研究生课程-分子生物学基本操作技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,分子生物学基本操作技术,从,20,世纪中叶开始，分子生物学研究得到高速发展，主要原因之一是研究方法，特别是基因操作和基因工程技术的进步。,基因操作主要包括,DNA,分子的切割与连接、核酸分子杂交、凝胶电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、定点突变和,PCR,扩增等，是分子生物学研究的核心技术。,核酸凝胶电泳技术,在生理条件下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的，所以，,DNA,和,RNA,多核苷酸链又被称为多聚阴离子（,polyanions,），,把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链,DNA,几乎具有等量的净电荷，因此它们能以,同样的速度,向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，,DNA,分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。这就是应用凝胶电泳技术分离,DNA,片段的基本原理。,大分子量的,DNA,移动的慢,小分子量的,DNA,移动的快,电泳缓冲液,阳极,阴极,DNA,加样孔,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳是一种简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法,琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物,根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖,低熔点琼脂糖熔点为,62,65,，溶解后在,37,下维持液体状态约数小时，主要用于,DNA,片段的回收，质粒与外源性,DNA,的快速连接等,2,）电泳缓冲液,常用三种缓冲液,Tris-,硼酸（,TBE,）,Tris-,乙酸（,TAE,）,Tris-,磷酸（,TPE,）,TBE,与,TPE,：缓冲容量高，,DNA,分离效果好，但,TPE,在,DNA,片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使,DNA,沉淀,TAE,：缓冲容量低，但价格较便宜。缓冲液中的,EDTA,可螯合二价阳离子,，从而抑制,DNA,酶的活性，防止,PCR,扩增产物降解,10,溴化乙锭染料的化学结构及其对,DNA,分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子，在紫外光照射下，琼脂糖凝胶电泳中,DNA,的条带便呈现出橘黄色荧光，易于鉴定。,5,）核酸电泳的染色剂,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖凝胶分辨,DNA,片段的范围为0.250,kb,之间,称样,溶解,加热,制板,倒胶,6,）核酸电泳操作基本程序,取样,点样,电泳,检测,核酸电泳操作基本程序,结果,一、,PCR,技术原理,二、,PCR,技术主要类型,三、,PCR,技术主要应用,聚合酶链式反应,Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应，即,PCR,技术，是一种在体外快速扩增特定基因或,DNA,序列的方法。它可以快速将极微量的目的基因或某一特定的,DNA,片段扩增数十万乃至千百万倍。,PCR,技术简史,DNA,的复制,聚合酶链反应的发明,1971,年，,Khorana,提出：经过,DNA,变性，与合适引物杂交，用,DNA,聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆,tRNA,基因。,但由于测序和引物合成的困难，以及,70,年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，,Khorana,的设想被人们遗忘了,PCR,技术简史,DNA,的复制,聚合酶链反应的发明,1985,年，美国,PE-Cetus,公司的,Mullis,等人发明了聚合酶链反应（,PCR,）,基本原理是在试管中模拟细胞内的,DNA,复制,最初采用,E-coli,DNA,聚合酶进行,PCR,，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错,耐热,DNA,聚合酶的应用使得,PCR,能高效率的进行，随后,PE-Cetus,公司推出了第一台,PCR,自动化热循环仪,1993,年，,Mullis,等因此项技术获诺贝尔化学奖,“,顿悟”,那是在,1983,年春天的一个周五晚上，他开车带着女友前往乡间的小屋度周末。在蜿蜒的乡间公路上开着车，一段,DNA,反复复制的景像，在他的脑海里冒了出来。穆里斯原以为这样简单的想法，应该有人提出过，但搜索文献后却发现没有。,PCR,技术的发明,PCR,的发明是,DNA,操作技术的革命,美国,Mullis,教授 开汽车时的联想,逶迤崎岖的山路,行驶的汽车,1988,年发明了,PCR,技术,1993,年获诺贝尔奖,Kary B.Mullis,1989,年美国,Science,杂志列,PCR,为十余项重大科学发明之首,比喻,1989,年为,PCR,爆炸年，,Mullis,荣获,1993,年度诺贝尔化学奖。,PCR,发明不到,10,年，却已获得广泛应用。目前，每年都有上千篇文章 发表。,1991,年，期刊“,PCR,方法与应用”（,PCR Methods and Application,）在美国创刊，使有关学者有了自己的论坛和参考的专业期刊。,PCR,技术作为一种方法学革命，必将大大推动分子生物学各有关学科的研究，使其达到一个新的高度。,引物,引物,Mullis,的构思,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,特定,DNA,片段,72,94,55,PCR,循环,PCR,的基本原理,类似于,DNA,的体内复制。首先将待扩增,DNA,模板加热,变性,解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生,退火,，再将温度升高使退火引物在,DNA,聚合酶作用下得以,延伸,。这种热变性,-,复性,-,延伸的过程就是一个,PCR,循环，,PCR,就是在合适条件下的这种循环的不断重复。,PCR Cycle-Step 1,-Denaturation Template DNA by Heat(95,o,C),Target Sequence,Target Sequence,PCR,原理示意图,模板,DNA,的变性：模板,DNA,经加热至,93,左右一定时间后，使模板,DNA,双链或经,PCR,扩增形成的双链,DNA,解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；,PCR Cycle-Step 2,Temperature is lowered(T,m,)and primers anneal to target sequences,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,模板,DNA,与引物的退火,(,复性,),：模板,DNA,经加热变性成单链后，温度降至,55,左右，引物与模板,DNA,单链的互补序列配对结合；,PCR Cycle-Step 3-,At 72,o,C,Taq,DNA polymerase catalyses primer extension as complementary nucleotides are incorporated,Target Sequence,Target Sequence,Primer 1,Primer 2,5,3,5,5,3,5,3,3,Taq,DNA,Polymerase,引物的延伸：,DNA,模板,-,引物结合物在,TaqDNA,聚合酶的作用下，以,dNTP,为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板,DNA,链。,End of the 1st PCR Cycle,Results in two copies of target sequence,Target Sequence,Target Sequence,每完成一个循环需,2,4,分钟，,2,3,小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。,Target Amplification,No.ofNo.Amplicon CyclesCopies of Target,12,24,38,416,532,664,201,048,576,301,073,741,824,1,cycle=2 Amplicon,2,cycle=4 Amplicon,3,cycle=8 Amplicon,4,cycle=16 Amplicon,5,cycle=32 Amplicon,6,cycle=64 Amplicon,7,cycle=128 Amplicon,PCR,反应,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,标准的,PCR,反应条件：,10X,缓冲液,10,L,4,种,dNTP,混合物 各,200umol/L,引物 各,10,100pmol,模板,DNA,0.1,2,g,Taq DNA,聚合酶,2.5U,Mg,2+,1.5mmol/L,PCR,仪,PCR,反应,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,1,2,3,4,5,22,55,72,94,时间（,min,）,温度,（）,PCR,反应,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,适温延伸,3,高温变性,1,低温退火,2,重复,13,步,2530,轮,目的,DNA,片段,扩增,100,万倍以上,DNA,双螺旋,DNA,单链,与引物复性,DNA,变性,形成,2,条单链,子链延伸,DNA,加倍,模板,DNA,95,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,55,引物,1,引物,2,DNA,引物,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,引物,1,引物,2,DNA,引物,72,Taq,酶,Taq,酶,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,1,轮结束,第,2,轮开始,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,95,55,72,Taq,Taq,Taq,Taq,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,72,第,2,轮结束,PCR,的基本原理,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,重复,30,轮后,2,30,=1,073,741,824,模板,DNA,第,1,轮扩增,第,2,轮扩增,第,3,轮扩增,第,4,轮扩增,第,5,轮扩增,第,6,轮扩增,理想拷贝数,=2,n,n,循环次数,实际拷贝数,=(1+x),n,X,平均效率,约为,0.85,n,循环次数,PCR,反应,PCR,反应条件,PCR,过程,PCR,的特点,灵敏度高,皮克,(pg=10,-12,),量级扩增到微克,(ug=10,-6,),水平,能从,100,万个细胞中检出一个靶细胞,病毒检测的灵敏度可达,3,个,RFU,（空斑形成单位）,细菌检测的最小检出率为,3,个细菌,简便、快速,一次性加好反应液，,2,4,小时完成扩增,扩增产物一般用电泳分析,对标本的纯度要求低,血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提,DNA,PCR,反应五要素（反应成分）,引物,（,primers,）,酶,（,Taq DNA polymerase,）,dNTP,（,dATP,dGTP,dCTP,dTTP,）,模板,（,template,）,Mg,2+,（,magnesium,）,1,）引物,理论上，只要知道任何一段模板,DNA,序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链作引物，用,PCR,就可将模板,DNA,在体外大量扩增,引物设计的原则,引物长度：,15-30bp,，常用为,20mer,左右,引物的有效长度不能大于,38 mer,，否则最适延伸温度会超过,TaqDNA,聚合酶的最适温度（,74,），不能保证,PCR,扩增产物特异性,引物扩增跨度：,以,500bp,为宜,特定条件下可扩增长至,10kb,片段,引物碱基：,G+C,含量以,40-60%,为宜,G+C,太少扩增效果不佳，,G+C,过多易出现非特异条带,ATGC,最好随机分布，避免,5,个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,引物设计的原则,避免引物内部出现二级结构,避免两条引物间互补，特别是,3,端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性扩增条带,引物,3,端的碱基要求严格配对,特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致,PCR,失败,引物中有或能加上合适的酶切位点,被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处,引物设计的原则,引物的特异性：,引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性,引物量：,每条引物的浓度,0.2 1umol,，以最低引物量产生所需结果为佳,引物浓度偏高会导致错配和非特异性扩增，且又增加引物之间形成二聚体的机会,DNAstar,Primer premier,Software for primer design,依靠经验直接设计,2,）酶及其浓度,目前有两种,Taq DNA,聚合酶供应,天然酶：从嗜热水生杆菌中提纯,基因工程酶：大肠菌合成,一个典型的,PCR,反应约需酶量,2.5U,（指总反应体积为,100 ul,时）,浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少,3,）,dNTP,dNTP,浓度取决于扩增片段的长度,四种,dNTP,浓度应相等,浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量,dNTP,可与,Mg,2+,结合，使游离的,Mg,2+,浓度下降，影响,DNA,聚合酶的活性。,4,）模板,单、双链,DNA,均可。,不能混有蛋白酶、核酸酶、,DNA,聚合酶抑制剂、,DNA,结合蛋白类。,一般,100ng DNA,模板,/100,L,。,模板浓度过高会导致反应的非特异性增加,。,5,）,Mg,2+,Mg,2+,是,DNA,聚合酶的激活剂。,0.5-2.5mmol/L,反应体系。,Mg,2+,浓度过低会使,Taq,酶活性丧失、,PCR,产量下降；,Mg,2+,过高影响反应特异性。,Mg,2+,可与负离子结合，所以反应体系中,dNTP,、,EDTA,等的浓度影响反应中游离的,Mg,2+,浓度。,2,、循环参数,变性,使双链,DNA,解链为单链,95,o,C 20-30,秒,(2),退火,温度由引物长度和,GC,含量决定。,增加温度能减少引物与模板的非特异性结合,;,降低温度可增加反应的灵敏性。,（,3,）延伸,70-75,o,C,，,延伸时间由扩增片段长度决定,（,4,）循环次数,主要取决于模版,DNA,的浓度,一般为,25-35,次,次数过多：扩增效率降低,错误掺入率增加,PCR,中应注意的事项,（一）防止污染,试剂小量分装,吸头及,EP,管一次性使用,器皿及工作区域要分开，无菌操作,（,二）设立对照,：,阳性对照：阳性模板,阴性对照：阴性模板,试剂对照：除模板外的所有组分,二、,PCR,技术主要类型,PCR,技术的主要类型,1,、反向,PCR,6,、锚定,PCR,2,、不对称,PCR 7,、原位,PCR,3,、,RT-PCR,8,、重组,PCR,4,、差异显示,PCR,9,、免疫,PCR,5,、实时定量,PCR,10,、多重,PCR,RT,PCR,反转,PCR,（,RT-PCR,）是以反转录的,cDNA,作模板所进行的,PCR,反应，用于测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变,呈现,mRNA,多态性，克隆,mRNA,的,5,和,3,末端序列,以及从非常少量的,mRNA,样品构建大容量的,cDNA,文库。,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR,扩增,PCR,技术应用,研究,基因克隆，,DNA,测序，分析突变,诊断,细菌、病毒、寄生虫检测，诊断,人类基因组工程,遗传图谱的构建，,DNA,测序，表达图谱,法医,犯罪现场标本分析,肿瘤,各种肿瘤检测,其他,细菌转化与目标,DNA,分子的增殖,一、细菌转化,二、细菌转化方法,三、克隆的筛选和鉴定,一、细菌转化,细菌转化（,Transformation,）,:,一种细菌菌株由于捕获了外源,DNA,而导致性状特征发生遗传改变的生命过程。接受转化,DNA,的细菌菌株则被称为,受体菌株,。,绝大多数细菌，正常条件下仅能获得极少量的,DNA,。为了高效转化这些细菌，必须对受体细菌进行一些物理或化学的处理，以增加它们获得,DNA,的能力。经历这种处理的细胞被称为,感受态细胞（,Competent Cell,）,。,1,、常用细菌转化的方法,-,CaCl,2,法,将快速生长中的大肠杆菌置于经,(0,）预处理的低渗氯化钙,(0.1mol/L),溶液中，使细胞膨胀形成原生质球，外源,DNA,粘附在细胞表面。,42,下做短暂热刺激，细胞吸收外源,DNA,。在全培养基中生长一段时间使转化基因实现表达，涂布于选择性培养基中分离转化子。,二、细菌转化方法,CaCl,2,法制备感受态细胞及转化过程：细菌处于,0,，,CaCl,2,的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，制成感受态，经,42,短时间热冲击处理能提高转化的效率。,其中的钙离子的作用机理（假说）：,（,1,）改变了细胞壁的通透性（用氯化钙处理大肠杆菌，增加大肠杆菌细胞壁的通性）：使细胞壁局部原生质化，增加细胞壁的通透性,（,2,）改变了细胞膜的通透性,低温的,CaCl,2,溶液中，（,1,）,Ca,2+,会使细胞膜磷脂双分子层形成,液晶结构,，当,42,度热,刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多,间隙,，为,DNA,分子提供进入细胞的通道。（,2,）促使细胞外膜与内膜间隙中的部分,核酸酶,解离开来，离开所在区域，同时,Ca,2+,能与加入的,DNA,分子结合，形成,抗脱氧核糖核酸酶,的羟基磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上,三、克隆的筛选和鉴定,1,、抗生素,常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等。,2,、,-,互补蓝白斑筛选法,实验室常用带有不同,抗生素,的选择性培养基结合,-,互补蓝白斑筛选法,鉴定转化细胞。,细菌转化与目标,DNA,分子的增殖的操作过程,RNA,基本操作技术,（,Technique,s for RNA M,anipulation,）,一、总,RNA,的提取,二、,cDNA,的合成,RNA,存在于从简单的病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中。应用,RNA,对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍。,由于当前没有一种方法能够直接扩增,RNA,，为了研究,RNA,所包含的功能信息，一般将其反转录成稳定的,DNA,双螺旋（,Complementary DNA,，,cDNA),，再插入到可以自我复制的载体中。由于,cDNA,来自,RNA,，几乎不含冗余序列，通过特异性探针筛选,cDNA,文库，可以较快的分离到相关基因。,一、总,RNA,的提取,细胞中的总,RNA,包括,信使,RNA(mRNA),、核糖体,RNA(rRNA),、转运,RNA(tRNA),以及一些,非编码的小,RNA,。一个典型的动物细胞约含有,10,-5,g RNA,，其中,rRNA,占,80%85%,，,tRNA,和非编码小,RNA,占,15%20%,，,mRNA,占,1%5%,。,按照提取试剂的种类来分，可分为：异硫氰酸胍法、盐酸胍法、异硫氰酸胍,-,苯酚法。,Trizol,试剂是使用最广泛的抽提,RNA,专用试剂。主要由异硫氰酸胍和苯酚组成，可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的,RNA,释放出来，并使蛋白质与,RNA,分子分离，还能保证,RNA,的完整性。,常用的,RNA,提取方法,1,、常用提取方法的种类,总,RNA,的提取,RNA,易遭降解，实验要求较严格。总,RNA,提取的方法有多种，主要有,LiCl法,、,CTAB法,、,异硫氰酸胍法,（,TriZol,）。,异硫氰酸胍法,（,TriZol,）原理：,TRIZOL,试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体的解离，使,RNA,与蛋白质分离，并将,RNA,释放到溶液中。当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使,RNA,进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样,RNA,与仍留在有机相中的蛋白质和,DNA,分离开。水相层（无色）主要为,RNA,，有机层（黄色）主要为,DNA,和蛋白质。,由于,RNA,酶,存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破坏，固此建立一个,无,RNA,酶的环境,对于制备优质,RNA,很重要。对于制备,mRNA,来说这些预防措施尤其重要。,2,、注意事项,纯的,RNA,样品其,OD,260,OD,280,应介于,1.8-2.0,之间。,1,）若,RNA,样品,OD,260,/OD,280,比值太小，说明有蛋白质或酚的污染；,2,）比值大于,2.0,时，可能被异硫氰酸胍等污染；,OD,260,值,=1,，相当于单链,DNA,或,RNA,为,40g/mL,，寡核苷酸为,20g/mL,。,RNA,的纯度、浓度与完整性,1,、,RNA,的纯度,2,、,RNA,的浓度,rRNA,大小完整，而且,28S rRNA,和,18S rRNA,亮度接近,2,：,1,；,mRNA,分布均匀，则认为,RNA,质量较好。,3,、,RNA,的完整性,二、,cDNA,的合成,使用,Oligo dT Primer,时的,cDNA,合成,缺陷,：不具有,ploy,（,A,）尾结构的,mRNA,无法使用此方法！,基因克隆,一、基因克隆的策略,二、基因克隆技术,克隆,在多细胞的高等生物个体水平上，人们用克隆（,clone,）表示由具有相同基因型的同一物种的两个或数个个体组成的群体。从同一受精卵分裂而来的单卵双生子（,monozygotic twins,）便是属于同一克隆。,在细胞水平上，克隆一词是指由同一个祖细胞（,progenitor cell,）分裂而来的一群遗传上同一的子细胞群体。,在分子生物学上，人们把将外源,DNA,插入具有复制能力的载体,DNA,中，使之得以永久保存和复制这种过程称为克隆。,一、克隆基因的策略,1.,如何克隆已知基因,2.,如何克隆同源基因,3.,已获得未知蛋白,如何克隆其基因,4.,转座子标签法克隆基因,5.,定位克隆,(positional cloning),6.,差减杂交法（,subtructive hybridization cloning),如何克隆已知基因,（,1,）如果该基因为连续基因，没有内含子，以基因组,DNA,为模板,如果该基因为断裂基因，有内含子，提取总,RNA,（包括了,mRNA,）,以此为模板,原核基因一般没有内含子,（,2,）设计上下游引物，进行,PCR,反应,（,3,）电泳回收,PCR,产物,（,4,）与载体连接,、,测序,、,转化宿主进行表达,88,全长,cDNA,及基因结构与功能分析和鉴定,获得了大量的候选,cDNA,后，通过筛选,cDNA,文库或采用,cDNA,末端快速扩增,(,rapid-amplification of cDNA ends,，,RACE,),等方法克隆全长基因。确定其中待克隆基因的重要环节是对定位候选克隆进行功能分析。,89,新基因的功能鉴定,遗传互补实验,(,genetic complement assay,),敲除基因,-,功能丧失；保留该基因,-,功能恢复；有时敲除基因并不丧失功能,(,功能补偿或同工酶,),，那么超表达该基因,(,overexpression,),后再观察表型,研究该基因编码产物与其他生物大分子的相互作用（利用酵母双杂交等技术）,90,二、,基因克隆技术,1.RACE,技术,是用于从已知,cDNA,片段扩增全长基因的方法，它根据已知序列设计基因片段内部特异引物，由该片段向外侧进行,PCR,扩增得到目的序列。用于扩增,5,端的方法称为,5RACE,，用于扩增,3,端的称为,3RACE,。,已知,cDNA,序列可来自,序列表达标签（,EST,）,、减法,cDNA,库、差法显示和基因文库筛选。,91,3RACE,是在反转录酶的作用下，以连有可以和,polyA,配对的,oligo(dT),的锚定引物启始,cDNA,第一条链的合成。,用,RNaseH,降解模板,mRNA,。,用通用锚定引物和基因片段内部特异引物进行,PCR,扩增得到目的,3,片段，并可用,nest PCR,的方法继续进行检测和扩增。,92,5 RACE,在反转录酶的作用下，以已知基因片段内部特异性引物（,GSP1,）启始,cDNA,第一条链的合成,RNase,混合物降解模板,mRNA,，纯化,cDNA,第一条链。,用末端转移酶在,cDNA,链,3,端加入连续的,dCTP,以连有,oligo(dG),的锚定引物和基因片段内部特异的引物进行巢式,PCR,扩增，以期得到目的片段，并可用,nest PCR,进行检测。,93,我们课题组克隆基因的基本策略,通过大规模的测序，获得七鳃鳗的某个组织（如肝组织，髓组织）的,EST,（序列表达标签）库。,EST,，即某个基因的中间一段序列。,根据,EST,序列，设计引物，通过,3RACE,和,5RACE,获得该基因的全长序列。,根据全长基因的两端序列，设计引物，将该基因从七鳃鳗的,cDNA,文库（提取总,RNA,并反转录,PCR,获得）中钓取出来。,将该基因构建到原核或者真核表达载体，进行后续实验。,预祝所有研一新同学度过美好而充实的三年研究生时光！,