甘肃部分地区苹果褐腐病病原分离鉴定及拮抗细菌筛选.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(10):209-218收稿日期：20230316基金项目：甘肃省农业科学院科技支撑计划（2021GAAS07，2021GAAS17，2023GAAS18），国家重点研发计划（2018YFD02014044），国家绿肥产业技术体系旱地绿肥病虫草害综合防控（CARS22G20），甘肃省林业和草原科技创新项目（GYCX2020031）作者简介：蒋晶晶，女，助理研究员，研究方向：经济作物病害病理学及生物防治；Email:通讯作者：李继平，男，研究员，研究方向：经济作物病害及微生物资源；Email:甘肃部分地区苹果褐腐病病原分离鉴定及拮抗细菌筛选蒋晶晶1，3 周昭旭1，3 杜蕙1，3 吕昭龙2 王春明1，3 郭建国1，3 张新瑞1，3 李继平1，2，3（1.甘肃省农业科学院植物保护研究所，兰州 730070；2.甘肃农业大学植物保护学院，兰州 730070；3.农业农村部天水作物有害生物科学观测试验站，天水 741299）摘 要：明确甘肃省静宁县及榆中县苹果褐腐病的病原种类，并筛选优质病原拮抗菌，为苹果采后病害的生物防治提供资源。采用常规组织分离法对苹果褐腐病病果进行病原菌分离纯化、柯赫氏法则验证、分子生物学方法结合形态学鉴定；采用平板对峙法筛选拮抗细菌，利用形态学、生理生化和分子生物学方法对拮抗菌进行鉴定，用离体果实测定拮抗菌防病效果。结果表明，引起甘肃静宁县及榆中县苹果褐腐病的病原菌为云南链核盘菌（Monilia yunnanensis），筛选获得的最优拮抗细菌 X22 为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），对 M.yunnanensis 的菌丝抑制率达（81.290.57）%，在离体果实上拮抗菌的防治效果达 98.8%，能够显著抑制苹果褐腐病病斑在果实上的扩展速度。云南链核盘菌为甘肃部分地区苹果褐腐病主要病原菌，该研究筛选出的拮抗细菌 X22 抑菌效果显著，具有作为优质生防菌株的潜力。关键词：苹果褐腐病；云南链核盘菌；解淀粉芽孢杆菌；生物防治DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.20230234Isolation and Identification of Apple Brown Rot Pathogen in Parts of Gansu and Screening of Antagonistic Bacteria JIANG Jingjing1,3 ZHOU Zhaoxu1,3 DU Hui1,3 LYU Zhaolong2 WANG Chunming1,3 GUO Jianguo1,3 ZHANG Xinrui1,3 LI Jiping1,2,3（1.Institute of Plant Protection,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070;2.College of Plant Protection,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070;3.3.Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Tianshui,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Tianshui 741299）Abstract:This work aims to clarify the pathogenic species of apple brown rot in Jingning county and Yuzhong county of Gansu province and to screen highquality pathogen antagonistic bacteria for providing resources for biological control of apple postharvest diseases.The pathogens were isolated and purified by conventional tissue isolation method,verified by Kochs postulates,and identified by molecular biology method combined with morphology.The antagonistic bacteria were screened by plate confrontation,identified by morphological,physiological,biochemical and molecular biological methods,and the disease control effects of the antagonistic bacteria were determined by in vitro fruits.The results showed that the pathogens causing apple brown rot in Jingning county and Yuzhong county of Gansu province were Monilia yunnanensis.The optimal antagonistic bacterium X22 was Bacillus amyloliquefaciens,which inhibited（81.290.57）%of the mycelium of M.yunnanensis and 98.8%of the control effect of the antagonistic bacteria on the isolated fruits.It significantly inhibited the expansion rate of M.yunnanensis lesion spots of apple fruits.M.yunnanensis was the main pathogen of apple brown rot in some areas of Gansu province.The endogenous antagonistic bacterium X22 screened in this study had significant antibacterial effect and had the potential of being a highquality biocontrol strain.Keywords:apple brown rot;Monilia yunnanensis;Bacillus amyloliquefaciens;biological control生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10210苹果在我国北方广泛种植，甘肃的苹果种植面积达 44.13 万 hm2，是全国苹果的主产省份之一1。病虫害导致的检疫问题是我国苹果国际市场准入的重要挑战2。苹果褐腐病是美国、加拿大、澳大利亚等国的检疫对象，是严重危害苹果生产的一种世界性病害，该病不仅在果树生长期进行危害，造成花腐、果腐、枝条溃疡等，还能引起储藏期烂果，对苹果产业造成严重威胁3。苹果褐腐病病原菌主要有 6 种，其中有性态 3个种4：实生链核盘菌（M.fructicola）、核果链核盘菌（M.laxa）和果生链核盘菌（M.fructigena）；未发现有性态的 3 个丛梗孢属种5-7：梅生链核盘菌（M.mumecola）、云南链核盘菌（M.yunnanensis）和多子座链核盘菌（M.polystroma）。虽然不同的褐腐病菌种群都能侵染果树引起褐腐病，但其分布及寄主偏好有一定差异。目前，世界上报道的能侵染苹果并引起褐腐病的病原菌种类主要有：M.fructicola8、M.laxa、M.fructigena9、M.polystroma10和 M.yunnanensis11，其中陕西、河北、北京、云南、新疆等苹果产区的优势致病菌为（M.yunnanensis），甘肃地区苹果褐腐病的致病菌种类报道较少。因此，明确苹果褐腐病致病菌种类对甘肃地区苹果病害防治具有重要指导意义。对苹果褐腐病的防治，生产上主要采用化学杀菌剂，如波尔多液、甲基托布津等12。化学杀菌剂的长期大量使用，导致病原菌产生抗药性，同时农药残留会污染生态环境，影响苹果的品质与安全。生物防治是一种高效、无毒、无污染的防治策略，且不易使病原菌产生抗药性。近年来，越来越多的生物农药被开发应用，毛壳菌是一种极具生防潜力的真菌，能够产生大量的纤维素酶13，可以抑制病原菌生长，如球毛壳菌（Chaetomium globosum）可用于防治苹果褐腐病并开发为防治苹果采后病害的生防制剂14；芽孢杆菌属的菌株因其营养需求简单、繁殖生长快、代谢产物丰富、可产抗逆性芽孢等特点而具有显著的生防潜力，成为研发生防菌剂的理想菌株15。目前报道的对褐腐病菌有显著抑制作用的芽孢杆菌有死谷芽孢杆菌（Bacillus vallismortis）、高地芽孢杆菌（B.altitudinis）和特基拉芽孢杆菌（B.tequilensis）16-17，但国内外对于拮抗 M.yunnanensis的生防芽孢杆菌筛选研究较少。本研究从甘肃苹果主产区（静宁及榆中县）采集褐腐病病果，分离并鉴定病原菌。以其为供试靶标菌，从本实验室已保存的内生拮抗菌库中筛选优良拮抗菌，测定其对褐腐病防病效果，明确拮抗菌种类与特性，旨在探明引起甘肃静宁县及榆中县苹果褐腐病的病原菌种类，以期获得对苹果褐腐病有较强生防作用的拮抗菌。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 供试菌株 供试病原真菌：苹果褐腐病病果采集于甘肃省静宁县和榆中县，品种为 秦冠 和 红富士，并于同地区采集秦冠和红富士健康果实若干作为离体接种试验用材料。供试拮抗细菌：健康葡萄植株的根、茎、叶中分离筛选得到的 5 株具有广谱性的内生拮抗菌，由甘肃省农业科学院植物保护研究所经济作物病害研究室保存。1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 自然；牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（NA）：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，琼脂 15 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0；牛肉膏蛋白胨培养基（NB）：牛肉膏 5 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。1.2 方法1.2.1 病原菌的分离纯化 采用常规组织分离法18，在超净工作台内选取发病中期的褐腐病病果，在病健交界处用手术刀切取约为 5 mm5 mm 的组织，用 75%的酒精浸泡 30 s，再用 1%次氯酸钠溶液处理 3 min，灭菌水冲洗 3 次后，在灭菌干燥滤纸上自然风干，然后置于 PDA 培养基中，25恒温培养箱黑暗培养 3-4 d，待长出菌落后挑取菌丝尖端进行纯化，转接至 PDA 斜面 4保存。对分离所得的菌株依据病害缩写（HF）+字母原则对其进行命名。1.2.2 病原菌回接（柯赫氏法则）采用室内离体果实打孔接种菌饼和孢子悬浮液的方法进行致病性测定。选择大小均匀、成熟度一致无病虫斑和机械损伤的秦冠和红富士苹果作为接种材料。试2023,39(10)211蒋晶晶等：甘肃部分地区苹果褐腐病病原分离鉴定及拮抗细菌筛选验前将果实用 75%酒精擦洗，随后用灭菌水冲洗 3次，待果实表皮自然风干后备用。打孔接种菌饼法：先用灭菌打孔器（直径 5 mm）在果实赤道部位打孔，深度为 3 mm，用灭菌打孔器（直径 5 mm）在事先活化 5 d 的新鲜菌落边缘打取菌饼，菌丝面紧贴于孔内，以空白 PDA 菌饼为对照。打孔接种孢子悬浮液法：用移液器吸取浓度约为 1105个/mL 的孢子悬浮液 15 L 注于孔内，以接种灭菌水为对照。以上每处理 3 个果实，每个果实设 3 个接种点，共 9 个重复。将处理后的果实置于铺有保湿纱布的密封 15 L 塑料盒中，25 12 h 光暗交替培养，第 5 天观察并统计果实发病情况，对发病果实进行病原菌再分离。1.2.3 病原菌形态鉴定 将分离纯化的病原菌转接于 PDA 平板上，置于 25恒温培养箱中黑暗培养。6 d 后进行菌落形态、生长速率、孢子大小等观察和测定。参照 Lane19形态学鉴定方法和真菌鉴定手册20进行供试菌株的形态学鉴定。1.2.4 病原菌分子生物学鉴定 将菌株接种在铺有灭菌玻璃纸的 PDA 平板上进行培养，25恒温黑暗培养 5 d 后收集菌丝，采用 CTAB 法21提取菌株基因组 DNA。选取真菌通用引物 ITS1（5TCCGTAGGTGAACCTGCGC3）和 ITS4（5TCCTCCGCTTATTGATATGC3）进行扩增。25 L PCR反应体系为2PCR Master Mix 12.5 L、正反向引物（10 mol/L）各 0.5 L、DNA 模 板 1.0 L，ddH2O 补 至 25 L。PCR 扩增程序为 94 2 min；94 45 s，55 30 s，72 45 s，35 个循环；72 10 min，4保存。用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，并将阳性条带的样送生工生物工程（上海）有限公司测序，所测序列在 NCBI 网站进行BLAST 同源性比对分析比对。下载 GenBank 中的相似性较高的序列用 MEGA 5.0 程序中的邻接法构建系统发育树，共循环 1 000 次。1.2.5 拮抗细菌的筛选与鉴定1.2.5.1 拮抗细菌的筛选 以苹果褐腐病病原菌为靶标菌，采用平板对峙法22筛选拮抗细菌。将病原菌置于 PDA 培养基 25活化培养 7 d 后打成直径0.5 cm 的菌饼，接种在 PDA 培养基中央，5 株拮抗菌经 NA 培养基 28，48 h 活化后点接在距菌饼 2.5 cm 处，每平板 4 点，以不接生防菌为对照，重复 3 次。置于 25培养，待对照病菌长满培养皿时，测量菌落直径，计算抑制率。?%?=?0.5?0.5?0.5?100%1.2.5.2 离体果实防效测定 参考 Sadeghian 等23方法，用红富士苹果测定拮抗菌对褐腐病菌的抑制活性。拮抗菌菌悬液的制备：将拮抗菌接种于 150 mL 的 NB 培养基，在 28，转速 150 r/min 摇培 48 h，到达稳定期得到菌悬液。选取大小均一的红富士苹果果实，用 75%酒精擦洗，灭菌水冲洗后晾干，用灭菌打孔器（直径 5 mm）在果实赤道部位打 5 mm（宽）3 mm（深）的伤口，用于接种。设置 3个处理：（1）预防组，接种 M.yunnansis 菌饼前 24 h 往孔口内接种 15 L 菌悬液。（2）治疗组，接种M.yunnansis 菌饼时接种菌悬液及接种 M.yunnansis菌饼 24 h 后接种菌悬液。（3）对照组，仅接种 M.yunnansis 菌饼。以上每处理 3 个果实，每个果实设3 个接种点，共 9 个重复。将处理后的果实置于铺有保湿纱布的密封 15 L 保鲜盒中，25 12 h 光暗交替培养，接种生防菌液 5 d 后测量病斑大小。2?2?%?=?100%?cm2?=1.2.5.3 拮抗菌形态学及生理生化指标测定 将拮抗菌株于NB和PDA平板上划单菌落，37培养24 h，参照东秀珠常见细菌系统鉴定手册24进行菌落形态观察和生理生化特性鉴定，并对菌株进行革兰氏染色，在油镜下观察形态特征。1.2.5.4 拮抗菌分子生物学鉴定 采用天根细菌基因组提取试剂盒，按照说明方法提取菌株基因组DNA。根据 16S rRNA 两端的保守序列，采用细菌鉴定通用引物 27F（5AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3）和 1492R（5GGTTACCTTGTTACGACTT3）及gyrA 基 因 引 物 gyrAF（5CAGTCAGGAAATGCG生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10212TACGTCCTT3）和 gyrAR（5CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT3）进行扩增。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。50 L PCR 反应体系为10buffer（含 2.5 mmol/L Mg2+）5.0 L、Taq 聚合酶（5 U/L）1.0 L、dNTP（10 mmol/L）1.0 L、正反向引物各 0.5 L、基因组 DNA 1.0 L 和 ddH2O 41.0 L。16S rRNA 扩增程序为 94 5 min；94 30 s，56 45 s，72 1 min，30 个循环；72 10 min。gyrA 扩增程序为 94 5 min；94 1 min，60 1 min，72 1 min，30 个循环；72 10 min。用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，确认 PCR 扩增片段，并送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。用 NCBI 网站将所得序列与 GenBank 数据库进行同源性比对分析，用MEGA 5.0 程序中的邻接法构建系统发育树。1.2.6 数据处理 数据用 Excel 2007 处理后，采用统计学软件 SPSS 17.0 对各组数据进行单因子方差分析，结果以“平均值 标准差”表示，组间采用 t检验法多重比较其差异显著性，以 P0.05 作为判断其显著性的标准。2 结果2.1 苹果褐腐病病原菌分离鉴定及致病性测定2.1.1 苹果褐腐病病原菌的分离 苹果褐腐症状主要表现为果实黄褐色软腐并在表面形成褐色圆形斑点，后期病斑蔓延至全果，褐色圆形斑点变为蓝黑色并凹陷致使果实皱缩，提前黄化形成畸形僵果（图1A），部分病果上出现点状灰色霉层（图 1B）。从自然发病的苹果果实上分离纯化得到 5 个形态一致的培养物，命名为 HFA-HFE。2.1.2 病原菌致病性测定 将分离的真菌回接于健康苹果上进行致病性测定。接种 2 d 后接种部位附近出现褐色病斑，5 d 后接种部位褐色软腐状严重，已经完全覆盖果实的一侧，果实表面陆续出现蓝黑色菌丝斑块，有少量白色菌丝及分生孢子产生，且菌饼接种后病斑扩展速率为 7.3 mm/d，快于孢子悬浮液接种的病斑扩展速率 6.9 mm/d；菌饼接种的腐烂病斑上更容易长出菌丝和分生孢子；病原菌在红富士品种上的致病力明显强于秦冠（图 1C-F）；发病症状与自然条件下发病症状一致且对照均未发病。2.1.3 病原菌的形态特征 分离得到的 5 株病原菌在 PDA 平板上生长良好（8.50.59）mm/d，菌落最初为灰白色，后逐渐加深，最后变为灰褐色。菌落中间颜色较深，边缘整齐，气生菌丝贴近培养皿生长，呈灰褐色纤维絮状或绒毡状，背面可见黑色的基质或黑环。分生孢子梗不分枝，或二叉状分枝，分枝多呈锐角，产孢梗长短不一。分生孢子无色，单孢（10-21）m（7-12）m，链状排列，卵圆形、长椭圆形和柠檬形，产孢量较少（图 2）。结合 Lane19的褐腐病菌形态鉴定方法和魏景超真菌鉴定手册20，5 个分离株形态特征均与（M.yunnanensis）模式菌相似。2.1.4 ITS 序列扩增与系统发育分析 5 个分离菌株的 ITS 片段大小均为 482 bp，且比对后只有 1 个碱基存在差异，因此，将 5 个分离物视为同一种菌，序列上传至 GenBank，获得登录号为 OL440404。在NCBI 中进行 BLAST 分析，分离株 ITS 序列与 M.yunnanensis 相似度在 99%以上。从 GenBank 数据库中下载相似性最高的同种和近似种褐腐病菌菌株的若干序列，以核盘菌科蜡盘菌属（Rutstroemia paludosa）为外群，用 MEGA 5.0 软件，采用邻接法构建系统发育进化树。结果（图 3）表明，代表CDEFABA-B：病害症状（A：秦冠，B：红富士）；C，E：菌饼接种 5 d（C：秦冠，E：红富士）；D，F：孢子悬浮液接种 5 d（D：秦冠，F：红富士）A-B:Disease symptom（A:Qinguan apple.B:Red Fuji apple）.C,E:Fungus cake inoculation for 5 d（C:Qinguan apple.E:Red Fuji apple）.D,F:Spore suspension inoculation for 5 d（D:Qinguan apple.F:Red Fuji apple）图 1 苹果褐腐病果实自然发病症状及病原菌接种症状Fig.1 Disease characteristics of brown rot of apple and symptoms of pathogenic inoculation2023,39(10)213蒋晶晶等：甘肃部分地区苹果褐腐病病原分离鉴定及拮抗细菌筛选菌株 HFA 与 M.yunnanensis 聚在同一分支，与 M.fructigena 归在同一个大分支，表明甘肃静宁县及榆中县苹果褐腐病的病原菌为 M.yunnanensis，与 M.fructigena 亲缘关系较为接近。2.2 拮抗菌的抑菌效果与鉴定2.2.1 拮抗菌对苹果褐腐病菌的抑制作用 从5 株广谱性较好的拮抗菌中筛选得到 3 株对 M.yunnanensis 具有较好抑制效果的菌株。其中，拮抗菌 X22 和 Zyx3 对褐腐病菌的抑制效果最好，抑菌率 分 别 为（81.290.57）%和（80.080.66）%，抑菌带宽度分别达（7.420.17）mm 和（5.420.51）mm，各处理间差异均达显著水平（P0.05）（表 1）。因 X22 菌株对褐腐病菌的抑制效果最好，后续对其进行离体果实上抑菌效果测定（图 4）。2.2.2 拮抗菌在果实上的抑菌效果 在 25光暗交替条件下，第 5 天时处理 A（治疗组）全部发病，果实上病斑面积达 24.3 cm2，对照病斑遍及果实的一侧（面积达 50.5 cm2），整体防治效果达 52.0%；处理 B（治疗组）和处理 C（预防组）病斑面积分别为 0.5 和 0.4 cm2，防效分别为 98.4%和 98.8%，且差异不显著，防治效果优于处理组 A（图 5 和图 6）。表明菌悬液和病原菌同时接种或提前接种菌悬液均能发挥较好的防治效果。2.2.3 X22 菌株的形态学鉴定 将菌株接种至 PDA平板上，28培养 5 d 后，拮抗菌 X22 菌落似火山堆，呈乳白色不透明，表面粗糙有褶皱，边缘不规则。显微观察发现，菌体呈杆状，革兰氏染色阳性（图 7）。2.2.4 X22 菌株的生理生化特性 根据常见微生物鉴定手册可知，该拮抗细菌与解淀粉芽孢杆菌 B.amyloliquefaciens 的生理生化特性一致（表 2）。2.2.5 X22 菌株的分子鉴定 在 NCBI 数据库中BLAST 比对分析发现，菌株 X22 的 16S rRNA 序?Moniliayunnanensis MT974181?M.yunnanensis MZ544393HF-A OL440404?Monilia fructigena EU520073?M.fructigena HF548711?Monilinia polystroma GU067539?M.polystroma KJ814976?Monilinia fructicolaHQ893748?M.fructicola FJ515894?M.fructicola KM279616?Monilinia laxa KC544796?M.laxa KC544795?Rutstroemia paludosa KF5883761009171899490900.000.010.020.030.040.05图 3 基于 rDNA-ITS 序列采用邻接法构建的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree constructed using the neighbour-joining based on rDNA-ITS sequencesABCDA：菌落正面；B：菌落背面；C：分生孢子梗（1040）；D：分生孢子（1040）；标尺=20 mA:The front of the colony.B:The back of the colony.C:Conidiophores（1040）.D:The conidium（1040）.Scale bar=20 m图 2 苹果褐腐病菌的菌落形态及分生孢子形态Fig.2 Colony and conidial morphology of apple brown rot bacteria表 1 拮抗菌对苹果褐腐病菌的抑制作用Table 1 Inhibition effect of antagonistic bacterium on M.yunnanensis菌株编号Strain No.抑菌率Inhibition rate/%抑菌带Inhibition bands/mmX2281.290.57a7.420.17aZyx380.080.66b5.420.51aX1574.640.97c4.250.38aX1671.290.62d4.110.42aPsy370.880.52d3.200.55a注：表中数据为平均值数值 标准误，小写字母表示在 P0.05 水平差异显著Note:Data in the table are mean SE and lowercase letters indicates significant differnece at P0.05 level生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10214列与解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）、甲基营养型芽孢杆菌（B.methylotrophicus）和贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）同属近缘种，序列同源性达 100%，从构建的系统发育树中可以看出与其处在同一分支上，无法明确菌株 X22 种的分类地位。菌株 X22 的 gyrA 基因序列与已知解淀粉芽孢杆菌 KU904810、KU847915 和LC096068 的 gyrA 基因序列同源性分别为 99%，菌株 X22 与以上解淀粉芽孢杆菌属同一分支，可将菌株 X22 鉴定为解淀粉芽孢杆菌（图 8）。根据 gyrA基因序列构建的系统发育树，可将更接近的解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌清晰区分为 2 个分支。3 讨论本试验对采自甘肃省静宁县和榆中县苹果产区的褐腐病果上分离的菌株，采用 ITS 序列结合形态学将其鉴定为云南链核盘菌（M.yunnanensis），这与报道的中国梨和苹果的褐腐病菌优势种为 M.yunnanensis 的研究结果一致11，而与周芳25和牛程旺等26报道的山西省和新疆苹果、梨褐腐病主要病原菌种群为 M.fructigena25研究结果不一致，这可能与不同地区的生态环境、气候类型等因素有关。M.yunnanensis 是 2011 年发现于我国云南省的新种，分布于云南的大部分地区6，同时也在北京、河北、陕西、甘肃、新疆及辽宁等省（市）采集到，可以危害桃、杏、山楂、苹果及梨等27-28。据报道，不同地区苹果褐腐病菌种群之间存在差异，本试验仅对甘肃静宁县和榆中县苹果主产区的苹果褐腐病进行了研究，但有关全省和全国不同地区的褐腐病图 4 拮抗菌 X2-2 对苹果褐腐病菌的拮抗效果Fig.4 Effect of antagonistic bacteria X2-2 against M.yun nanensis ABCCK-ACK-CCK-BA：先接菌饼，24 h 后接 X22 菌悬液；B：菌饼+菌悬液；C：先接 X22 菌悬液，24 h 后接菌饼A:Inoculated with the M.yunnanensis first,and then inoculated with the X22 bacterial suspension after 24 h.B:M.yunnanensis+bacterial suspension.C:First inoculated with X22 bacterial suspension,then inoculated with M.yunnanensis after 24 h图 6 X2-2 菌悬液对苹果褐腐病病斑扩展的抑制效果Fig.6 Inhibition effect of X2-2 bacterial suspension on the lesion expansion of M.yunnanensisA B 图 7 拮抗菌 X2-2 的单菌落（A）和革兰氏染色（B）Fig.7 Colony（A）and Gram stain（B）of antagonistic bacterium X2-2abbbaa020406080100120051015202530ABC?Lesion area/cm2?Control effect/%A：先接菌饼，24 h 后接 X22 菌悬液；B：菌饼+菌悬液；C：先接 X22 菌悬液，24 h 后接菌饼。图中小写字母表示在 P0.05 水平差异显著A:Inoculated with the M.yunnanensis first,and then inoculated with the X22 bacterial suspension after 24 h.B:M.yunnanensis+bacterial suspension.C:First inoculated with X22 bacterial suspension,then inoculated with M.yunnanensis after 24 h.Lowercase letters indicate significant difference at P0.05 level图 5 接种时间对病斑面积和防治效果的影响Fig.5 Effect of inoculation time on lesion area and control effect2023,39(10)215蒋晶晶等：甘肃部分地区苹果褐腐病病原分离鉴定及拮抗细菌筛选菌种群的遗传多样性需进一步探索，为该病原菌的种群分化及不同地区核果类及仁果类果实褐腐病的有效防治提供理论依据。芽孢杆菌属由于其具有较好的抑制植物病原菌的能力，并且其产生的芽孢具有很强的抗逆性，有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、表 2 拮抗菌 X2-2 的生理生化鉴定结果Table 2 Physiological and biochemical identification results of antagonistic bacterium X2-2指标 Index结果 Result指标 Index结果 Result革兰氏染色 Gram staining+V.P 试验 V.P test+淀粉水解 Amylolysis+甲基红试验 Methyl red test+明胶液化 Gelatin liquefaction+柠檬酸盐 Citrate utilization+酪蛋白水解 Caseinhydrolyzation硫化氢试验 Hydrogen sulfide test7%NaCl+接触酶 Catalase+注：“+”呈阳性，“”呈阴性Note:“+”indicates positive and“”indicates negative?Bacillus amyloliquefaciens KU904810?B.amyloliquefaciens KU847915?B.amyloliquefaciens LC096068 X2-2 gyrA OL906297?B.velezensis MW410989?B.velezensis MT329071?B.velezensis MW879349?B.acillus mojavensis AY212986?B.mojavensis MW879350?B.atrophaeus MW879354?B.atrophaeus MW879353?B.inaquosus EU138633?B.subtilis EU138657?B.subtilis EU138590?B.licheniformis AF272018?B.licheniformis KX670827100100100100971005410010053990.05?Bacillus amyloliquefaciens MG593944?B.subtilis KU551250?B.methylotrophicus KT902018?B.amyloliquefaciens KP419724 X2-2 16S rRNA OL872200?B.velezensis NR 075005?B.amyloliquefaciens NR 118950 B.capparidis NR 156073?B.cereus NR 074540?B.terrae NR 156900 100100100670.01AB图 8 基于 16S rRNA（A）和 gyrA（B）基因序列构建的拮抗菌 X2-2 的系统发育树Fig.8 Phylogenetic tree of antagonistic bacterium X2-2 based on 16S rRNA(A)and gyrA(B)sequences生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.10216定殖与繁殖，目前被广泛用于农业领域29。近几年，已有学者筛选出了一些拮抗 M.fructigena 的贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）30、拮抗 M.fructicola的解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）和特基拉芽孢杆菌（B.tequilensis）17、地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）31，但国内外对于拮抗 M.yunnanensis的生防菌筛选研究较少，本研究通过平板对峙筛选出抑菌效果最好的解淀粉芽孢杆菌 X22，对 M.yunnanensis 的菌丝抑制率达（81.290.57）%，在离体果实上打孔接种拮抗菌菌悬液 24 h 后再接种病原菌菌饼，拮抗菌的防治效果高达 98.8%，说明该拮抗菌具有很强的附着能力，能在受伤果实表面迅速定殖，有效降低果实病斑扩展速度。现在普遍认为，与病原物进行营养物质与空间位点竞争是拮抗微生物防治病害最主要的作用机制之一32。本研究中接种M.yunnansis菌饼同时接种菌悬液的处理与接种M.yunnansis 菌饼 24 h 后接种菌悬液的处理，培养 5 d后防治效果分别为 98.4%和 52.0%，说明病原菌与拮抗菌同时接种时拮抗菌能够更快地利用果实机械伤口处的营养，阻止病原菌的侵入和扩展，这也很好解释了为什么越早接种拮抗菌生防效果越好。但关于该菌株在实际储藏果实上的防治效果还需进一步试验验证。4 结论甘肃静宁县及榆中县的苹果褐腐病的病原菌为云南链核盘菌（M.yunnanensis）。以该病原菌为靶标，以分离自葡萄的 5 株优良拮抗内生菌为研究对象，筛选得到抑制效果最好的拮抗细菌 X22，将其鉴定为解淀粉芽孢杆菌（B.amyloliquefaciens）。该菌株具有较好的生防潜力，病原菌与菌悬液同时接种至离体果实，培养 5 d 后防效仍达 98.4%，可用于开发苹果采后病害防治的生防制剂。参 考 文 献1 王利民,刘佳,高建孟.中国苹果空间分布格局及年际动态变化分析J.中国农业信息,2019,31（4）:8493.Wang LM,Liu J,Gao JM.Analysi