肝衰竭患者外周血单个核细胞hTERT mRNA及血清Ang-2和ICAM-1水平临床意义探讨.pdf

基金项目:上海市医药科技攻关计划项目(编号:201901151)作者单位:202150 上海市 上海健康医学院附属崇明医院消化内科(赖华梅,杨玉健);教学办公室(王俊)第一作者:赖华梅,女,40 岁,医学硕士,主治医师。E-mail:通讯作者:王俊,E-mail:肝衰竭肝衰竭患者外周血单个核细胞 hTERT mRNA及血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平临床意义探讨赖华梅,王 俊,杨玉健【摘要】目的 初步探讨肝衰竭患者外周血单个核细胞人瑞粒酶逆转录酶(hTERT)mRNA 及血清血管生成素-2(Ang-2)和细胞间黏附分子-1(ICAM-1)水平变化的临床意义。方法 2019 年 1 月 2021 年 5 月我院诊治的 74 例肝衰竭患者【亚急性肝衰竭(SALF)13 例,慢加急性肝衰竭(ACLF)39 例和慢性肝衰竭(CLF)22 例】和同期健康体检者 30 例,分离并检测外周血单个核细胞(PBMC)hTERT mRNA 水平,采用 ELISA 法检测血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平。结果 肝衰竭组 PBMC hTERT mRNA、血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平分别为(0.90.3)、(1344.655.3)ng/L 和(540.222.4)ng/ml,显著高于健康人组【分别为(0.40.1)、(1062.536.2)ng/L 和(167.315.6)ng/ml,P0.05】;SALF 患者 PBMC hTERT mR-NA、血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平分别为(1.50.6)、(1507.838.2)ng/L 和(647.326.2)ng/ml,显著高于 ACLF 患者【分别为(1.20.4)、(1398.635.8)ng/L 和(582.724.1)ng/ml,P0.05】或 CLF 患者【分别为(0.70.2)、(1280.546.3)ng/L 和(468.920.3)ng/m,P0.05】;经过 1 3 m 治疗,SALF 组死亡 3 例,ACLF 组死亡 5 例,CLF 组死亡 4 例。结论肝衰竭患者 PBMCs hTERT mRNA 及血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平显著升高,它们可能为判断肝损伤程度提供客观依据,值得进一步研究。【关键词】肝衰竭;外周血单个核细胞;人瑞粒酶逆转录酶;血管生成素-2;细胞间黏附分子-1 DOI:10.3969/j.issn.1672-5069.2023.06.021Clinical implications of peripheral blood mononuclear cell hTERT mRNA and serum Ang-2 and ICAM-1 levels inpatients with liver failure Lai Huamei,Wang Jun,Yang Yujian.Department of Gastroenterology,Chongming Hospital Affiliatedto Shanghai Medical College of Health,Shanghai 200000,China【Abstract】Objective The purpose of this study was to explore clinical implications of peripheral blood mononuclear cell(PBMC)human telomerase reverse transcriptase(hTERT)mRNA and serum angiopoietin-2(Ang-2)and intercellular adhesionmolecuLe-1(ICAM-1)levels in patients with liver failure(LF).Methods 74 patients with LF,including subacute liver failure(SALF)in 13 cases,acute-on-chronic liver failure(ACLF)in 39 cases and chronic liver failure(CLF)in 22 cases,wereadmitted to our hospital between January 2019 and May 2021,and 30 healthy individuals who had physical examination in ourhospital during the same period were selected as the control group.The PBMC hTERT mRNA was assayed by PCR,and serum Ang-2 and ICAM-1 levels were detected by ELISA.ResultsThe PBMC hTERT mRNA,serum Ang-2 and ICAM-1 levels inpatients with LF were(0.90.3),(1344.655.3)ng/L and(540.222.4)ng/ml,significantly higher than(0.40.1),(1062.536.2)ng/L and(167.315.6)ng/ml,respectively,P0.05 in the healthy control;the PBMC hTERT mRNA,serumAng-2 and ICAM-1 levels in patients with SALF were(1.50.6),(1507.838.2)ng/L and(647.326.2)ng/ml,allsignificantly higher than(1.20.4),(1398.635.8)ng/L and(582.724.1)ng/ml,respectively,P0.05 in patients withACLF or(0.70.2),(1280.546.3)ng/L and(468.920.3)ng/m,respectively,P0.05 in patients with CLF;at the endof one to three month treatment,three patients with SALF,five patients with ACLF and four patients with CLF died in our series.Conclusion The PBMC hTERT mRNA as well as serum Ang-2 and ICAM-1 levels in patients with LF increase,which might behelpful in judging the severity of the entity and warrants further clinical investigation.【Key words】Liver failure;Human telomerase reversetranscriptasemRNA;Peripheralbloodmononuclearcells;Angiopoietin-2;Intercellular adhesion molecule-1 肝衰竭是严重肝脏损害导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能障碍,出现以黄疸、肝性脑病和凝158实用肝脏病杂志 2023 年 11 月第 26 卷第 6 期 J Prac Hepatol,November.2023.Vol.26 No.6血功能障碍等为特征的临床症候群1,其病死率高达 60%80%。临床上,往往出现全身各种并发症,如感染、消化道出血和肝性脑病等,严重威胁患者生命安全2。因此,早诊断和治疗至关重要。端粒酶是一种 RNA 依赖性 DNA 聚合酶,能合成端粒末端重复序列,在维持细胞增殖过程中发挥重要的作用。端粒酶包含功能性人端粒酶 RNA(human telomeraseRNA,hTR)和人端粒酶反转录酶(human telomerasereverse transcriptase,hTERT)催化亚单位,后者是端粒酶发挥作用的活性成分。细胞 hTERT mRNA 水平与端粒酶活性密切相关3。有报道显示,肝衰竭患者血清血管生成素和细胞黏附分子水平有显著变化4,5,细胞间黏附分子-1(intercellular adhesionmolecule-1,ICAM-1)作为免疫球蛋白超家族的一员,通过介导细胞与细胞外基质之间的粘附和信息传递,在肝损伤的发病机制中发挥重要作用6。血管生成素-2(angiogenin-2,Ang-2)可调节内皮细胞的生理功能,有利于血管生成7。本研究检测了肝衰竭患者外周血单个核细胞(PBMCs)hTERT mRNA水平及血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平变化,以期为临床判断病情提供参考,现报道如下。1 资料与方法1.1 病例来源 2019 年 1 月 2021 年 5 月我院诊治的肝衰竭患者 74 例,男性 45 例,女性 29 例;年龄为30 75 岁,平均年龄为 52.76.3 岁。诊断符合肝衰竭诊 治 指 南8的 标 准,其 中 亚 急 性 肝 衰 竭(subacute liver failure,SALF)13 例,慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)39 例和慢性肝衰竭(chronic liver failure,CLF)22 例;乙型肝炎37 例,丙型肝炎 12 例,酒精性肝硬化 17 例,药物性肝损伤 8 例;早期 23 例,中期 35 例,晚期 16 例。排除标准:(1)存在血液系统疾病;(2)合并恶性肿瘤;(3)伴有精神疾病。另选择同期于我院体检的健康人 30 例作为对照组,男性 20 例,女性 10 例;年龄为30 75 岁,平均年龄为51.86.5 岁。本研究经我院医学伦理委员会审核、通过。1.2 治疗方法 给予血制品、利尿和抗生素治疗。给予异甘草酸镁(正大天晴药业集团股份有限公司,国药准字 H20051942)150 mg 加入 5%葡萄糖溶液250 ml 中静脉滴注,1 次/d,给予腺苷蛋氨酸(重庆药友制药有限公司,国药准字 H20050667)1000 mg加入5%葡萄糖溶液250 ml 中静脉滴注,1 次/d。持续治疗 4 8 w。1.3 外周血单个核细胞(PBMCs)hTERT mRNA 检测 于清晨空腹采集静脉血 3 mL,肝素抗凝,4 2000r/m 离心 15 min,-80 保存待测。提取细胞 RNA,将沉淀的 RNA 干燥,溶解 RNA,测定 260 280 吸光值,计算 RNA 含量,并用其合成 cDNA;引物构建:端粒酶 hTERT 引物从 LternetGenBank 中调出 hTERTmRNA 全基因系列,应用软件设计引物,上游引物为5-TATGcC GTG GTC CAG AAGG-3,下游引物为5-GCG TGGCTG AGG TGA GGTCT-3。扩增长度为328 bp,内参照上游引物为 5-GAT TGC CTC AGGACATTT CTG-3,下游引物为 5-GCG TGG GTG AGTGAGGT CT-3。扩增片段长度为 690 bp;cDNA 合成:使用 RT-PCR 试剂盒逆转录合成 cDNA,每个反应体系中加入总 RNA 1 L,加入2 buffer 5 L,Mg-SO42 L,dNTPs 0.5L,逆转酶(AMV)0.5L,oligod-T150.5L,RNase-inhibitor 0.25 L,dd.H2O0.25L。将上述反应物放入 PCR 仪 65 1 min,30 5 min,30 65 15 30 min 匀速升温,6530 min,98 5 min,5 5 min,将合成好的 cDNA 存于-20备用;内参照定量 PCR:在 PCR 反应体积中吸取 cDNA 1L,加入 dd.H2O 9.5L,10 buffer1.25L,dNTP 1L,Taq 酶 0.1L,hTERT-R0.1L,hTERT-f 0.1L。放入 PCR 仪内扩增,反应条件为 93预变性 3 min,94 45 s,57.6 1 min,72 1 min,共 35 个循环;PCR 产物鉴定:取 10 buffer 1 h,将 TERT mRNA 的 PCR 产物在 20 g/L 的琼脂糖凝胶中电泳,在紫外凝胶扫描仪观察拍照,并存入 1D Kadak 成像分析系统,计算出端粒酶 hTERTmRNA 水平。1.4 血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平及血生化指标检测 采用 ELISA 法检测血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平(上海哈灵生物科技有限公司);使用全自动生化仪检测血生化指标和血氨水平(深圳市希莱恒医用电子有限公司)。1.5 统计学分析应用 SPSS Statistics 21.0 软件行统计学分析,对正态分布的计量资料以(xs)表示,采用 t 检验,多组间比较采用 F 检验。P0.05 提示差异有统计学意义。2 结果2.1 两组 PBMCshTERT mRNA 及血清 Ang-2 和ICAM-1 水平比较 肝衰竭组 PBMCs hTERT mRNA及血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平显著高于健康人组(P0.05,表 1)。258实用肝脏病杂志 2023 年 11 月第 26 卷第 6 期 J Prac Hepatol,November.2023.Vol.26 No.6表 1 两组 PBMC hTERT mRNA 及血清 Ang-2和 ICAM-1 水平(xs)比较例数hTERTmRNAAng-2(ng/L)ICAM-1(ng/ml)肝衰竭740.90.31344.655.3540.222.4健康人300.40.11062.536.2167.315.6 与健康人组比,P0.052.2 不同类型肝衰竭患者 PBMC hTERT mRNA 及血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平比较SALF 组 PBMCshTERT mRNA 及血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平显著高于 ACLF 组或 CLF 组,而 ACLF 组 PBMCs hTERTmRNA 及血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平显著高于 CLF组(P0.05,表 2)。表 2 不同类型肝衰竭患者 PBMC hTERT mRNA及血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平(xs)比较例数hTERTmRNAAng-2(ng/L)ICAM-1(ng/ml)SALF131.50.61507.838.2647.326.2ACLF391.20.41398.635.8582.724.1CLF220.70.21280.546.3468.920.3 与其他两组比,P0.05;与 CLF 组比,P0.052.3 不同类型肝衰竭患者肝功能指标变化情况经过 1 3 m 治疗,SALF 组死亡 3 例,ACLF 组死亡 5例,CLF 组死亡 4 例;各组肝功能指标变化见表 3。表 3 不同类型肝衰竭患者肝功能指标(xs)比较例数TBIL(mol/L)INRALB(g/L)血氨(mol/L)SALF 治疗前13447.2656.72.10.330.14.8376.542.1治疗后1032.74.51.30.535.86.260.810.1ACLF 治疗前39339.854.62.20.530.24.9341.236.7治疗后3423.75.81.20.332.65.444.525.8CLF 治疗前22350.947.22.20.727.74.6303.530.4治疗后1825.42.61.20.130.55.153.27.43 讨论肝脏具有合成、解毒、代谢、排泄和生物转化等重要功能,对人体的健康运行至关重要。但由于酒精、药物、病毒感染等因素导致肝脏损伤,进而导致肝脏多发性功能障碍或失代偿。肝功能衰竭的发展是危险和迅速的,且伴随高并发症和高病死率。因此,早诊断并进行针对性的干预措施具有非常重要的临床意义9,10。激活的端粒酶可以以端粒的 3 末端为引物,合成端粒末端的重复序列,维持端粒的长度,使细胞获得增殖能 力。人 类 端 粒 酶 由 功 能 性 RNA 成 分(hTR)和 hTERT 组成11。hTERT 是一个单拷贝基因,将 hTERT 基因转染端粒酶阴性的正常细胞可激活端粒酶活性,且在胚胎发育早期体细胞具有端粒酶活性12,13。报道显示,外周血 hTERT mRNA 可反映肝细胞增生状态14。Ang-2 作为一种强大的促炎症因子,近年来受到越来越多的关注,它能破坏内皮细胞的完整性,参与血管的形成和重建,增加血管的通透性15,被认为是内皮功能障碍的标志之一。Ang-2 通过激活 NAPDH 氧化酶刺激氧化应激,加重急性炎症反应。另一方面,Ang-2 还可通过激活内源和外源物质诱导多种组织和细胞凋亡,并具有促炎症、促氧化应激和凋亡等重要的功能。ICAM-1 是免疫球蛋白超家族成员,可引起白细胞粘附,增加血管阻力,损伤组织细胞,引起肝微循环障碍,进而影响肝细胞的营养和供氧,损害肝功能,引起休克和急性肝衰竭16。本研究结果显示,肝衰竭患者外周血单个核细胞 hTERT mRNA 水平及血清 Ang-2 和ICAM-1 水平显著高于健康人,提示外周血单个核细胞 hTERT mRNA 水平及血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平参与了肝衰竭的发生发展过程。同时本研究发现,SALF 患者 PBMCs hTERT mRNA 及血清 Ang-2和 ICAM-1 水平显著高于 ACLF 患者或 CLF 患者,ACLF 患者 PBMCs hTERT mRNA 及血清 Ang-2 和ICAM-1 水平显著高于 CLF 患者,提示在不同类型肝衰竭患者它们的变化可能不同。外周血单个核细胞 hTERT mRNA 水平及血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平越高,肝衰竭病情可能更重。根据肝衰竭的病理组织学特征和病情发展速度不同,肝衰竭诊治指南 将其分为急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)、SALF、ACLF 和 CLF。在我国,SALF、ACLF 和 CLF 较为常见,而在诊断肝衰竭358实用肝脏病杂志 2023 年 11 月第 26 卷第 6 期 J Prac Hepatol,November.2023.Vol.26 No.6的指标中,TBIL、INR、ALB、血氨等实验室指标为常规检查项目,能够反映病情的严重程度和肝损伤程度,与肝衰竭患者预后相关。本研究三组肝衰竭患者诊断明确,都达到了诊断标准。经过综合治疗,大部分患者获得治愈或病情控制,少部分患者死亡。肝衰竭时肝细胞被破坏,肝功能受到损伤,从而导致代谢障碍,故 TBIL、INR、ALB、血氨水平升高。CLF是在肝硬化基础上发生的肝功能进行性减退,肝纤维化严重,肝细胞功能丧失,肝脏合成白蛋白能力下降,故血清 ALB 水平较低17。经过治疗,三组大部分患者 TBIL、INR、血氨水平均降低,ALB 水平升高,说明综合治疗有效。异甘草酸镁是甘草酸的手性异构体,可减轻炎症反应,改善肝功能,并可稳定肝细胞膜,而腺苷蛋氨酸可通过诱导肝细胞有丝分裂,促进肝细胞再生,并可抑制细胞内脂质过氧化,保护线粒体,从而保护肝细胞,两种药物联合具有协同作用,可改善肝功能18。综上所述,肝衰竭 患 者 外 周 血 单 个 核 细 胞hTERT mRNA 水平及血清 Ang-2 和 ICAM-1 水平显著升高,临床可结合以上指标的变化早期对肝衰竭患者病情进行判断,为临床治疗提供参考依据。本研究属于单中心观察,例数尚少,病因分散,病情分期不一,可能对研究结果造成一定的偏倚,这些都需要扩大样本量进一步论证。【参考文献】1Keila R,Srivaths P R,Leyat T,et al.Regional citrate anticoagu-lation for continuous renal replacement therapy in pediatric patientswith liver failure.Plos One,2017,12(8):e0182134.2Wen Y,Peng S F,Fu L,et al.Serum levels of miRNA in pa-tients with hepatitis B virus-associated acute-on-chronic liver 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