甘孜梨果仙人掌果酵素粉的制备条件及抗氧化活性研究.pdf

1742023年第9期中国食品添加剂China Food Additives开发应用收稿日期：2022-12-26 基金项目：四川省科技创新苗子工程（2020054）；成都中医药大学“杏林人才提升计划”（MPRC2022026）。作者简介：蒋丽施（1986-），女，博士，讲师，研究方向：特色资源开发利用与食品安全。E-mail：。*通信作者：孟晓（1983-），女，博士，副教授，研究方向：天然活性成分的开发与利用。E-mail：。甘孜梨果仙人掌果酵素粉的制备条件及 抗氧化活性研究蒋丽施，万千帆，王朝宇，牛泽凤，曹洁，孟晓*（成都中医药大学公共卫生学院，成都 611137）摘 要：以甘孜梨果仙人掌果为原料，以超氧化物歧化酶（SOD）活性为评价指标，探究梨果仙人掌果酵素粉的最优发酵和喷雾干燥条件，并分析其抗氧化活性。结果表明：发酵温度 34、发酵时间 4 d、混合菌种的接种量 5%、糖的添加量 25%为最佳发酵条件，此时的超氧化物歧化酶（SOD）活性为 148.24 U/mL。添加20%的麦芽糊精、控制进风温度 165 的喷雾干燥条件，可得组织状态均匀、具有独特的梨果仙人掌果风味的酵素粉。酵素粉 DPPH 自由基清除率为 40.59%，羟自由基清除率为 26.23%，铁离子还原力为 0.1799，抗氧化活性显著高于发酵前的梨果仙人掌果汁原液。关键词：梨果仙人掌果；发酵；工艺优化；固体饮料中图分类号：TS202.3 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2023）09-0174-06doi：10.19804/j.issn1006-2513.2023.09.024Optimization of preparation of Opuntia ficus-indica(L.)Mill fruit enzyme powder and its antioxidant activity JIANG Lishi，WAN Qianfan，WANG Chaoyu，NIU Zefeng，CAO Jie，MENG Xiao*（School of Public Health，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137）Abstract：Using Opuntia ficus-indica(L.)Mill fruit produced in Ganzi as raw material and superoxide dismutase（SOD）activity as evaluation index，the optimal fermentation and spray drying conditions of Opuntia ficus-indica(L.)Mill fruits fruit enzyme powder were investigated，and its antioxidant activity was analyzed.The optimal fermentation conditions were selected as follows：fermentation temperature 34，fermentation time 4 d，inoculation amount of mixed strains 5%，and 25%sugar.Under the above conditions，the superoxide dismutase（SOD）activity was 148.24 U/mL.By adding 20%maltodextrin and spray drying at 165，the enzyme powder of Opuntia ficus-indica(L.)Mill fruit with uniform microstructure and unique cactus flavor was obtained.The enzyme powders scavenging rate of DPPH radical was 40.59%，its scavenging rate of hydroxyl radical was 26.23%，and its reducing power of iron ion was 0.1799.The antioxidant activity of the enzyme powder was significantly higher than that of the Opuntia ficus-indica(L.)Mill fruit juice before fermentation.Key words：Opuntia ficus-indica(L.)Mill fruit；fermentation；process optimization；solid beverage1752023年第9期中国食品添加剂China Food Additives开发应用仙人掌果为仙人掌属（Opuntia）植物的果 实1，主要分布于四川、云南、广西、海南等地。根据其口感与色泽分为金紫仙人掌果、酸仙人掌果和白仙人掌果 3 种类型2，其中白仙人掌果是四川甘孜州的特色经济作物，俗名仙桃，是梨果仙人掌Opuntia ficus-indica(L.)Mill的果实3。其果皮为绿色，果肉呈白色到淡绿色，富含水分，籽多而味甘甜。仙人掌果具有抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血脂、调节肠道菌群、以及调节免疫4-12等多种保健功能。目前，梨果仙人掌果以野生鲜销为主，难贮存运输，限制了其产业化发展。酵素是以果蔬为原料，经过酵母、乳酸菌等发酵，是一种富含矿物质、维生素、酶等特定生物活性成分的产品，能够有效促进新陈代谢，具有预防衰老、解毒消炎13、抗菌及抗氧化14-15、抗癌等功能。目前国内对仙人掌果的研究主要集中在海南的金紫仙人掌果上，而对梨果仙人掌果的研究较少。课题以四川甘孜特色梨果仙人掌果为原料，采用酵母菌和乳酸菌复合发酵，研制出一种具有高抗氧化活性的酵素粉，不仅保持了梨果仙人掌果自身的营养功能成分，还提高了原料的利用率，为甘孜梨果仙人掌果的综合利用提供参考。1 材料与方法1.1 材料与试剂梨果仙人掌果：市售；酵母菌（安琪高活性干酵母）：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌：北京川秀国际贸易有限公司；麦芽糊精：河南腾达食品配料有限公司；焦性没食子酸、乙二胺四乙酸二钠：成都市科隆化学品有限公司；三羟甲基氨基甲烷：北京索莱宝科技有限公司。1.2 仪器与设备UV-5100 紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司；YM-75 立式压力蒸汽灭菌器：上海三申医疗器械有限公司；SHZF-5263 恒温振荡培养箱：成都瑞昌仪器制造有限公司；SPX-400-II 生化培养箱：上海跃进医疗器械有限公司；VD-650-U 洁净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；XO-8000 实验室小型喷雾干燥机：南京先欧仪器制造有限公司。1.3 方法1.3.1 工艺流程及操作要点菌种活化 制备混合菌种 接种发酵原料挑选 预处理 榨汁 浸提 过滤 梨果仙人掌果汁装袋 喷雾干燥 离心 梨果仙人掌果发酵原液（1）浸提：新鲜梨果仙人掌果去皮，取其果肉，放入榨汁机，按料液比 110（w/v）的比例加入无菌水榨成汁。于 70 恒温水浴锅中水浴浸提 60 min，用无菌纱布过滤去渣，获得水提液，将水提液分装 105 mL 至发酵装置中，加入白砂糖搅拌至溶解。（2）菌种活化：将酵母菌菌粉用蒸馏水混匀，30 水浴活化 1 h，无菌条件下取适量菌液均匀涂于 YPD 固体培养基上，于 30 恒温培养箱中培养 48 h。重复上述步骤，继代培养 2 次后可用于发酵。将乳酸菌菌粉用蒸馏水混匀，34 水浴活化1 h，无菌条件下取适量菌液均匀涂布于 MRS 培养基上，于 34 恒温培养箱中培养 24 h。重复上述步骤，继代培养 2 次后可用于发酵。将酵母菌和乳酸菌以 23 的体积比进行混合制备成混合菌种。（3）接种发酵：将混合菌种按照一定的接种量加入到发酵罐中，于恒温振荡培养箱中密闭发酵（120 r/min），得梨果仙人掌果酵素发酵液。1.3.2 发酵工艺和喷雾干燥条件优化试验（1）发酵条件优化单因素试验：以发酵温度34、发酵时间 5 d、混合菌种接种量 4%、糖的添加量 25%为基础条件，通过单因素试验分别考察发酵温度（26、30、34、38、42）、发酵时间（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 d）、混 合菌种接种量（1%、2%、3%、4%、5%）以及糖的添加量（20%、25%、30%、35%、40%）对梨果仙人掌果酵素发酵液中 SOD 活性的影响。（2）发酵工艺优化正交试验：在单因素试验结果的基础上，以 SOD 活性为评价指标，采用 4因素 3 水平的正交试验优化发酵工艺，其正交因素水平设计如表 1 所示。1762023年第9期中国食品添加剂China Food Additives开发应用表 1 正交因素水平设计Table 1 Factors and levels of orthogonal design水平糖的添加量/%混合菌种的接种量/%发酵时间/d发酵温度/120343022545343305638（3）喷雾干燥条件单因素试验在最优发酵工艺下，考察麦芽糊精的添加量（10%、15%、20%、25%、30%）和进风温度（155、165、175、185、195）对喷雾干燥后仙人掌果酵素粉出粉率的影响，结合感官状态确定最佳喷雾干燥工艺条件。1.3.3 测定方法（1）超氧化物歧化酶（SOD）活性16按照 GB/T 5009.171-2003保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定中的第一法修改的 Marklund 方法测定。（2）出粉率固体粉末的质量 m1与添加麦芽糊精的质量m2的比值即为出粉率。出粉率=100%m1m2 （1）式中：m1为固体粉末的质量，g；m2为添加麦芽糊精的质量，g。（3）DPPH 自由基清除率的测定参照张桂芳等17的方法稍作修改。分别向2 mL 不 同 浓 度 梯 度（2、4、6、8、10、12 mg/mL）的样品溶液中加入 2 mL 0.1 mmol/L 的 DPPH溶液，避光反应 20 min 后在 517 nm 处测吸光度（以无水乙醇调零），记为 A1；以 2 mL 无水乙醇代替 DPPH 溶液作为对照组，重复上述操作，测得吸光度 A2；以 2 mL 无水乙醇代替样品溶液作为空白组，重复上述操作，测得吸光度 A0。DPPH 自由基清除率=100%A0-（A1-A2）A0（2）式中：A0为空白组的吸光度值；A1为样品组的吸光度值；A2为对照组的吸光度值。（3）羟自由基（OH）清除率的测定 参照吴诗玄18的方法。（5）铁离子还原力的测定参照邱高翔19的方法稍作修改。分别向 1 mL 不同浓度梯度（2、4、6、8、10、12 mg/mL）的样品溶液中加入 2.5 mL 磷酸缓冲溶液（0.2 M，pH 6.6），再加入 2.5 mL1%的铁氰化钾溶液，于50水浴 20 min 后快速冷却，加入 2.5 mL 三氯乙酸，以 5000 r/min 离心 5 min 后，取上清液 2.5 mL，加入 2.5 mL 蒸馏水，最后加入 0.5 mL 0.1%的三氯化铁终止反应，静置 10 min 后在 700 nm处测吸光度（以蒸馏水调零），记为 A1；以蒸馏水代替样品溶液，重复上述操作，测得吸光度 A2。还原力=A1-A2 （3）式中：A1为样品组的吸光度值；A2为对照组的吸光度值。1.3.4 数据处理通过 SPSS 25.0 对单因素试验和正交试验结果进行方差分析，通过 EXCEL 2019 进行了试验数据的记录、计算和分析以及相关图表的绘制。2 结果与分析2.1 发酵条件优化单因素试验2.1.1 糖的添加量对梨果仙人掌果发酵液 SOD活性的影响由图 1 可知，随着糖的添加量的增加，梨果仙人掌果发酵液中 SOD 活性先升高再降低，其原因可能是发酵液中糖含量过多形成高渗状态，微生物的活力和生长速率被抑制，不利于发酵20-21。在糖的添加量为 25%时，SOD 活性最高，可得梨果仙人掌果发酵液的最佳糖的添加量为 25%。dabbccd94 99 104 109 114 20%25%30%35%40%SOD酶活性/(U/mL)糖的添加量/%图 1 糖的添加量对梨果仙人掌果发酵液 SOD 活性的影响Figure 1 Effect of sugar addition on SOD activity of Opuntia ficus-indica(L.)Mill fruits fermentation broth注：图中不同字母表示各数据间存在显著性差异（P0.05），下同。1772023年第9期中国食品添加剂China Food Additives开发应用2.1.2 混合菌种接种量对梨果仙人掌果发酵液SOD 活性的影响由图 2 结果分析可知，随着混合菌种接种量的增加，梨果仙人掌果发酵液中的 SOD 活性先逐渐升高至最大值再降低，在混合菌种接种量为4%时，SOD 活性达到最高值为 105.00 U/mL。综上可得梨果仙人掌果发酵液的最佳混合菌种接种量为 4%。ccbad96100981021041061%2%3%4%5%SOD酶活性/(U/mL)混合菌种接种量/%图 2 混合菌种接种量对梨果仙人掌果发酵液 SOD 活性的影响Figure 2 Effect of mixed strain inoculum on SOD activity of Opuntia ficus-indica(L.)Mill fruits fermentation broth2.1.3 发酵时间对梨果仙人掌果发酵液 SOD 活性的影响由图 3 结果分析可知，随着发酵时间的延长，梨果仙人掌果发酵液中 SOD 活性先升高后降低，在第 5 d 达到最高值为 115.00 U/mL。综上，梨果仙人掌果发酵液的最佳发酵时间为 5 d。ccba209080100110504030607012013579246810SOD酶活性/(U/mL)发酵时间/dbefgh图 3 发酵时间对梨果仙人掌果发酵液 SOD 活性的影响Figure 3 Effect of fermentation time on SOD activity of Opuntia ficus-indica(L.)Mill fruits fermentation brothy2.1.4 发酵温度对梨果仙人掌果发酵液 SOD 活性的影响由图 4，随发酵温度的提高，梨果仙人掌果发酵液中 SOD 活性升高，其原因可能是发酵温度越来越接近菌种生长的最佳温度，利于酶促反应和微生物代谢发育；在发酵温度为 34 时，SOD 酶活性达到最高值为 120.84 U/mL；然后SOD 活性降低，可能是由于温度过高影响菌体生 长22-24。综上可得梨果仙人掌果发酵液的最佳发酵温度为 34。bbabc1101161141121181201222630343842SOD酶活性/(U/mL)发酵温度/图 4 发酵温度对梨果仙人掌果发酵液 SOD 活性的影响Figure 4 Effect of fermentation temperature on SOD activity of Opuntia ficus-indica(L.)Mill fruits fermentation broth2.2 发酵工艺优化的正交试验表 2 正交试验结果分析表Table 2 Orthogonal test results试验号A 糖的添加量/%B 混合菌种接种量/%C 发酵时间/dD 发酵温度/SOD 活性/（U/mL）11111116.4721222124.4131333129.7142123116.4752231113.8262312148.2473132137.6583213124.4193321111.18K1370.59370.59389.12341.47K2378.53362.64352.06410.30K3373.24389.13381.18370.59K1123.53123.53129.71113.82K2126.18.120.88117.35136.77K3124.41129.71127.06123.53R7.9426.4937.0668.83主次因素D C B A最优水平A2B3C1D21782023年第9期中国食品添加剂China Food Additives开发应用表 3 正交试验的方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test主体间效应检验因变量：SOD 活性源III 类平方和自由度均方F显著性修正模型2366.671a8295.83413312524.375.000截距279931.5491279931.54912596919696.0.000糖的料液比21.789210.894490251.000.000混合菌种接种量246.0152123.0075535327.000.000发酵时间507.4112253.70611416749.750.000发酵温度1591.4562795.72835807769.750.000误差.00092.222E-5总计282298.22018修正后总计2366.67117a.R2=1.000（调整后 R2=1.000）由表 2 正交试验结果可知，影响梨果仙人掌果发酵液中 SOD 活性的主次因素为：D（发酵温度）C（发酵时间）B（混合菌种的接种量）A（糖的添加量）。最优的发酵工艺条件为 A2B3C1D2：即糖的添加量 25%，混合菌种的接种量 5%，发酵时间 4 天，发酵温度 34，在此工艺条件下得到梨果仙人掌果发酵液中 SOD 活性为 148.24 U/mL。根据表 3 正交试验的方差分析得知，糖的添加量、混合菌种接种量、发酵时间和发酵温度四个因素对梨果仙人掌果发酵液中 SOD 活性均有显著影响。2.3 喷雾干燥条件单因素试验2.3.1 麦芽糊精的添加量对梨果仙人掌果酵素粉出粉率的影响由图 5，当麦芽糊精的添加量从 10%增加到 20%时，梨果仙人掌果酵素粉出粉率也随之增加。麦芽糊精的添加量为 20%时，出粉率为72.38%。随麦芽糊精浓度的增加，物料中的细小颗粒易于粘在干燥器的壁上，喷雾干燥过程中水分蒸发时的耗能更多，使得进风温度降低，梨果仙人掌果酵素粉出粉率降低。因此，确定麦芽糊精的添加量为 20%。2.3.2 进风温度对梨果仙人掌果酵素粉出粉率的影响由图 6，随进风温度的增加，梨果仙人掌果酵素粉的出粉率先升高而后缓慢下降。当进风温度增加到 165 时，梨果仙人掌果酵素粉的出粉率达到最高为 69.21%。进风温度较低，物料在喷雾干燥的过程中被喷成小液滴时在干燥室中不能够被完全干燥，因而出粉率较低；而当进风温度较高时，物料中所含有的糖类和酸类物质会发生焦糖化反应，导致物料黏壁，出粉率下降，焦糊味过重。因此，确定最佳的进风温度为 165。dcabd0.0040.0020.0030.0010.0050.0060.0070.0080.001015202530出粉率/%麦芽糊精的添加量/%图 5 麦芽糊精的添加量对梨果仙人掌果酵素粉出粉率的影响Figure 5 Effect of addition amount of maltodextrin on yield of Opuntia ficus-indica(L.)Mill fruits enzyme powderbaababab30.0050.0040.0045.0035.0055.0060.0065.0070.0075.00155165175185195出粉率/%进风温度/图 6 进风温度对梨果仙人掌果酵素粉出粉率的影响Figure 6 Effect of air inlet temperature on yield of Opuntia ficus-indica(L.)Mill fruits enzyme powder1792023年第9期中国食品添加剂China Food Additives开发应用2.4 抗氧化活性测定按照 1.3.3 中的测定方法，取相应体积的梨果仙人掌果果汁原液、发酵液、喷雾干燥后的酵素粉分别测定 DPPH 自由基清除率、羟自由基清除率、铁原子还原力。由表 4 可知，与果汁原液相比，发酵后的梨果仙人掌果不同加工制品的 DPPH、羟自由基清除率、铁离子还原力明显增高。喷雾干燥后制品的 DPPH 自由基清除率、铁离子还原力有所降低，羟自由基清除率变化不大。表 4 梨果仙人掌果不同加工制品的抗氧化活性Table 4 Antioxidant activities of different prepared products of Opuntia ficus-indica(L.)Mill fruits样品抗氧化指标DPPH 自由基清除率/%羟自由基清除率/%铁离子还原力果汁原液23.7816.920.0582发酵后40.5926.230.1799喷雾干燥后22.2526.240.13443 结论以 SOD 活性为考察指标，通过单因素和正交试验，优化梨果仙人掌果酵素发酵参数，确定最佳发酵条件为：温度为 34、时间为 4 d、混合菌种的接种量为 5%、糖的添加量为 25%，此时 SOD 活性为 148.24 U/mL。与一些水果酵素例如草莓25相比，虽然发酵时间要多 3 d，但梨果仙人掌果的 SOD 值有明显的优势，该法在时间和成本上都有所节约，且保证了 SOD 活性。发酵后的 DPPH 自由基清除率为 40.59%，羟自由基清除率为 26.23%，铁离子还原力为 0.1799，抗氧化性显著高于发酵前。将梨果仙人掌果酵素原液通过优化的喷雾干燥工艺制备成酵素粉，其抗氧化活性有一定降低，但仍高于梨果仙人掌果原液。梨果仙人掌果酵素的研究与开发，可为四川甘孜地区特色经济作物的综合利用提供理论依据。参考文献：1吉雪慧，张筠，刘术明，等.响应面法优化仙人掌果花色苷的提取工艺 J.食品研究与开发，2018，39（18）：77-82.2胡继红，李俊儒.仙人掌果成分研究进展概述 J.现代食品，2018（14）：3-5，24.3周敏，温翠娟，明瑶，等.梨果仙人掌果多酚分布及生物活性 J.卫生研究，2022，51（3）：463-469.4张筠，邵帅，吉雪慧，等.仙人掌果花色苷纯化工艺的研究 J.中国食品添加剂，2022，33（4）：103-110.5贾金滏，马超，张明，等.仙人掌果多酚的提取及抗氧化活性研究 J.中国果菜，2020，40（3）：65-70.6Smida A，Ncibi S，Taleb J，et al.Immunoprotective activity and antioxidant properties of cactus（Opuntia ficus indica）extract against chlorpyrifos toxicity in rats J.Biomedicine&Pharmacotherapy，2017，88：844-851.7梁蓓蓓，刘华钢，曹俊涛.仙人掌果多糖对 S180荷瘤小鼠抑瘤作用的实验研究 J.癌症，2008，27（6）：580-584.8Kunyanga C N，Imungi K J，Vellingiri V.Nutritional quality，phytochemical composition and health protective effects of an under-utilized prickly cactus fruit（Opuntia stricta haw.）collected from Kenya J.African Journal of Food，Agriculture，Nutrition and Development，2014，14（67）：9561-9577.9罗棵濒，吕晓华.甘孜梨果仙人掌果的多酚含量及活性初步研究 C/营养研究与临床实践第十四届全国营养科学大会暨第十一届亚太临床营养大会、第二届全球华人营养科学家大会论文摘要汇编.中国营养学会，亚太临床营养学会，江苏省科学技术协会，中国疾病预防控制中心营养与健康所，农业农村部食物与营养发展研究所.2019：403-404.DOI:10.26914/kihy.2019.010635.10邵帅，赵晶，张岚，等.基于体外发酵研究仙人掌果实花色苷对肠道菌群及代谢物 SCFAs 的影响 J.食品工业科技，2022，43（24）：377-385.11刘华钢，曹俊涛，梁秋云，等.仙人掌果对高脂血症大鼠血脂及脂质过氧化的影响 J.第四军医大学学报，2009，30（21）：2335-2338.12张松莲.仙人掌多糖免疫调节作用的研究 D.长沙：湖南农业大学，2007.13邵洋洋，郜海燕，刘瑞玲，等.双孢菇菇柄酵素发酵条件优化及其抗氧化活性分析 J.食品工业科技，2022，43（11）：244-251.14刘维兵，王舸楠，王犁烨，等.葡萄海棠果酵素发酵工艺优化及体外抑菌与抗氧化活性的研究 J.食品工业科技，2019，40（16）：118-125.15郭伟峰，王红梅，邹晓桐，等.桑葚酵素饮料的发酵工艺研究及其质量评价 J.食品研究与开发，2019，40（5）：88-93.16中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定：GB/T 5009.1712003 S.北京：中国标准出版社，2004.17张桂芳，张东杰，鹿保鑫，等.不同萌发时间黑豆芽总黄酮含量及 DPPH 自由基清除能力的测定 J.食品科技，2020，45（12）：39-45.18吴诗玄.龙眼中多酚的提取、分离纯化、结构鉴定及体外抗氧化活性测定 D.广州：暨南大学，2018.19邱高翔.杜仲雄花提取物抗氧化和抗菌活性评价 D.杨凌：西北农林科技大学，2013.20张百刚，苑贤伟，蔡聪慧，等.菠萝胡柚复合乳酸发酵饮料的研制 J.食品工业科技，2013，34（9）：254-257，268.21张海燕，康三江，袁晶，等.苹果酵素自然发酵工艺优化及品质分析 J.中国酿造，2020，39（10）：145-151.22董明盛，贾英民.食品微生物学 M.北京：中国轻工业出版社，2006.23王乃馨，李超，苗敬芝，等.牛蒡复合果蔬酵素发酵工艺优化及品质变化跟踪 J.中国酿造，2022，41（4）：204-208.24吕明珊，袁艺洋，邢军，等.双响应值联合优化药桑葚酵素发酵工艺及其抗氧化性的研究 J.中国调味品，2022，47（2）：97-103.25崔国庭，王缎，刘向丽，等.响应面法优化草莓酵素的发酵工艺及其生物活性初探 J.食品工业科技，2018，39（9）：143-148.