肝癌细胞外泌体鉴定及其对肝细胞的影响.pdf

基础研究420-BME&Clin Med,July 2023,Vol.27,No.4生物医学工程与临床2 0 2 3年7 月第2 7 卷第4期网络出版时间：2 0 2 3-0 6-2 7 17：2 6：46 D0I：10.13339/j.c n k i.s g l c.2 0 2 30 6 2 6.0 0 1网络出版地址：https:/ Exos），探讨Hepal-6 Exos与小鼠正常肝细胞AML12共孵育时细胞摄取外泌体效率及对细胞增殖、调亡和细胞功能的影响。方法提取Hepa1-6Exos;透射电子显微镜和纳米颗粒分析仪鉴定外泌体形态和粒径分布；Westernblot实验检测外泌体特异性蛋白；免疫荧光技术分析AML12细胞摄取外泌体效率;CCK-8和transwell侵袭实验检测外泌体对AML12细胞增殖和调亡能力的影响；定量聚合酶链式反应(qPCR）和Westernblot实验分析外泌体对AML12细胞功能的影响。结果Hepal-6Exos呈茶托样形态，粒径为50 200nm，表达特异性蛋白CD9、C D 6 3和TSG101。A M L12 细胞可高效摄取Hepal-6Exos。与正常AML12细胞对照组相比,Hepal-6Exos可促进AML12细胞增殖，2 4h、48 h、7 2 h 细胞增殖率分别为（10.150.9 1）%、（16.6 11.56）%、（2 8.57 1.53）%（均P0.05）；与正常AML12细胞对照组相比，Hepa1-6Exos可抑制AML12细胞调亡,2 4h、48 h、7 2 h细胞调亡率分别为（2.8 10.17）%、（2.10 0.57）%、（1.9 6 0.8 5）%（均P0.05）。H e p a 1-6 Ex o s 能增强AML12细胞白蛋白（ALB)和1-抗胰蛋白酶(A1AT)的表达。结论Hepal-6 Exos可促进AML12细胞的增殖,抑制其凋亡,并增强AML12细胞ALB和A1AT的表达。关键词：Hepal-6细胞;外泌体;AML12细胞;细胞增殖；细胞调亡；细胞功能中图分类号：R735.7文献标识码：A文章编号：10 0 9-7 0 9 0(2 0 2 3)0 4-0 42 0-0 6Identification of hepatocellular carcinoma cell-derivedexosomesand its effect on hepatocytesCCHE Xiao-hong,lei(Departmn.t1942HospitalofZHANG Yong-mei(Department of Infectious Diseases,No.94zHospitalofLA,Yinchuan750001,Ningxia,China)Corresponding author:ZHANG Yong-mei.E-mail:.Abstract:Objective To identify exosomes(Hepal-6 Exos)derived from mouse hepatocellular carcinoma cell Hepal-6,andinvestigate the efficiency of Hepal-6 Exos in co-incubation with mouse normal liver cell AML12 and its effect on cell prolif-eration,apoptosis and cell function.Methods Hepal-6 Exos was extracted,the morphology and size distribution of exosomeswere identified by transmission electron microscopy(TEM)and nanoparticle analyzer.The cxosome-specific proteins were detected by Western blot,the uptake efficiency of exosomes by AML12 cells was analyzed in immunofluorescence.The CCK-8and transwell invasion assay were used to detect effect of exosomes on proliferation and apoptosis of AML12 cells.The effect ofexosomes on function of AML12 cells were analyzed by quantitative polymerase chain reaction(qPCR)and Western blot.Re-sults The Hepal-6 Exos showed saucer-shaped morphology with particle size of 50-200 nm and expressed specific proteinsCD9,CD63 and TSG101,and AML12 cells could efficiently uptake Hepal-6 Exos.Compared with normal AML12 cell controlgroup,Hepal-6 Exos could promote proliferation of AML12 cells,and cell proliferation rates at 24-hour,48-hour and 72-hour were(10.15 0.91)%,(16.61 1.56)%and(28.57 1.53)%(P0.05),respectively.Compared with normal AML12 cell control group,Hepa1-6 Exos inhibited apoptosis of AML12 cells,and apoptosis rates at 24-hour,48-hour and 72-hour were(2.81 0.17)%,(2.10 0.57)%and(1.96 0.85)%(P 0.05),respectively.The Hepal-6 Exos enhanced expression of albumin(ALB)and 1-antitrysin(A1AT)in AML12 cells.Conclusion It is demonstrated that Hepal-6 Exos could promote the proliferation of AML12cells and inhibit apoptosis,and enhance the expression of ALB and A1AT in AML12 cells.Key words:Hepa1-6 cells;exosomes;AML12 cells;cell proliferation;cell apoptosis;cell function肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一，占原发性肝癌的8 5%9 0%。乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染被认为是中国HCC发展的主要危险因素 1 3。HCC 的发展是一个复杂的多步骤过程，涉及持续的炎症损伤，包括肝细胞坏死和再生 4。尽管近年来在成像技术、肝移植、手术切除、射频消融（radiofrequencyablation，RFA）、经导管动脉化学栓塞治疗（transarterial chemoemboliza-作者单位：中国人民解放军联勤保障部队第九四二医院感染疾病科，宁夏银川7 50 0 0 1作者简介：车小红(19 8 4一），女，陕西宝鸡市人，本科，主治医师，主要从事肝癌基础与临床研究。电话：[phone]。E-mail:，。通信作者：张咏梅（19 8 3一），女，四川南充市人，本科，主治医师，主要从事诊治各类肝炎、肝硬化、肝癌及感染相关性疾病工作。电话：1346 9 58 0 6 8 4。E-mail:。版权保护，不得翻录。421BME&Clin Med,July 2023,Vol.27,No.4生物医学工程与临床2 0 2 3年7 月第2 7 卷第4期tion,TACE)和全身化学治疗等方面都取得了新的突破,但HCC 发病率高、预后差,晚期肝癌患者的治疗选择非常有限，预后率仍然很低，至今没有有效的治疗方法5。目前,HCC的5年生存率不超过2 0%，早期诊断可显著降低HCC患者的死亡率。因此,提高HCC的早期诊断率和探索HCC形成的具体机制是提高HCC总生存率的主要方法。外泌体（exosomes,Exos）是直径为50 10 0 nm细胞外囊泡，它们含有细胞分泌的许多活性成分，包括脂质、蛋白质、RNA和DNA。Ex o s 通过调节肿瘤细胞之间及肿瘤细胞与非肿瘤细胞之间的信号转导，间接影响肿瘤微环境，是肿瘤发生的重要工具8。细胞类型如间充质细胞、免疫细胞和肿瘤细胞可诱导Ex-os的释放，这表明Exos参与了肿瘤的发生、发展、转移、免疫逃逸和耐药 9 。此外,肿瘤来源的Exos含有大量与癌症相关的血清学标志物,如miRNAs,可用于早期HCC 的检测 10,1。多项研究表明外泌体与HCC的发生、发展密切相关,对Exos的深人研究，可能有助于解释肿瘤的形成和转移过程，为HCC 的早期诊断和治疗提供新的方法。笔者通过提取并鉴定小鼠肝癌细胞Hepal-6来源的Exos(Hepal-6 Exos),研究AML12细胞摄取Hepal-6Exos的效率,并探讨Hep-a1-6 Exos 对AML12细胞的影响。1材料与方法1.1实验材料Hepal-6细胞和AML12细胞（中国科学院细胞库）;溶酶体膜糖蛋白（CD63）、肿瘤易感基因10 1(tu-mor susceptibility gene 101,TSG101）、白蛋白（albu-min,ALB)和1-抗胰蛋白酶(1-antitrypsin,A1AT)抗体(Abcam公司，美国）。1.2方法1.2.1细胞培养小鼠肝癌细胞Hepa1-6和小鼠正常肝细胞AML12在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的达氏修正伊氏培养液(Dulbeccosmodified Eagles medium，DMEM）中培养。细胞每隔1d更换新鲜培养液,在37、体积分数5%CO2培养液中生长1.2.2外泌体提取Hepal-6细胞在无胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)培养液中培养2 4 36 h后，采用ExoquickTC试剂盒提取Exos。取上清液50 0 g离心10 min去除细胞，然后在10 0 0 0 g条件下离心2 0 min，清除残留的细胞碎片。所得上清液经0.4m过滤器过滤后，采用ExoquickrC试剂盒沉淀。所得样品在磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS）或DMEM中重悬，保存在-8 0 条件下。1.2.3外泌体鉴定采用电子显微镜分析Hepal-6Exos的形态。将纯化的Exos添加到网格中，用2%醋酸铀酰将Hep-al-6Exos染色，于电子显微镜（型号：TecnaiC2SpiritBioTwin)成像拍片。分析Hepal-6Exos的粒径分布，将提取的Hepal-6Exos均匀稀释到50 0 ng/mL(蛋白质质量浓度），采用Nanoplus分析仪（型号：ZetaVIEWS/N 17-310)检测 Hepa1-6 Exos 粒径1.2.4Western blot使用放射免疫沉淀试验（radioimmunoprecipita-tionassay,RIPA）裂解缓冲溶液在4条件下提取细胞或Hepal-6Exos中的总蛋白，用PierceBCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白质浓缩在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)(6%)上,用SDS-PAGE(12%)分离。将凝胶转移到硝化纤维素过滤膜上,进行印迹分析。用3%牛血清ALB阻断后,膜随后与一抗孵育。在Tris缓冲溶液加吐温-20(Tris-buffered saling and tween-20,TBST)中洗涤 3次后,与辣根过氧化物酶偶联二抗室温孵育1h。二喹啉甲酸（bicinchoninicacid,BCA）蛋白定量实验步骤制备BCA工作液，按A：B=50：1比例配置工作液，充分混匀；将蛋白质样品加入到各孔中，每孔分别加人BCA工作液；密封后，于37 静置30 min；室温，用酶标仪检测光密度（opticaldensity,OD）56 2 m值；制作标准曲线，计算蛋白样品浓度。1.2.5外泌体的体外荧光示踪将纯化的 Hepal-6 Exos（1 g/L）与1 mmol/L的Dil(细胞膜橙红色荧光探针)染料(50 0：1体积比）孵育30 min，用PBS洗涤后离心去除游离的荧光染料。为了在AML12细胞中体外示踪Hepal-6Exos,将AML12细胞与标记的Hepal-6Exos孵育3h,用PBS洗涤3次，再用4%多聚甲醛溶液固定10 h后，再用PBS洗涤2 次，10 min后再用PBS洗涤2 次。细胞核用Hoechst(1:1000)在37 反染10 min。实验结束时,用醋酸钠溶液清洗细胞（去除非特异性黏附）,并使用共聚焦显微镜观察拍片1.2.6细胞增殖毒性检测实验分成2 组：对照组（AML12细胞）和实验组（A M L12 细胞+Hepal-6Exos）。将2 组细胞接种至96孔板，每孔加人110 3个细胞,培养12 h后，对2422BME&Clin Med,July 2023,Vol.27,No.4生物医学工程与临床2 0 2 3年7 月第2 7 卷第4期组细胞进行处理。2 4h、48 h、7 2 h 后进行CCK-8检测,在450 nm波长测定OD12。O1.2.7细胞凋亡检测实验分组同1.2.6 所述，将2 组细胞接种至6 孔板，每孔加人2 10 5个细胞，培养12 h后，对2 组细胞进行处理。2 4h、48 h、7 2 h 后用流式细胞仪进行检测1.2.8聚合酶链式反应使用TRIzol试剂按制造商说明书指示从2 组细胞中提取总RNA。然后，利用PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒将RNA反转录为cDNA,用Prime-Script RTmaster mix分析mRNA水平上的相关基因表达。所有定量聚合酶链式反应（quantitative poly-merase chain reaction,qPCR)至少重复 3次。甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase,GAPDH)为内参。ALB上游引物序列为5-TGCTTTTTCCAGGGGTGTGTT-3，下游引物序列为5-TTACTTCCTGCACTAATTTGGCA-3；A1AT上游引物序列为5-AGGGTGGCTTCTAGC-CTCTTT-3，下游引物序列为5-CAGTCCGTGTG-TACTCTTCCC-3;GAPDH上游引物序列为5-AG-GTCGGTGTGAACGGATTTG-3，下游引物序列为5-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3。RNA定量：定量时适量稀释溶于焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)的RNA样品，紫外分光光度计选择RNA定量，检测样品，读取OD260mm及OD260mm/OD280mm比值。1.3统计学方法利用GraphPadPrism7.0进行统计学分析。数据用平均值标准差表示。两组间比较采用Student-dentst检验，多组间比较采用单因素方差分析。P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1外泌体鉴定2.1.1外泌体形态相关研究报道Exos为脂质双分子层结构。实验首先收集了Hepal-6Exos,通过透射电子显微镜分析其形态。结果显示Hepal-6Exos呈脂质双层茶托样结构，具有典型的Exos结构，结果符合Exos的形态特征(图1)。2.1.2外泌体特异性蛋白表达Ex0s表达特异性蛋白CD63、T SG 10 1和CD9等，而不表达高尔基体标志物GM130蛋白。Westernblot实验结果表明,Hepal-6细胞和Hepal-6Exos均表图1Hepal-6Exos的形态特征（标尺=10 0 nm）Fig.1 Image of morphological characteristics of Hepal-6 Exos(scale bar=100 nm)达CD9、C D 6 3和TSG101蛋白（图2），证明Hepal-6Exos表达标志性蛋白。ABTSG10150000CD6340 000CD930000GAPDH36000A:Hepal-6 细胞;B:Hepal-6 Exos图2 Hepal-6Exos特异性蛋白表达Fig.2Diagram of Hepal-6 Exos specific protein expression2.1.3外泌体粒径分析性对提取Hepal-6Exos并进行粒径分析,结果显示，Hepal-6Exos粒径主要分布在50 2 0 0 nm,且基本呈正态分布（图3）。符合Exos正常粒径大小分布范围。40%3020100200400大小/nm图3Hepal-6Exos粒径分析Fig.3Diagram of particle size analysis of Hepal-6 Exos423-生物医学工程与临床2 0 2 3年7 月第2 7 卷第4期BME&Clin Med,July 2023,Vol.27,No.42.2AML12细胞高效摄取Hepa1-6Exos免疫荧光显示，Hepa1-6Exos进人AML12后，主要定位于细胞质中，且被细胞高效摄取（图4）。说明Hepal-6Exos能与AML12细胞进行充分信息交流HoechstDilMerge图4AML12细胞摄取Hepal-6Exos情况（标尺=5m）Fig.4Images uptake of Hepal-6 Exos by AML12 cells(scale bar=5 m)2.3Hepa1-6Exos促进AML12细胞增殖及抑制其凋亡将Hepal-6Exos与AML12细胞共培养2 4h、48h、7 2 h,C C K-8 实验表明，与对照组相比，实验组细胞的增殖能力得到提高（表1)。说明Hepal-6Exos可促进AML12细胞增殖。流式细胞技术检测细胞凋亡，与对照组相比，实验组细胞凋亡率下降（表2)。上述结果表明Hepal-6Exos能抑制AML12细胞的凋亡，且其抑制作用较大。表1两组AML12细胞增殖率比较Tab.1 Comparison of proliferation rate of AML12 cells between 2groups细胞增殖率/%项目24 h48 h72h对照组8.36 0.7913.23 1.3723.69 1.68实验组10.15 0.9116.61 1.5628.57 1.53t5.066.138.75P0.050.050.05表2 两组AML12细胞凋亡率比较Tab.2Comparison of apoptosis rate of AML12 cells between 2groups细胞凋亡率/%项目24h48 h72 h对照组5.12 0.264.63 0.334.01 0.73实验组2.81 0.172.10 0.571.96 0.85t4.313.623.08P0.050.050.052.4Hepal-6Exos增强AML12细胞ALBmRNA和A1ATTmRNA的表达经Hepal-6Exos处理后,采用qPCR和Westernblot检测两组细胞中ALBmRNA、A 1A T m RNA 和其蛋白的表达情况。实验组ALBmRNA、A 1A T m RNA 相对表达量分别为4.46 0.50、6.8 9 1.0 1,对照组分别为1.0 0 0.2 1、1.0 0 0.35。与对照组相比，实验组ALBmRNA、A 1A T m RNA 表达水平明显升高，差异有统计学意义（t=3.96、5.2 7,P 0.0 5）。见图5。对照组实验组ALB69 000A1AT46 000GAPDH30000图5两组AML12细胞表达ALB、A 1A T 蛋白电泳图（Westernblot)Fig.5Electrophoretogram of AML12 cells expressed ALB andA1AT protein(Western blot)3讨论HCC是一种致命恶性肿瘤，具有较高的复发风险，其转移受微环境因素的影响较大，迄今肝癌早期诊断仍然缺乏合适的标志物 13。目前,肝移植、介人放射治疗和化学栓塞治疗仍是治疗不可切除肝癌的主要选择。Exos是具有脂质双层膜结构的细胞外小泡，1989年由JohnstoneRM在研究网织细胞时首次发现U4。Ex o s 是具有多种生物功能的纳米级颗粒，广泛分布于血液、唾液、牛奶、腹水、尿液等体液中，富含核酸、蛋白质、脂类和无机盐离子 15。Exos参与细胞之间或细胞与组织之间重要的信息和物质的交换。它们维持着人体细胞发育、生长、分化和衰老的关键生理过程，是人类生命所必需的7。越来越多的研究表明，424-BME&Clin Med,July 2023,Vol.27,No.4生物医学工程与临床2 0 2 3年7 月第2 7 卷第4期Exos 的分泌和功能异常在恶性肿瘤的发生、发展和治疗中起着至关重要的作用。肿瘤来源的Exos在侵袭转移过程的几乎所有步骤中都起着至关重要的作用。首先，肿瘤源性Exos提供自分泌和旁分泌信号，激活肿瘤上皮细胞中的上皮-间质转化（epithelialm e s e n c h y m a l t r a n s i t i o n，EMT),使肿瘤细胞具有侵袭周围组织的能力。其次，肿瘤Exos被吸收并沉淀到目标组织中，在转移细胞停止之前形成一个转移前小生境。最后,肿瘤Exos调节宿主免疫，使疾病无限制地发展，甚至通过激活炎症反应途径逃避免疫细胞,使其得到培养 16 17。近年来,肿瘤来源的Exos已被证实能促进癌症进展相关研究表明，通过Exos的RNA和蛋白质交换不仅在HCC的发生发展中具有关键作用，而且可能是潜在的实时、非侵人性生物标志物和治疗靶点的来源 18 。迄今为止,对肝脏Exos的研究有限,大多数研究来源于细胞学实验。既往研究表明,Exos作为肿瘤微环境中的载体，在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用，也是HCC 诊断和预后潜在有效的生物标志物 19,2 0 。肝癌Exos分泌的miRNA可诱导多种生物学功能，通过灭活致癌miRNA可能是肝癌靶向治疗的新方向。尽管Exos和HCC研究进展令人振奋，但仍有许多问题有待进一步阐明，如Exos在HCC转移的EMT途径中的作用,以及Exos在HCC与靶细胞之间的作用机制等仍有待进一步研究。笔者通过高速离心法提取Hepal-6Exos,保证了实验所需Exos的纯度。实验鉴定了Hepal-6Exos的生物特征,其呈脂质双层茶托样结构，表达特征性蛋白，粒径主要分布在50 2 0 0 nm。上述结果表明Hepal-6Exos具有Exos的特征,符合其特性。实验揭示AML12细胞能高效摄取Hepal-6Exos，表明提取的Hepal-6Exos能与AML12细胞进行充分信息交流。在此基础上,将Hepal-6 Exos与AML12细胞共培养，发现Hepal-6Exos能促进AML12细胞增殖，并抑制其调亡；同时Hepal-6Exos增强了AML12细胞中ALB和A1AT的表达。Exos作为一种纳米级囊泡，具备克服各种生物屏障的能力。它通过细胞膜融合、胞饮和内吞等方式进人细胞后，将自身携带的配体或受体、蛋白质或核酸，或作为药物递送载体对细胞发挥作用，影响细胞生长、分裂和迁移等生物学行为,从而改变受体细胞的生理和代谢功能。Exos通过膜融合将来源细胞的基因突变信息递送至受体细胞，从而导致原癌基因的激活和抗凋亡基因的表达,使肿瘤细胞获得增殖特性。在伤口愈合后期,Exos可抑制胶原蛋白表达，减少瘢痕形成。研究发现,Exos介导核酸、蛋白质和脂类等生物活性物质的递送参与肝癌的生长、转移和血管生成。综上所述,笔者鉴定了肝癌细胞来源的Exos,并分析了其对正常肝细胞的影响，结果表明Hepal-6Exos可能与肝癌的发生发展相关。因此Exos有望成为肝癌诊断标志物,为肝癌早期诊断和治疗提供了新思路。同时，笔者研究尚存在不足,肝癌细胞的Exos对正常肝细胞促增殖和抑制调亡的机制还有待进一步研究，仍需体内实验阐明此作用机制，从而为肝癌的临床诊治提供新的策略。参考文献：1 Li X,Li C,Zhang L,et al.The significance of exosomes in thedevelopment and treatment of hepatocellular carcinomaJ.MolCancer,2020,19(1):1-1.2 Wang H,Lu Z,Zhao X.Tumorigenesis,diagnosis,and thera-peutic potential of exosomes in liver cancerJ.J Hematol Oncol,2019,12(1):133-133.3 JJiang Y,Han Q,Zhao H,et al.The mechanisms of HBV-in-duced hepatocellular carcinomaJ.J Hepatocell Carcinoma,2021,8:435-450.4 J Villanueva A.Hepatocellular carcinomaJ.N Engl J Med,2019,380(15):1450-1462.5 Sasaki R,Kanda T,Yokosuka O,et al.Exosomes and hepato-cellular carcinoma:From bench to bedsideJ.Int J Mol Sci,2019,20(6):1406-1406.6 von Felden J,Garcia-Lezana T,Schulze K,et al.Liquid biop-sy in the clinical management of hepatocellular carcinomaJ.Gut,2020,69(11):2025-2034.7 JGurung S,Perocheau D,Touramanidou L,et al.The exosomejourney:From biogenesis to uptake and intracellular signallingJ.Cell Commun Signal,2021,19(1):47-47.8 Kalluri R,LeBleu VS.The biology,function,and biomedicalapplications of exosomesJ.Science,2020,367(6478):eaau6977-eaau6977.9 Xu Z,Zeng S,Gong Z,et al.Exosome-based immunotherapy:A promising approach for cancer treatmentJ.Mol Cancer,2020,19(1):160160.10 Wu Q,Zhou L,Lv D,et al.Exosome-mediated communicationin the tumor microenvironment contributes to hepatocellularcarcinoma development and progressionJ.J Hematol Oncol,2019,12(1):53-53.11 Chen W,Mao Y,Liu C,et al.Exosome in hepatocellular carci-noma:An updateJJ.J Cancer,2021,12(9):2526-2536.12沈彩红,孙林,黄文杰，等.肝癌细胞来源的外泌体对正常肝细胞的影响研究 J.湖南师范大学学报（医学版）,2 0 2 2,19(1):4-7.信息动态425.BME&Clin Med,July 2023,Vol.27,No.4生物医学工程与临床2 0 2 3年7 月第2 7 卷第4期SHEN Cai-hong,SUN Lin,HUANG Wen-jie,et al.Effect ofhepatocellular carcinoma cells derived exosomes on the prolif-eration,migration and invasion of normal liver cellsJ.Journalof Hunan Normal University(Medical Science),2022,19(1):4-7.13 Sim HW,Knox J.Hepatocellular carcinoma in the era of im-munotherapyJ.Curr Probl Cancer,2018,42(1):40-48.14 He C,Zheng S,Luo Y,et al.Exosome theranostics:Biologyand translational medicineJ.Theranostics,2018,8(1):237-255.15 Wortzel I,Dror S,Kenific CM,et al.Exosome-mediatedmetastasis:Communication from a distanceJJ.Dev Cell,2019,49(3):347-360.16 Ge Y,Mu W,Ba Q,et al.Hepatocellular carcinoma-derivedexosomes in organotropic metastasis,recurrence and early di-agnosis applicationJ.Cancer Lett,2020,477:41-48.17 Li R,Wang Y,Zhang X,et al.Exosome-mediated secretion ofLOXL4 promotes hepatocellular carcinoma cell invasion andmetastasisJJ.Mol Cancer,2019,18(1):18-18.18 Mashouri L,Yousefi H,Aref AR,et al.Exosomes:composition,biogenesis,and mechanisms in cancer metastasis and drug re-sistanceJ.Mol Cancer,2019,18(1):75-75.19 Yu W,Hurley J,Roberts D,et al.Exosome-based liquid biop-sies in cancer:Opportunities and challengesJ.Ann Oncol,2021,32(4):466-477.20 Zhao L,Shi J,Chang L,et al.Serum-derived exosomal pro-teins as potential candidate biomarkers for hepatocellular car-cinomaJ.ACS Omega,2021,6(1):827-835.（收稿日期：2 0 2 3-0 3-0 6；修回日期：2 0 2 3-0 4-0 4）肠道微生物改变的饮食模式刺激机体免疫细胞发育的分子机制据SongX2023年6 月2 8 日（Nature，2 0 2 3Ju n 2 8.d o i:10.10 38/s 4158 6-0 2 3-0 6 2 6 5-4.）报道，中美研究人员发现，食物与健康之间存在一个关键中介，即组成机体微生物组的肠道菌群或与人类共生的微生物群落。揭示了细菌脂肪酸代谢通路通过调节CD4+T细胞和CD4+CD8+细胞之间的相对数量在控制宿主机体上皮内免疫平衡方面所扮演的关键角色和作用。研究人员在小鼠机体中进行的研究表明，肠道菌群能以诸如亚油酸等常见脂肪酸为食，并将其转化为共轭亚油酸（CLA）；随后这种副产物能作为一种生物级联信号，最终刺激特定类型的免疫系统发育并驻留在小肠组织中。在该项研究中，研究人员详细揭示了肠道微生物、食物和机体免疫力之间的错综复杂的相互作用，同时还强调了理解肠道中单一的微生物如何改变特定器官的功能并对健康产生重要影响的重要性。饮食-微生物-免疫系统能引起研究人员的极大关注，但却缺乏细节来阐明这3种组分是如何在一起协同工作并发挥作用的。最初研究人员注意到，无菌小鼠缺少一种称之为CD4+CD8+上皮内淋巴细胞（IELs），后者是一种通常能在小肠特定部位定植的细胞类型。有意思的是，那些无菌而摄人仅由维持生命的必要营养物质所组成的最低限度饮食的小鼠也缺乏这些细胞，然而，CD4+CD8+IELs存在于被喂食由许多不同营养物质所组成的典型丰富的商业化饮食的无菌小鼠体内。研究人员怀疑，饮食和微生物组之间的相互作用或许会导致CD4+CD8+IELs细胞的存在或缺失，因此他们分析了这种最低限度的饮食中缺少哪种营养物质，最终锁定了多种脂肪酸；当给携带典型微生物组的最低限度小鼠喂食单一的脂肪酸后，研究人员发现，摄人一种称之为亚油酸的长链脂肪酸的小鼠会开始在其小肠中定植CD4+CD8+IELs细胞。定植在肠道中的很多细菌都会产生名为亚油酸异构酶(LAI)的酶类,其能将亚油酸转化为一种共轭形式,其中一些亚油酸的双键和单键会被重新排列；而进一步研究显示，CLA在被喂食最低限度饮食携带典型微生物组的小鼠或被喂食丰富饮食的小鼠机体中的水平都较低，这或许就表明，这种细菌是将亚油酸转化为CLA的必要条件。当研究人员将产生LAI的细菌定植到无菌小鼠体内并给予其喂食丰富食物后，这些动物就会在其小肠组织中定植CD4+CD8+IELs细胞；相反，当研究人员给予其肠道中定植通过遗传修饰无法产生LAI的细菌时，这些小鼠体内并不会发育出CD4+CD8+IELs细胞，这就表明，这些细菌酶类所产生的CLA对于这些免疫细胞的生长至关重要。进一步研究表明，CLA刺激CD4+CD8+IELs细胞发育背后或许存在一种更完整的机制，研究人员发现，小肠中的一些免疫细胞能在其表面产生一种名为肝细胞核因子4(HNF4G)的蛋白,其是CLA的受体分子。当CLA吸附到这些受体上时,细胞就会产生名为白细胞介素18 R(IL-18R)的不同蛋白,这反过来就会降低名为ThPOK的第三种蛋白质的产生，而ThPOK产生的越少，发展的CD4+CD8+IELs细胞就越多。这一复杂的通路对于机体抵御感染的免疫力有着非常明显的影响；实际上，当研究人员干扰这种级联反应的任何部分时（比如阻断IL-18R或HNF4G的产生），机体中级联反应被关闭的小鼠就不会产生CD4+CD8+IELs细胞，也无法抵御鼠伤寒沙门氏菌（一种常会引起食物中毒的细菌种类）引起的感染研究人员表示，饮食-微生物-免疫系统三者之间的更多例子目前尚未出现的原因之