7不同类型细胞的培养特点.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,第七章 体外培养细胞的生物学,(,一,),体内外细胞的差异,当前人工模拟体内环境的技术已经很高，细胞生活在人工培养条件下不仅能很好的生存、生长和增殖，在一定程度上，人们已能控制细胞的分化。,但当前我们毕竞尚未能彻底了解人体内一切细胞活动的内在联系，人工所模拟的条件与体内实际情况仍不完全相同。这样，当细胞被置于体外培养后，一旦失去神经体液的调节和细胞相互问的影响、生活在缺乏动态平衡的环境中，日久天长，发生变化是必然的。,培养细胞最多见的表现是：,失去原有组织结构和细胞形态,分化减弱或不显、出现类似“反祖”(Atavism)现象,表现为细胞趋单一化，或获得不死性，或变成具有恶性性状的细胞群,(,二,),培养细胞的分化,个体从一个受精卵通过发育形成组织、器官，并进行各种功能的过程，也可看作为细胞分化表达的过程。细胞分化机制是极其复杂的，是在细胞与细胞、细胞与体液和细胞与细胞外基质相互作用下，由众多基因参与、经过多阶段和多环节完成的动态演变过程。细胞离体培养因环境的改变，失掉上述在体内时的关系，细胞的分化可能发生如下的变化：,1,不适应,(Deadaptation),：,细胞在原体内时所拥有的分化特性减弱或不显，如肝细胞产生酪氨酸转移酶特性的丧失；有人证明肝细胞产生酪氨酸转移酶需要激素(胰岛素、可的松)的诱导和与相应细胞基质(如Collagen)的相互作用，只要这些条件存在，便可产生。培养细胞分化的改变主要因环境改变所致。细胞在体外培养时间越长，分化改变越大；细胞刚离体培养时，先出现的现象可能属不适应，即由于环境的改变而出现的变化,2,脱分化或去分化,(Dedifferentiation),：,细胞也可能出现脱分化或去分化，即细胞失掉发生分化的能力。仍以肝细胞为例，当肝细胞失掉产生精氨酸酶、氨基转移酶等特性后，则失掉贮存肝糖原能力，并很难再现。因此不适应和脱分化两个概念是,不同的。不适应是因生存条件的改变使分化发生阻抑；从分子水平考虑，脱分化很可能是基因变异所致。,二、培养细胞形态分类(图13),体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，根据它们是否能贴附在支持物上生长的特性，可分为贴附型和悬浮型两大类：,(,一,),贴附型,、这类细胞在培养时能贴附在支持物表面生长。大多数培养细胞呈贴附型生长；只赖于贴附才能生长的,细胞称贴附性细胞(Anchoragedependent Cells)。,1成纤维型细胞：,本型细胞形态与体内成纤维细胞的形态相似而得名；细胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质向外伸出23 个长短不同的突起。细胞在生长时多呈放射状、火焰状等。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织：如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本类形态。,2上皮型细胞：,本型细胞具有扁平不规则多角形，中有圆形核，细胞紧密相连，形成单层膜。细胞增殖数量增多时，整块上皮膜随之移动；处于上皮膜边缘的细胞多与膜相连，很少脱离细胞群单独活动。起源于内、外胚层细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰和肺泡上皮等组织培养时，皆呈上皮型形态。,(,二,),悬浮型,有的细胞在培养时不贴附于支持物上，而呈悬浮状态生长，如某些癌细胞和血液白细胞可呈悬浮型。,细胞悬浮生长时，胞体为圆形，观察时不如贴附型方便。其优点是细胞悬浮在培养液中生长，生存空间大，容许长时间生长，能繁殖多量细胞，便于做细胞代谢等研究。,(,三,),对培养细胞形态分类的探讨,必须意识到，培养细胞的一般形态，并不是一项很可靠的指标，原因是它可受很多因素的影响而发生改变。譬如拿培养条件来说，就很难控制到丝毫不发生变化的程度。,如温度、支原体污染、培养基pH 改变等都可使细胞形态发生变化。如HeLa 细胞本属上皮型，但在过酸或过碱的情况下可变成梭形，pH 适宜时又可恢复。,从细胞接种到细胞密度增大的一代生长过程中，细胞形态表现也有所不同，如上皮型细胞在刚接种后不久，因细胞数量较少，细胞可能呈星形或三角形。只有当细胞数量增多后，多角形态特点和上皮膜状结构才逐渐变得明显起来。,另外贴附型和悬浮型细胞性质也不是绝对一成不变的，在一定条件下，悬浮型细胞可呈贴附状生长，贴附型细胞也可呈悬浮状生长。,当细胞发生转化后，细胞形态变化更大；成纤维细胞转化后可变成上皮形态。,组织培养细胞的生长和增殖过程,体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的,继续生存，这一过程叫传代(Passage 或Subculture)。,(,一,),组织培养细胞生命期,(Life Span of Culture Cells),所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。组织和细胞在培养中生命期如何？这要看细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况。人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传3050 代，相当于150300 个细胞增殖周期，能维持一年左右的生存时间，最后衰老凋亡(Apoptosis)。,1,原代培养,(Prmary Culture),期：,也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞克隆形成率,(C1oning Efficiency),很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群(克隆)的百分数。,2,传代期：,初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系,(Cell Line),。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系(Diploid Cell,line)。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。,3,衰退期：,此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡,(,二,),组织培养细胞一代生存期,所有体外培养细胞，包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。接种细胞数量大、细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快(实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快)。连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。,细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段,1.,潜伏期,(Latent Phage),：,细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。,2,指数增生期,(Logarithmic gowth phage),：,这是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数(Mitotic Index：MI)表示，即细胞群中每1000 个细胞中的分裂相数。体外培养细胞分裂指数受细胞种类、培养液成分、pH、培养箱温度等多种因素的影响。一般细胞的分裂指数介于0.10.5,3.,停滞期,(Stagnate Phase),：,细胞数量达饱和密度后，细胞就停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量持平，故也称平顶期(P1ateau)。,停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH 降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。,五、培养细胞增殖动力学,(Culture Cell Kinetics),组织培养细胞是研究细胞动力学和细胞有丝分裂过程非常好的对象。,按动物体细胞，包括体外培养细胞，有两种基本状态：即增殖态和功能态,(,一,),增殖态,(Proliferation State),增殖态即细胞进行增殖的状态或过程；细胞增殖或自我复制的手段为细胞有丝分裂(Mitosis)。细胞增殖的基本条件或前提为细胞质和细胞核的复制；两者是正常细胞增,殖过程缺一不可的前提。只有在两者完成,后，细胞才能发生分裂；而细胞有丝分裂所完成的主要是细胞质和细胞核的分配。,1,G1,期：,发生于上一个增殖周期的分裂期后，DNA 合成期前，故也称为细胞分裂后期，或DNA 合成前期。G1 期是细胞质复制的主,要阶段，细胞进入G1 期标志细胞已进入增,殖态。,上一次细胞分裂后所形成的子细胞是否能进入G1 期，取决于外源生长因子(Growth Facter)和其它增殖相关因子的调控。,培养细胞属旺盛增殖细胞群体，一般具有较短的G1 期。,G1,期主要活动为细胞内的蛋白质、,RNA,、多核蛋白体合成增多等；,G1,期胞体逐渐增大，是镜下唯一可感知的变化。,2,S,期：,即DNA 合成期，主要机能活动为进行DNA 合成。各种细胞DNA 合成持续时间差别不大，比较恒定，平均68 小时，除用抑制DNA 合成药物如5氟尿嘧啶等外，细胞一旦进入S 期，DNA 合成过程一经开始，大多能持续进行，独立性较，对环境不利因素有一定耐受能力。但DNA 在进行合成时，多核苷酸双链发生分离，在此阶段，易受致突变或致癌因素作用。,3,G2,期：,发生在DNA 合成后和本次细胞分裂期之前，故也称DNA 合成后期或细胞分裂前期。细胞进入G2 期后，DNA 含量已加倍，具有4 倍量的DNA。在,G2,期主要的变化是与细胞分裂相关的,RNA,的合成和染色质的螺旋化。本期持续时间较短，平均25 小时。G2 期对外界环境敏感，易受温度、pH 及各种其它因素的影响而受阻不能进入M期，但不利作用消除后却能很快恢复。,4,M,期：,即细胞有丝分裂期，组织培养细胞分裂仍以有丝分裂方式进行增殖。M 期结束形成两个子细胞，是细胞增殖周期的终结期。处于分裂中的细胞叫分裂相，在生活状态下可以直接观察到,前期：G2 期结束后的细胞是如何过渡到前期的，尚难确定出明显的标志。用缩时逐格显微摄电影技术显示，细胞核发生转动可能是前期的开始。当染色体在核中出现并愈来愈清楚时，证明细胞已进入分裂前期。稍后，核膜和核仁突然解体消失，染色体遂混于细胞质中并呈现活跃的运动(类似布朗运动)。与此同时，整个细胞也显现活跃的运动；从细胞膜表面向外伸出很多长短不等的突起，它们此起彼伏犹如液面沸腾，蔚为壮观。此时细胞质逐渐回缩，细胞体趋于变圆，遂与底物附着面减少，易脱落入培养液中染色体由分散状态渐向细胞中央部移动，然后突然“冻结”于赤道平面，到此前期结束，中期开始；前期,持续时间2030 分钟。,中期：细胞进入分裂中期后，胞质进一步回缩，胞体呈圆球形，与支持物附着面缩小达极限。如于此时摇动培养瓶壁，在培养液的冲击下，细胞极易从瓶壁脱落，依此可作为收集中期分裂相的简易方法。,由于中期细胞呈圆形，折光性强，在镜下极易识别。染色体集中于赤道平面后，失去明显的运动；中期染色体集聚在赤道平面上称中期板(Metaphase P1ate)。中期板有一定的方向性，即中期板常与支持物平面相垂直，两中心体分别位于两端(极)。细胞分裂中期持续2030 分钟。本期细胞对外界因素敏感，易受外界因素如秋水仙素作用发生阻滞、延缓或停止向后期过渡。,后期：一旦中期板染色体开始一分为二，即标志后期开始。接着染色体分成两组，分别向两极移动。此时，整个细胞由圆球形逐渐变成椭圆球形；在赤道部并出现纹窄，胞体呈哑铃形；后期时两组染色体相互分离，是细胞分裂过程中最快的，仅持续57 分钟，在显微镜下可直接观察到。,末期：此时两组染色体己达于两极，胞体中部进一步变细。继之一切变化与前期相反；染色体变成染色质、核仁核膜再现、胞体逐渐分离、形成两个子细胞，但两者间仍有细丝相连，经过较长时间后才彻,底分开。两个子细胞独立后，细胞质又复延展附于底物变扁，整个细胞又恢复成原有状态；末期持续时间2030 分钟。,四、细胞周期的调控,细胞周期调控包括环境中控制细胞增殖的因素以及细胞内与细胞增殖有关的基因及其产物相互作用，即生长因子和生长因子受体、信号转导途径及细胞周期有关的基因及其产物、周期蛋白和周期蛋白激酶等方面的调控。,2001年诺贝尔生理医学奖获得者,（一）生长因子与生长因子受体,生长因子（GF）是一大类与细胞增殖有关的信号物质，目前发现的生长因子多达几十种，多数有促进细胞增殖的功能，故又称有丝分裂原（mitogen），如表皮生长因子（EGF）、神经生长因子（NGF），血小板衍生因子（PDGF）。,GF与其受体结合后，可诱导多种基因的转录，包括早反应基因和迟反应基因。,（二）信号转导调节,生长因子、激素等信号在与膜上的受体结合后，通过cAMP、cGMP和IP3、Ca,+,等作为第二信使，对细胞的代谢进行调节，从而有效地控制细胞的增殖和分化。,（三）周期蛋白和周期蛋白依赖性激酶,1、周期蛋白；是一类随细胞周期的进程而呈周期性变化的蛋白质。目前已发现cyclinA、B、C、D、E、F、G、H等类型。周期蛋白主要通过调节周期蛋白依赖性激酶的活性而起作用。,2、周期蛋白依赖性激酶,CDC2与细胞周期蛋白结合才具有激酶的活性，称为细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)，因此CDC2又被称为CDK1，激活的CDK1可将靶蛋白磷酸化而产生相应的生理效应，如将核纤层蛋白磷酸化导致核纤层解体、核膜消失，将H1磷酸化导致染色体的凝缩等等。这些效应的最终结果是细胞周期的不断运行。因此，CDK激酶和其调节因子又被称作细胞周期引擎。,（四）细胞周期有关的其他基因及其产物,1、细胞分裂周期基因(cell division cycle,CDC)在细胞内一类与细胞周期运转和调控有关的基因。有cdc2 cdc3 cdc4 cdc5 cdc6 cdc7 cdc8等。,2、癌基因和抑癌基因,癌基因：是能引起细胞恶性转化的DNA片段，存在于病毒或正常细胞中。,抑癌基因：在正常细胞中含有一类调节细胞正常增殖，抑制肿瘤发生的基因。如P53蛋白抑制CyclinA的表达。,（五）限制点,在细胞周期各事相转换中存在着特定的时间点，称为限制点（checkpoint）。,细胞要分裂，必须正确复制DNA和达到一定的体积，在获得足够物质支持分裂以前，细胞不可能进行分裂。细胞周期的运行，是在一系列称为检验点（check point）的严格检控下进行的，当DNA发生损伤，复制不完全或纺锤体形成不正常，周期将被阻断。,G1/S检验点:在酵母中称start点，在哺乳动物中称R点(restriction point)，控制细胞由静止状态的G1进入DNA合成期，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞外环境是否适宜？细胞体积是否足够大？,S期检验点：DNA复制是否完成？,G2/M检验点：是决定细胞一分为二的控制点，相关的事件包括：DNA是否损伤？细胞体积是否足够大？,中-后期检验点（纺锤体组装检验点）：任何一个着丝点没有正确连接到纺锤体上引起细胞周期中断。,(,二,),功能态,(Functional State),功能态为细胞进行特定功能活动如分泌、传导、吞噬、收缩等的时期，是细胞的第二种生存状态。细胞完成特定功能是在细胞发生分化基础上完成的。因此，细胞功能态也是细胞的分化态(Differtentiation,State)。功能态存在于细胞分裂之后，G1 期前，也即在两次增殖态之间。,细胞的增殖态和功能态是相对的状态，能发生交替和有相互依存的关系。根据这两种状态属性的不同，可把细胞分作如下三类：,1,活跃增殖细胞：,这类细胞是以增殖为主的细胞，它们增殖频繁，具有较短的G0 期，无分化现象。从而它们的G0 期最为符合间期概念，故可称之为G0i(G0 of Ineterphase：G0i)。体内各种干细胞、肿瘤细胞和体外培养细胞均属之。本型细胞在体外易于培养，成活率高。,2,功能,I,型细胞：,这类细胞是以完成功能活动为主的细胞，其G0 期是完成功能活动的主要阶段。故本型细胞的G0 期可称之为G0(G0 of Function：G0f)。体内各种腺细胞、结缔组织细胞、淋巴细胞等属之。在一定条件下，本型细胞尚可重返增殖态；如肝细胞，受损后能重新再进入增殖态，损伤修复后又恢复成功能态。,3,功能,II,型细胞：,体内神经细胞、骨路肌细胞等，是终末分化细胞。它们长期处于G0 期进行功能活动，少见或不进行增殖。本型细胞在体外难以培养和存活(成体)。,(,三,),体内外细胞增殖和分化调控的差别,细胞群的增殖率主要取决于细胞增殖周期的相继密度和细胞群体中参与增殖细胞数(增殖的细胞群体)，而不在于一个M 期本身持续时间的长短。,体外培养细胞属活跃增殖细胞，在培养液中营养充分条件下，可反复进行增殖活动。但当营养缺乏、尤其是缺乏生长因子时(如降低血清含量)，细胞多停滞于G0i 期。此时的细胞由于蛋白质和RNA 的降解、核糖体为单体而非多聚体，酶的活性和越膜活动等较低，因此细胞体积较小。,体内细胞进入增殖抑或发生分化，均取决于自身以外的调控信号。正常细胞离体培养后，信号来源切断，在培养液中如没有促细胞增殖因子或不充分时，细胞便停止增殖。向培养液中补加血清，在于供给细胞所需生长因子，对于正常细胞尤为重要。如细胞发生恶性转化，则出现血清需求降低的现象。研究证明，是与恶性转化细胞获得能以自泌Autocrine)方式产生生长因子所致，即细胞具有“自给自足”供生长因子能力。因此细胞降低血清需求可视为细胞恶变的一项指标。,六、组织培养细胞遗传学特征,利用组织培养细胞很适于做细胞遗传学研究。细胞遗传学特征是检测培养细胞一项极重要的指标。体内细胞的遗传学特征是比较稳定的，但细胞离体培养后，在培养过程中，却很易发生细胞遗传学变动。因此掌握培养细胞的细胞遗传学动向，是了解细胞性状的一个极重要方面。随着近年细胞融合、免疫组化、,原位杂交、基因工程和DNA 重组技术的发展和应用，弥补了细胞遗传学和分子遗传学问的不足，使它们已形成了更加完整的体系。但细胞遗传学仍然是了解培养细胞遗传性状最基本和必要的技术，因此利用培养细胞进行研究的工作者，必应具有一定细胞遗传学知识。,(,一,),核型变化,染色体、染色质和DNA 是细胞中同一遗传物质的不同的存在形式。间期细胞核中的染色质在细胞进入分裂时变成染色体；在分裂中期时染色体呈标准形态是研究染色体形态结构最好的阶段。人体体细胞具有二倍体核型，在组织培养中呈二倍体核型的细胞群体称二倍体细胞(Diploid Cells)，染色体数目为46(2n)。,能维持培养细胞保持二倍体状态的培养方法称二倍体细胞培养。初代正常培养细胞多呈二倍体，通过传代成细胞系后，在培养条件良好的情况下，二倍体细胞可能长期保持二倍体状态。但体外细胞培养环境的稳定性是相对的，细胞经过长期传代后，会发生偏离二倍体现象，即染色体数变成多于或少于46。但只要具有二倍体核型细胞数在这一群体中仍居优势，即占75以上时，这样的细胞系或细胞株仍可视为二倍体。,当细胞发生转化、恶变或原来即为肿瘤细胞的情况下，大多失去二倍体核型，成为多倍体(Polyploid)、异倍体(Heteroploid)或其它形式的变化。其中以异倍体居多，培养细胞经常发生着异倍化，可视为是细胞随环境的变化呈现自然选择和淘汰的过程。结果导致在细胞中可存在几个不同核型的细胞系；当某一核型的细胞，在该细胞群中居多数时，具有该数值染色体数的细胞群即称为干系(Stem Line)，也叫众数或主流数。主流细胞可能是有生长优势的细胞群。不同细胞系(或株)，或同一细胞系处于不同代，它们的主流数皆可有别。,(,二,),永生化和恶变,细胞永生化也称不死性，是细胞获得持续生长增殖能力的特性。而恶性细胞不仅能长期增殖生长并有异体接种致瘤性。,在体外培养的正常细胞有两个主要的特征，一是具有二倍体核型，二是增殖生长期是有限的。,而永生化的细胞则具有无限增殖生长性，长期传代不死，并多伴有核型改变。,早年曾把永生性和恶变视为同一，近年研究证明两者是细胞两种不同的性状。永生化的细胞不一定具有恶性，但却易进一步演变成恶性细胞，因此人们认为永生化可能为癌变过程中的一个阶段。,(,三,),细胞性别,女性的两个x 染色体中的一个在间期时呈明显的异固缩(Heteropycnoeis)状态，呈三角形或半月状小体，紧附在核膜内面，称巴氏小体(Barrs body)；男性Y 染色体在间期则形成颗粒状Y 小体，位于胞核的近中央部位。女性细胞的巴氏体和男性的Y 小体在培养细胞群中都可检测到。说明培养细胞仍保持着性别特征。,用特殊染色法可显现出巴氏体和Y 小体。初代培养细胞易于显现，细胞系或已发生转化细胞有可能发生改变。,七、细胞和细胞、细胞和基质的相互关系,细胞在体外培养系统中，在一定条件下，单个细胞也能生存和增殖生长，表现有很大的独立性。但这并不说明组织培养中的细胞都是独立的，单个细胞不是细胞永久存在的形式，它不能长期生存。一个有活力的细胞终需经过繁殖形成群体，只有群体细胞才是培养细胞的基本存在形式。组织培养细胞和体内组织相似，细胞与细胞之间仍具有在形态上和机能上的相互依存关系。在结构上，上皮细胞仍见有桥粒；有证明，当向群体中一个细胞内注入荧光素后数分钟，此细胞周围的其它细胞中便可发生荧光，说明细胞间能进行扩散。已观察到在体外培养细胞之间存在有管状结构的连接物。,在生理活动上，单个细胞虽能生长繁殖，但不如群体细胞生存力强，细胞量多时比少时易于培养，说明细胞之间能相互沟通信息。例如正常细胞培养中，一旦两相邻的细胞发生接触，便呈接触抑制现象，导致运动停止。以上这些，都是细胞相互沟通生物信息的结果，使细胞呈现着相互依存性或群体依赖性(Population Dependence：PD)。正常细胞群的PD 比转化细胞大，转化细胞和恶性化细胞PD 小，即PD 与细胞恶性成反比关系；恶性细胞独立生存能力增大。单细胞培养和软琼脂培养是检测细胞PD 的常用方法。,体内细胞的分化等功能与细胞外基质(Extracellular Matrix：ECM)有密切关系，离体培养细胞对ECM仍有依存性。,细胞凋亡(Apoptosis),美国科学情报研究所（ISI）1997年SCI（Science Citation Index）收录及引用论文检索，全世界自然科学研究中论文发表最集中的三个领域分别是：,细胞信号转导,（signal transduction）；,细胞凋亡,（cell apoptosis）；,基因组与后基因组学研究,（genome and post-genomic analysis）,。,细胞凋亡的概念及其生物学意义,细胞凋亡的形态学和生物化学特征,细胞凋亡的分子调控机理,细胞凋亡与疾病,细胞凋亡(Apoptosis),早在1972年Kerr等已发现从细胞形态、超微结构和生化变化等方面来分析，细胞有二种死亡形式,一种是早被熟知的细胞坏死,（Necrosis）,，另一种是新提出的程序性细胞死亡,（Programmed cell death,PCD）,学说。但该学说到九十年代初才进入研究高潮，进展极快，现在普遍称之为,细胞凋亡（Apoptosis）,细胞凋亡,由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞死亡过程,是一个由基因,调控,的细胞,主动,结束生命的过程,细胞凋亡与细胞坏死的区别,坏死 凋亡,例如,蝌蚪尾的消失,脊椎动物的神经系统的发育,发育过程中手和足的成形过程,细胞凋亡的生理意义,确保正常发育、生长,维持内环境稳定,发挥积极的防御功能,细胞凋亡是正常的生理过程，但是凋亡可能会引起疾病发生。因此，近年来对于细胞凋亡的研究，已成为自然科学界的关注热点。,形态学特征,凋亡的起始：细胞器、染色质等开始变化,凋亡小体的形成：质膜包裹染色质和细胞器,凋亡小体的消化：被吞噬细胞消化,生物化学特征,胞浆内Ca,2+,浓度升高。,细胞内活性氧增多。,质膜通透性变大。,DNA内切酶活性被激活升高，双链DNA在核小体之间切断形成180200bp为基数的有序片段。,型谷氨酰胺转移酶和需钙蛋白酶（Calpain）活性升高。,典型凋亡细胞DNA琼脂糖凝胶电泳呈现梯状条带,凋亡相关因素,诱导性因素,激素和生长因子失衡,理化因素：高温、强酸、强碱、抗癌药物,免疫性因素,微生物学因素：细菌、病毒,抑制性因素,细胞因子：IL-2，神经生长因子,某些激素,某些二价金属阳离子、药物,凋亡的基因调控,抑制凋亡基因：Bcl-2，EIB，IAP,促进凋亡基因：P53，Bax，ICE,双向调控基因：c-myc，Bcl-x,Caspase家族,凋亡的执行者,Caspase活性位点是半胱氨酸，裂解靶蛋白位点是天冬氨酸残基后的肽键，因此称为Cysteine aspartic acic specific protease，即Caspase,特点：前体形式存在,级联反应,作用：,灭活凋亡抑制物,水解蛋白质结构，形成凋亡小体,水解凋亡相关活性蛋白,Caspase 如何杀死细胞？,使抑制凋亡因子失活，如CAD/ICAD,破坏细胞结构，如Lamina,将调节区与催化区分离，使蛋白失活，如Gelsolin,细胞凋亡的途径,Hengartner,M.O.2000.,Nature,.,407,:770.,Green,D.and Kroemer,G.1998.,Trends Cell Biol.,8,:267.,Mitochondrial Pathway,Death Receptor Pathway,FasL,Caspase 3,D,D,D,D,Fas/Apo1,/CD95,FADD,Procaspase 8,Caspase 8,BID,oxidants,ceramide,others,Bcl-2,D,Cytochrome,c,dATP,Procaspase 9,Apaf-1,dATP,Apaf-1,Caspase 9,Procaspase 3,apoptosome,DNA damage,Cellular targets,细胞凋亡发生的时间过程,细胞凋亡与肿瘤,细胞凋亡在疾病防治中的意义,可以通过不同的手段在不同的阶段进行干预而治疗疾病,合理利用凋亡相关因素,干预凋亡信号转导,调节凋亡相关基因,控制凋亡相关酶学机制,第一节 细胞衰老,细胞衰老又称为老化，通常指生物发育成熟后，在正常情况下随着年龄的增加，机能和结构发生退行性变化，从而趋向死亡的不可逆现象。,细胞衰老的特征,细胞衰老的分子机理,一、细胞衰老的特征,（一）形态变化,二、细胞衰老的分子机理,（一）差错学派,差错学派认为细胞衰老是各种细胞成分在受到内外环境的损伤作用后，因缺乏完善的修复，使“差错”积累，导致细胞衰老。,代谢废物积累学说：,脂褐质的积累,大分子交联学说：,DNA交联和胶原交联,自由基学说,体细胞突变学说：,突变积累和功能基因的丧失,DNA损伤修复学说,二）遗传学派,遗传学派认为衰老是遗传决定的自然演进过程，一切细胞均有内在的预定程序决定其寿命。,细胞有限分裂学说：Hayflick界限,重复基因失活学说：延迟衰老,衰老基因学说：衰老基因,