3-2++细胞生物学研究方法.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二节 细胞组分的分析方法,离心分离技术,细胞内核酸、蛋白质、酶、糖与脂类等的显示方法,特异蛋白抗原的定位与定性,细胞内特异核酸的定位与定性,放射自显影技术,定量细胞化学分析技术,一、离心分离技术,定义：,根据细胞中的各颗粒（亚细胞成分和生物大分子及其复合物）在离心场中,沉降速率,不同，而把它们区分开来的技术，用来研究细胞内的细胞器和其他组分的化学性质和功能。,按转速分：,普通离心机、高速离心机、超速离心机（,110,5,g,以上）。,按分离基础不同分：,差速离心,：分离,密度,不同的细胞组分。,密度梯度离心,：,精细,组分或生物大分子的分离。,基本原理,:,当悬浮液静止不动时，由于重力场的作用，较大的悬浮颗粒会逐渐沉降，颗粒越重下沉越快，反之会上浮。但很小的颗粒不仅沉降速度慢，而且扩散现象严重，很难或根本无法沉降。这样就需离心的方法产生出,离心力场,，使之产生沉降。,一般步骤：,匀浆化：破坏细胞，使细胞崩解。方法有：低渗、超声波粉碎、强制过滤、研磨等；,离心处理；,收集分析。,沉降系数（,Sedimentation Coefficient,）,颗粒在离心场中的沉降速度的大小与,颗粒大小、形状、密度、离心力、悬浮介质的密度和粘度有关,。单位离心力场中溶质分子的沉降速度称为沉降系数通过下式计算：,S=dx/dt/,2,x,x,：颗粒到转头中心距离（,cm,）；,.,：角速度（弧度,/,秒）；,dx/dt,：沉降速度；,S,：沉降系数（单位：秒）。,各种颗粒都有一定的沉降系数，习惯上（规定）把,10,-13,秒作为一个沉降系数单位，简写成,S,（,Svedberg unit,，斯维得伯格单位，瑞典人，,1926,年设计超速离心机，因此,获诺贝尔奖。）,如某一蛋白质的沉降系数为,5S,，说明它的沉降系数实际上是,510,-13,秒，,S,值越大，说明颗粒的沉降速度越大。,离心机转数（转,/,分，用,rpm,或,r/min,表示）与重力加速度（,g,）是什么关系呢？,相对离心力（,RCF,）以重力常数（,980 cm/,秒）的倍数表示：,RCF,（,g,）,=4,2,（,rpm,）,2,r/3600980,，整理化简,g=1.1110,-5,（,rpm,）,2,r,。实际应用时可查表直接得出。,离心方法的选择,根据分离对象和目的不同，采用不同的离心方法。,制备离心,(preparative centrifuge),分离和纯化亚细胞成分和大分子，目的是制备样品。,差速离心法,：是,最常用,的方法，根据不同离心速度所产生的不同离心力，将各种亚细胞组分和各种颗粒分离开来。,此方法可有效的分离,大小上差别较大,的颗粒，但,不能分离大小相似的颗粒,，而且分离出来的组分往往不纯，混有其他性质的颗粒。,差速离心,（,P64,图,3-18,）,二、细胞成分显示方法,原理：,利用一些,显色剂,与所检测物质中一些,特殊基团特异性结合的特征，通过显,色剂在细胞中的,定位,及颜色的,深浅,来,判断某种物质在细胞中的,分布和含量,。,一）化学显示剂法,基本原理：利用某些,化学物质,和某些细胞成分发生化学结合，从而显示出一定的颜色，进行定性和定位研究的方法。,1,、,Feulgen reaction,酸水解去除,RNA,，并除去嘌呤，醛基与希夫（,schiff,）试剂作用形成紫红色。,2,、,Brachet reaction,甲基绿,派罗宁染色显示,RNA,3,、,P.A.S reaction,过碘酸氧化作用破坏多糖的,1,，,2,乙二醇基，使醛基暴露，与,Schiff,试剂作用显示紫红色。,4,、四氧化锇与不饱和脂肪酸反应呈黑色，由此证明脂肪滴的存在。,5,、碱性磷酸酶的格莫瑞法（,Gomori,）,碱性磷酸酶,Ca,2+,转变,甘油的磷酸脂,释放,P0,4,3-,Ca,3,（,P0,4,）,2,金属银、硫化铅等有色化合物。,三、特异蛋白抗原的定位与定性,免疫荧光技术,：,快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限。,免疫电镜技术,：,免疫铁蛋白技术（已很少用）,免疫酶标技术,免疫胶体金技术,应用：通过对分泌蛋白的定位，可以确定某种蛋白的,分泌动态,；,胞内酶的研究,；膜蛋白的定位与骨架蛋白的,定位,等,。,基本原理,：,将免疫学中抗原、抗体以及补体间专一性反应结合显微或亚显微组织学的一些研究方法的统称。是免疫学原理与光镜或电镜技术的结合。,一般说来，发生在组织细胞内的抗原抗体反应是不可见的，但如果事先将某种,荧光素、酶、同位素、铁蛋白,等用生化方法标记在抗体分子上（标记抗体），或用血清学方法将酶与其抗体形成可溶性物质，就能凭借特殊光镜及电镜等观察标本中的,荧光现象、酶作用的沉淀物（颜色）、放射线径迹及高电子密度物质的有无和部位,，由此判断是否发生了特异性的抗原抗体反应以及抗原物质的定位分布。,因此利用此技术可以：,1,）对细胞表面或细胞内部的抗原进行,定位,；,2,）了解抗体合成过程中的,动态变化,；,3,）抗原,抗体复合物,结构细节；,4,）鉴定免疫损伤引起的,细胞病理变化,等。,一般步骤：,1,、抗原的选择,抗原：能引起抗体产生的外源性物质称为抗原。可由分离获取或直接购买（商品抗原）。蛋白质分子量在,1,万以上，才有较好的抗原性。各种抗原分子表面有特殊的基因，这些基因在组成、排列和空间结构上的不同，决定着抗原,抗体反应的特异性。,抗原分为：,天然抗原 来源于动、植物、细菌、病毒；,人工抗原 经化学修饰的天然抗原；,合成抗原 化学合成的高分子。,2,、抗体分离与提纯,当需要某种抗体时，要用特异抗原对动物进行免疫（即用抗原物质反复给动物或人体注射），然后再从人体或动物的血清中提取该抗体。完成这一工作常采取戊二醛直接交联法和蛋白质,A,亲合层析法。,3,、抗体的标记,抗体标记的方法很多，有铁蛋白标记法、免疫酶标记法、免疫金标记法、杂交抗体标记法、搭桥标记法、同位素标记法、荧光标记法等，以下介绍几种常用标记法。,（,1,）免疫荧光法,（荧光标记抗体法）,用结合有荧光素的抗体与组织内抗原反应，在荧光显微镜下观察抗原的存在部位。也可分为直接法和间接法。,直接法：抗体直接与荧光素相连,间接法：先用一种抗体（第一抗体）结合到抗原部位，然后再用能识别第一抗体的另一抗体（,第二抗体,）把标记物引入抗原部位。是在抗原,抗体一级反应的基础上，又增加了同第一抗体反应的荧光素标记的第二抗体。,间接免疫法,只需标记一种或少数几种第二抗体,，就可适应多种研究对象的需要，并且由于第一抗体的一个分子可能为第二抗体提供多个结合位点，故具有,染色放大,的作用。,免疫荧光技术,（,2,）免疫电镜技术,胶体金标记抗体,胶体金是利用还原剂将氯化金分子聚合成具有特定大小的颗粒结构，,1970,年引入免疫电镜技术。由于胶体金颗粒可以制成,预定的大小,，形态规则，电子密度高，对细胞,无毒,性等优点，故是当今最为广泛的标记物。,当用免疫球蛋白包被胶体金后则称为免疫金，是一种在光镜或电镜下易辨认的标记物。,胶体金可以直接与抗体连接形成免疫金，导至抗原部位，称为,直接免疫法,。也可以先用一种抗体（第一抗体）结合到抗原部位然后用可以识别第一抗体。的另一抗体（第二抗体）把标记物（胶体金）引入同一部位。这称为,间接免疫法,。,免疫胶体金技术,免疫酶标技术,：,1966,年由,NaKane,和,Piere,提出。用双功能的偶联剂使酶与抗体相结合形成酶标抗体。最常用的酶是,辣根过氧化物酶,（,HRP,），是一种氧化还原酶，其抗体与体内相应抗原结合，然后利用其酶的特殊催化作用使底物转变成电子致密的沉淀物，从而在电镜下检出抗体的反应部位，用以定位和定量检测抗原。如：抗羊,球蛋白用过氧化物酶标记，用以催化,H,2,O,2,+,二氨基联苯胺形成棕色密电子沉淀物。,四、细胞内特异核酸的定位与定性原位杂交（,in situ,hybridization,ISH,）,1.,原理,用标记的核酸探针通过分子杂交（变性,-,退火,-,复性）确定特异核苷酸序列在染色体上或在细胞中的位置的方法称为原位杂交。可以在细胞标本或组织标本上进行。,2.,标记物,同位素如,3H,、,35S,、,32P,、,荧光（,FISH,）探针核苷酸标记报告分子（生物素、地高辛）与被荧光标记的亲和素特异性结合而显荧光。,胶体金,3.,应用,基因定位（,FISH,在小麦远缘杂交中的利用）、特异,mRNA,表达,五、放射自显影技术,(,动态,),1.,原理及应用：,利用同位素的放射自显影（电离辐射的感光作用），对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；,用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。,2.,步骤：,渗入：,放射性同位素标记生物大分子前体（常用同位素,P68,表,3-3,），,前体物,导入生物体内,（持续标记和脉冲标记）；,由于有机大分子均含有碳、氢原子，故实验室一般常选用,14C,和,3H,标记。,14C,和,3H,均为弱放射性同位素，半衰期长，,14C,为,5760,年，,3H,为,12,年。一般常用,3H,胸腺嘧啶脱氧核苷,（,3H-TDR,）来显示,DNA,，用,3H,尿嘧啶核苷,（,3H-UDR,）显示,RNA,；用,3H,氨基酸研究蛋白质，研究多糖则用,3H,甘露糖、,3H,岩藻糖等。,制片、敷胶：,经过一段时间后，取材制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶；,曝光：,经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光，,自显影（曝光）数天，如制超薄切片，乳胶单层晶体层，曝光数月；,显影：,然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒；,镜检：,分析自显影图像（光显，电显）即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。,（,P69,图,3-22,）,六定量细胞化学分析技术,（一）,流式细胞仪（,Flow Cytometry,，,FCM,）,对,单个,细胞进行,快速定量分析,和,分选,的装置。它可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞的一系列重要的生物物理、生物化学方面的特征参量，并可以根据预选的参量范围把指定的细胞亚群从中分选出来。,（二）,细胞显微分光光度术（,Microspectrophotometry,）,利用细胞内某些物质对特异光谱的吸收，测定这些物质（如核酸与蛋白质等）在细胞内的含量。,包括：,紫外光显微分光光度测定法,可见光显微分光光度测定法,（一）,流式细胞仪（,Flow Cytometry,，,FCM,）,将流体喷射技术、激光技术、空气技术、,射线能谱术及电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种非常先进的检测仪器。通过测量细胞及其他生物颗粒的,散射光,和,标记荧光强度,，来快速分析颗粒的物理或化学性质，并可以对细胞进行,分类收集,，可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行,定性或定量,分析，具有,速度快、精度高、准确性好,等特点。,P70,图,3-23,用于定量测定细胞中的,DNA,、,RNA,或某一特异蛋白,的含量。,测定细胞群体中不同,时相,细胞的数量；,从细胞群体中,分离,某些,特异染色,的细胞；,主要应用：,细胞周期,-DNA,倍体分析、,DNA,含量分析；,免疫学,-,对淋巴细胞分析，鉴别免疫功能状态，药物筛选,;,肿瘤诊断,-,癌基因蛋白产物、,DNA,含量测定是鉴别良,性、恶性肿瘤的特异指标。,基本原理,光是电磁波，具有不同分子结构的无机、有机体系，对电磁波都可显示出,选择性吸收的特性,，根据这一特性，可以进行无机、有机体系的定性、定量分析，也可对生命过程中的物质变化进行动力学的分析。,（二）细胞显微分光光度术,（,Microspectrophotometry,）,代表仪器,Univar,扫描显微分光光度计,结构包括：显微镜、光度测量装置、电学系统、电子计算机等。,功能包括：透射、落射、明视野、暗视野、萤光、相差、微分干涉、微处理机、打印绘图机、电视录放相系统。,补充,:,细胞电泳,原理：在一定,PH,值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。,利用,：活细胞分离（,X,、,Y,精子），研究生命结构的表面性质，鉴定细胞或单细胞有机体的功能和病理状态。,第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术,一、,细胞的培养,二、,细胞工程,一、细胞培养,定义：,从机体取出某种组织或细胞，模拟机体内的生理条件使其在,体外,生存、生长和繁殖的过程。是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。,(,一,),动物细胞培养,（二）,植物细胞,（三）,非细胞体系（,cell-free system,）,（一）,动物细胞培养,1.,动物细胞培养的条件：,液体合成,培养基，通常含,动物血清,。,无菌、无毒的环境：,对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还要在培养液中加入一定量的的,抗生素,，以防被污染。此外应,定期更换,培养液，以便清除代谢产物防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害。,营养物质：,无机物（无机盐、微量元素等），有机物（糖、氨基酸、促生长因子等）,血清和血浆,(,提供细胞生长必须的营养成份,),温度和,pH,（,36.50.5,，,7.27.4,）,气体环境,（,95%,的空气,+,5%CO,2,的混合气体,）,其中,5%CO,2,气体是为保持培养液的,pH,稳定,2.,基本过程,选材：,取动物,胚胎或幼龄,动物器官无菌处理。,消化分散：,将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），形成分散的,单个细胞,，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的,细胞悬浮液,。,无菌培养：,原代培养,（生物性状未发生较大改变，在一定程度反映体内状态）,细胞贴壁,（几十分钟至数小时后，,小牛血清,利于贴壁）,当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现,接触抑制,。（非正常 细胞如癌细胞除外）。,单层细胞培养,（空间、营养减少）此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。再配成一定浓度的细胞悬浮液。,传代培养,（即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。可单层细胞培养，也可悬浮培养获得大量细胞，但条件复杂。）,危机,1,：,传,10,代,左右生长停滞、衰老死亡,-,多数,危机,2,：,少数细胞可传,40-,50,代，遗传物质不变和接触抑制,-,有限细胞系,遗传突变,，失去接触抑制，无限传代,-,永生细胞系,选择有用单个细胞增殖,-,细胞克隆,生物学鉴定，具有特殊遗传标记或性质,-,细胞株,细胞系,Hela,细胞（左）、,CHO,细胞（右）的培养,成纤维样细胞：,指棱形的平行排列或交叉成网的细胞,上皮样细胞：,指形态规则，边缘清晰，排列紧密的六角形细胞,动物细胞培养技术的应用,1.,生物制品的生产,(,如制备单克隆抗体）,2.,转基因动物的培养,3.,检测有毒物质并判断其强弱,4.,医学研究（生理 病理 药理）,5.,器官移植培养,6.,筛选抗癌药物,动物细胞培养与植物组织培养的区别,1.,培养基不同：,植物细胞（固体培养基），动物细胞（液体培养基）。,2.,培养基的成分不同：,动物细胞培养必须利用动物血清，植物组织培养则不需要。,3.,产物不同：,植物组织培养最后一般得到新的植物个体，而动物细胞培养因为动物体细胞一般不能表达其全能性，因此得到的是同一种的细胞。,4.,原理不同：,植物组织培养的原理为植物细胞的全能性，动物细胞培养的原理为细胞的增殖。,5.,过程不同：,植物组织培养的过程为脱分化和再分化，动物细胞培养的过程为原代培养和传代培养。,非细胞体系：,指来源于细胞，而不具备完整的细胞结构与成分，但包含了进行正常生物学反应所需物质组成的体系。主要用于研究,DNA,复制、,RNA,转录、蛋白质合成、细高尔基体的膜泡运输机制以及胞核组装配等方面的问题。,例如：非洲爪蟾卵提取物非细胞体系,P73,图,3-25,（三）非细胞体系在细胞生物学研究中的应用,二、细胞工程,细胞工程是生物工程的一个重要方面。总的来说，它是应用细胞生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的,设计,蓝图，进行在,细胞水平上的遗传操作,及进行大规模的细胞和组织培养。,细胞工程的主要研究内容：,（一）,细胞融合,（新的物种或品系）,（二）,单克隆抗体技术,（三）,细胞拆合与显微操作,细胞核移植（无性繁殖、克隆动物）,染色体工程（多倍体育种，例：八倍体小黑麦）,胚胎工程（优良品种、试管婴儿）,干细胞与组织工程（胚胎干细胞、组织干细胞）,转基因生物与生物反应器（转基因动物、转基因植物）,、,（一）,融合核细胞,（两个核融合为一个核）,（二）单克隆抗体（,monoclone antibody,）技术,（三）细胞拆合与显微操作,细胞拆合：也叫细胞核移植,，即,利用物理或化学的方法，从活细胞中分离出细胞核与细胞质，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞核和细胞质重组，使其装配成具有生物活性的核质杂交细胞。用于探明细胞核质互作关系。,这一技术首先要制备核体和胞质体，最常使用方法是,物理法结合显微操作技术,化学法结合离心技术制备,中国胚胎学家,童第周,先生等在鱼类细胞核移植方面做了许多工作。他们在,1976,年前后首次获得的,鲤鲫移核鱼,，不仅有理论意义，而且也为鱼类,育种,开辟了一条新的途径。,镜下,0.1-0.5,微米,玻璃微量注射器将外源物注入细胞。,显微切割：,显微切割术,(microdissection),是,90,年代初发展起来的一门新技术，它能够从组织切片或细胞涂片上的任一区域内切割下几百个、几十个同类细胞，甚至单个细胞，再进行有关的分子生物学方面的研究，如,PCR,，,PCR,SSCP,及比较基因组杂交等。尤其适用于,肿瘤的分子生物学,研究，如肿瘤的克隆性分析，肿瘤发生和演进过程中各阶段细胞基因改变的比较研究和肿瘤细胞内某些酶活性的定量检测等。该技术的不足之处是使用手工操作的技术难度大。,光镊技术：,激光聚集可形成光阱，微小物体受光压而被束缚在光阱处，移动光束使微小物体随光阱移动，借此可在显微镜下对微小物体,(,如,病毒,、细菌以及细胞内的,细胞器,及细胞组分等,),进行的移位或手术操作。,