生物技术制药-第二章-基因工程制药.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第二章,基因工程制药,用途：,主要用于癌症、人类免疫缺陷病毒性疾病、心血管疾病、糖尿病、贫血和许多遗传疾病的治疗。,获取方式：,生化提取 基因工程表达,成本高产量低,质量难以保证,成本低产量高,活性强性质优,实例：,人生长激素（侏儒症）,50,具新鲜尸体,脑下垂体中提取,采用基因工程从,12,升细菌培养液中提取获得,=,1982,年世界上第一个基因工程药物,重组人胰岛素获准生产销售，至今已有,100,多个生物技术药物上市,;,促红细胞生成素（,EPO,）以全球销售额,38,亿美元的业绩，居全球最畅销,10,种药物的第,6,名；,1989,年我国第一个拥有自主知识产权的基因工程药物,-,重组人干扰素（,IFN,1b,）上市以来，目前，世界上销售额排前,10,位的生物技术药物我国已能生产,8,种。,国际生物医药产业发展动态,第一节 概 述,生物技术的核心就是基因工程，20世纪70年代基因工程诞生,最先应用在医药科学领域。,传统生物药物由于来源及制备上的困难、价格等因素的影响，此外在制备过程可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等问题,（如：生长激素抑制素 1 mg 传统法：10万只羊的下丘脑，现：10 L大肠杆菌培养液，0.3美元/mg；尿激酶从男性尿中提取；胎盘丙种球蛋白从胎盘中提取。,应用基因工程技术可十分方便且有效地解决传统生物制药所遇到的问题,如今，癌症、病毒性疾病、心血管疾病以及内分泌等方面的预防、治疗和诊断药物已可通过基因工程技术获得。,第二节 基因工程药物生产的过程,基因工程技术,是将所要重组对象的,目的基因,插入载体、拼接，转入新的,宿主细胞,，构建成工程菌(或细胞），实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌(或细胞）内进行复制和表达的技术。,基因工程药物生产的上游和下游,上游阶段：,目的基因分离、工程菌（或细胞）构建。上游阶段的工作主要在实验室内完成；,下游阶段：,主要指的是从工程菌（或细胞）的大规模培养一直到产品的分离纯化、质量控制,获得目的基因,组建重组质粒,培养工程菌,构建基因工程,菌或细胞,产物分离纯化,除菌过滤,半成品检定,包装,成品检定,基因工程药物制备的一般过程,基因工程基本过程,切,接,转,增,检,工程菌（或细胞）构建中重要的工具,工具,：酶,限制性内切酶,连接酶,逆转录酶,Klenow 酶大片段（DNA聚合酶 I）,核酸酶S1,第三节 目的基因的获得,克隆真核基因常用方法：逆转录法和化学合成法。（不能直接分离？）,一、逆转录法,逆转录法,就是先分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的克隆表达。,cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内含子。,逆转录法的步骤,1、mRNA的纯化,2、cDNA第一链的合成,3、cDNA第二链的合成,4、cDNA克隆,5、将重组体导入宿主细胞,6、cDNA文库的鉴定,7、目的cDNA克隆的分离和鉴定,cDNA克隆示意图,mRNA,逆转录酶,ss-DNA,DNA聚合酶I,Klenow片段,ds-cDNA,ds-cDNA,核酸酶S1,不需合成第二链,mRNA,逆转录酶,ss-DNA,PCR,特异引物,目的cDNA链,1985，PCR发明以后，RT-PCR得到了广泛的应用。,二、逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR）,三、化学合成法,较小的蛋白质或多肽的编码基因可以用化学合成法合成。,必须知道目的基因的核苷酸顺序或目的蛋白质的氨基酸顺序。,人工化学合成的限制：一不能合成太长的基因，5060bp；二是人工合成时，遗传密码的简并性可导致中性突变；三是费用较高。,四、筛选基因的新方法,五、对已发现基因进行改造,第四节 基因表达,基因表达,：,是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。,基因高效表达,：将外源基因片段拼接到另一个基因表达体系中，使既获得原生物活性又可高产的表达产物。,最佳的基因表达体系,：生物活性高、表达产量高、表达产物稳定、表达产物容易分离纯化,。,一、宿主细胞的选择,好培养，,快速长，,少危害，,易重组，,高量率，,简提纯。,宿主细胞常用两大类：,原核细胞,：常用有,大肠杆菌,、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；,真核细胞,：常用有,酵母,、丝状真菌、哺乳动物细胞等。,原核细胞,大肠杆菌：,基因工程研究中采用最多的原核表达体系。,优点,：生长快速、代谢简单、遗传体系清楚、容易操作、细胞破碎容易。,缺点,：,不存在导向内质网的信号序列，分泌能力不足，产品多为胞内产物，提取困难；,蛋白表达后不能修饰加工（糖基化等）；,产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基，能引起免疫反应；,内毒素存留。,枯草芽胞杆菌：,分泌能力强，蛋白质不形成包含体。产物蛋白质不能糖基化。有很强的胞外蛋白酶对产物降解。,链霉菌：,作为外源性基因表达受到重视。不致病、使用安全、分泌能力强、表达产物可糖基化。,真核细胞,酵母,是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。,丝状真菌,优点,：分泌能力强，能正确进行翻译后加工（肽剪切、糖基化）有成熟的发酵和后处理工艺。,哺乳动物细胞,优点,：表达产物可由重组转化细胞分泌到培养液中，纯化容易。产物是糖基化的接近天然物。,缺点,：生长慢，生产率低，培养条件苛刻，费用高，培养液浓度稀。,二、大肠杆菌体系中的基因表达,（一）表达载体,表达载体必须具备的条件,（1）载体能独立地进行复制(复制起点，ori),（2）应具有灵活的克隆位点和方便的筛选标记,（3）应具有很强的启动子，能为大肠杆菌的RNA聚合酶所识别。,（4）应具有阻遏子,，使启动子受到控制，只有当诱导时才进行转录。,（5）应具有很强的终止子,，以便使RNA聚合酶集中力量转录克隆的外源基因.,（6）所产生的mRNA必须具有翻译的起始信号，即起始密码AUG和SD序列,以便转录后能顺利翻译。,常用表达载体 pBV220系统,启动子,多克隆位点,终止子,阻遏子,P23,复制起始位点,它已成功地表达了,人白细胞介素2,，,干扰素,和,肿瘤坏死因子,等外源基因。,氨苄青霉素抗性基因,限制性内切酶,SD序列,pBG-2,是由,pBV220,系统衍生的便于产物纯化的融合表达载体。,该质粒在P,R,P,L,启动子下游插入,G蛋白,中与,IgG Fc段,结合的结构域基因片段180个核苷酸，下游是多克隆位点，引入了剪切融合蛋白的切点，具有与IgG结合的活性，可用亲和层析。简化下游工艺。,pBG-2,（二）影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素,外源基因的剂量,外源基因拷贝到高拷贝数的表达质粒上，总体表达水平提高,外源基因的表达效率,与启动子强弱，核糖体结合位点的有效性，SD序列与起始密码的间距，密码子的组成等都影响其表达效率,表达产物的稳定性,细胞代谢负荷,宿主细胞的生长与重组质粒的复制分开,细胞的生长和外源基因的表达分成两个阶段,工程菌的培养条件,优化工程菌培养条件，提高基因表达水平,（三）,真核基因在大肠杆菌中的表达形式,以,融合蛋白,的形式表达药物基因,以,原核多肽,和,真核蛋白,结合在一起称融合蛋白。,优点：操作简便，表达蛋白在菌体内稳定，易实现高效表达；,缺点：只能作抗原用。,以非融合蛋白的形式表达药物基因,非融合蛋白指在大肠杆菌中表达的蛋白质以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，在其氨基端不含细菌多肽序列。,优点,：保持原有蛋白活性；,缺点,：易被蛋白酶破坏。,分泌型表达蛋白药物基因,优点,：在周质中稳定，有活性，不含 蛋氨酸残基；,缺点,：产量不高，信号肽不被切割。,三、酵母中的基因表达,（一）表达载体,酵母载体是可以携带外源基因在酵母细胞内保存和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA或RNA单位。,1.载体的复制序列,酵母附加体质粒（yeast episomal plasmid，Yep类）,酵母复制型质粒（yeast replication plasmid，Ypp类）,酵母着丝粒质粒（yeast centromeric plasmid，YCp类）,酵母整合型质粒（yeast inteegrative plasmid，YIp类）,2.克隆载体,酵母质粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只有在最后阶段才转入酵母中，这就要求酵母载体也同时具有在大肠杆菌中复制和增殖的能力。,3.表达载体,将酵母菌的启动子和终止子等有关控制序列引入上述载体的适当位点后，就构成了酵母菌的表达载体。,又分为,普通表达载体和精确表达载体,普通表达载体,，,只能方便地引入外源基因并进行表达，对表达产物的组成，特别是对其N末端氨基酸是否增减并无严格要求。,精确表达载体,，,要求在启动子或信号肽编码序列的适当部位有内切酶点，以利于接入外源基因，并使他在表达加工后N末端氨基酸序列与天然产物相同，既无多余的氨基酸，也无缺失的氨基酸。,（二）影响目的基因在酵母菌中表达的因素,外源基因的剂量,外源基因的表达效率,外源蛋白的糖基化,宿主菌株的影响,(5)培养条件,四、动物细胞中的基因表达,优点：产物类似于天然产物，容易分离纯化,缺点：动物细胞生长慢，培养条件苛刻，费用高培养液浓度较小。,主要基因工程表达体系比较,表达体系,产 物 产生部位 培养方式 提 纯 产物活性 潜在危性,大肠杆菌 多肽蛋白质 菌体内 容易 一般 对原核好 不大,融合蛋白质 部分高产 对真核差,酵 母 多肽蛋白质 菌体内 容易 菌体内 真核的接近 不大,糖基化蛋白 外分泌 可高产 稍复杂 天然产物,哺乳动物 完 整 外分泌 较难成本高 简单 可达天然 需注意,糖基化蛋白 可高产 产物 致癌,1、mRNA的纯化,真核细胞 mRNA 3-polyA（20250),采用Oligo dT-纤维素，以亲和层析法将mRNA从细胞总RNA中分离出来。,2、cDNA第一链的合成,可用寡聚dT作为引物，在逆转录酶的催化下，开始cDNA链的合成。,3、cDNA第二链的合成,除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链(,碱解或RNaseH酶解,),然后以cDNA第一链为模板合成第二链。由于第一链cDNA链3-末端往往形成一个发夹形结构，所以，可以从这一点开始合成cDNA第二链(,常用Klenow酶或DNA聚合酶I,),切除发夹结构（,核酸酶S1，专一性切除单链DNA,）,4、cDNA克隆,用于cDNA克隆的载体有三类：,细菌质粒,（如pBR322、pUC等）插入片段10kb,动植物病毒,根据重组后插入的cDNA能否经转录和翻译合成蛋白质,非表达型载体,（pBR322及gt10）,表达型载体,（pUC及gt11）有利于目的基因的筛选,5、将重组体导入宿主细胞,1、转化：,指质粒DNA 或以它为载体构建的重组DNA 导入细菌的过程。,2、转染,：,指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。,脂质体介导：,原生质体融合：,电穿孔：,显微注射：,基因枪：,病毒介导：,农杆菌转染：,6、cDNA文库的鉴定,1、表型改变：,抗生素抗性,（抗性基因失活和菌落或噬菌斑颜色改变）,a互补：,报告基因：,缺陷恢复：,2、结构特征：,DNA大小：,酶切图谱：,杂交（核酸、蛋白）：,PCR检测：,DNA序列分析,3、免疫化学检测：,表达产物分析,7、目的cDNA克隆的分离和鉴定,从cDNA文库中分离特异的cDNA克隆，主要采用：,（1）核酸探针杂交法。,根据目的蛋白质的氨基酸序列，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库中分离特异cDNA克隆。,（2）免疫反应鉴定法。,用表达型载体构建的cDNA文库，可用免疫学方法分组逐一鉴定各cDNA的表达产物，即以某种蛋白质的抗体寻找相应的特异cDNA克隆。,外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理,启动子,终止子,核糖体结合位点,密码子,转录,翻译,启动子和终止子的强弱；,大肠杆菌高效表达需要强的启动子和终止子。,外源基因在强启动子的控制下表达，容易发生转录过头现象，即 RNA 聚合酶滑过终止子结构继续转录质粒上邻近的 DNA 序列，形成长短不一的 mRNA 混合物过长转录物的产生在很大程度上会影响外源基因的表达。,对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。,外源基因在大肠杆菌细胞中的高效表达不仅取决于,转录启动的频率,，而且在很大程度上还与 mRNA 的,翻译起始效率,密切相关。,mRNA 翻译的起始效率主要由其 5 端的结构序列（消除二级结构）所决定，称为,核糖体结合位点（RBS）。,核糖体结合位点的有效性,SD 序列与翻译起始密码子之间的距离,SD序列与起始密码子AUG之间的精确距离保证了mRNA在核糖体上定位后，翻译起始密码子,AUG,正好处于,核糖体复合物结构中的 P 位,，这是翻译启动的前提条件。在很多情况下，SD 序列位于 AUG 之前大约,七个,碱基处，在此间隔中少一个碱基或多一个碱基，均会导致翻译起始效率不同程度的降低。,由于原核生物和真核生物基因组中密码子的使用频率具有较大程大的差异性，因此外源基因尤其是高等哺乳动物基因在大肠杆菌中,高效翻译,的一个重要因素是密码子的正确选择。,一般而言，有两种策略可以使外源基因上的密码子在大肠杆菌细胞中获得最佳表达：,外源基因全合成,同步表达相关 tRNA 编码基因,密码子组成,生物体对密码子的偏爱性,