验进行。我国农药安全性毒理学评价程序(1991)中对遗传毒理学试验的要求则为：Ames试验和大肠杆菌回复突变试验，骨髓细胞微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验，睾丸细胞染色体畸变试验或显性致死试验为必做项目，若有一项出现阳性，还需从精子畸形试验、体外培养细胞染色体畸变试验、UDS、果蝇伴性隐性致死试验等试验中再选择两项进行。,10/26/2026,87,