放免与单克隆抗体.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,放射免疫分析法Radioimmunoassay，RIA,美国女免疫学家罗莎琳雅洛（Rosalyn S.Yalow），因创立了放射免疫法而荣获1977年诺贝尔生理学及医学奖。,放射免疫,分析,法是利用同位素标记的与未标记的抗原，同抗体发生竞争性抑制反应的方法，研究机体对抗原物质反应的发生、发展和转化规律。,雅洛1921年出生于纽约，1945年获得核物理学博士学位，1975年当选美国科学院院士。因为发明了放射性免疫分析法，雅洛获得1976年的拉斯克基础医学奖，成为历史上第一位获得该奖的女性科学家。次年，她因为与她的合作者贝尔森博士合作开发了“针对多肽类激素的放射性免疫分析法”,，,而成为诺贝尔生理学或医学奖史上第二位女性获奖者。,放射免疫分析法,（又称放射免疫测定或放射免疫测定法，简称放免或放免法）,原理,放射性同位素标记的抗原（简称“标记抗原”Ag*）和非标记抗原（标准抗原或待测抗原Ag）同时与数量有限的特异性抗体Ab之间发生竞争性结合（抗原抗体反应）。,Ag*与Ag的免疫活性完全相同，对特异性Ab具有同样的亲和力。,当Ag*和Ab为数量恒定时，Ag和Ag*的总量大于Ab上的有效结合点时，Ag*-Ab复合物的形成将随着Ag量的增加而减少，而非结合的或游离的Ag*则随着Ag数量的增加而增加（也就是所谓的竞争结合反应），,*Ag-Ab与Ag的含量呈一定的函数关系。因此测定Ag*-Ab或Ag*即可推出Ag的数量。,采用一种有效的分离方法，将*Ag-Ab和Ag-Ab复合物(以 B表示)与*Ag、Ag(以F表示)分离,并测定B和F的放射性,可有以下规律:如样品中Ag增多，则B的放射性降低，F的放射性增高，即Ag与B成反比。计算B/F或B/T值(T=B+F),即可从标准曲线上查出样品中Ag的含量。,抗体：,应用免疫技术可以获得特异性的抗体。抗体的敏感度范,围由其特异性和亲和力决定，测定时所用的抗体稀释度越低，则加入的量越多，测定的敏感度越低，可测范围越宽。如加入抗体量少，则测定的敏感度提高，可测范围变窄。一般在选定标记抗原用量后，即可根据测定要求来选择合适的抗血清用量,。,放射性同位素,：,有3H、125I、131I 等，3H可以置换有机化合物中的氢，且不影响原有化学性质。,*,3H半衰期长，能量低，便于防护，常用的标记化合物有3H环磷酸鸟苷、3H环磷酸腺苷、3H睾丸酮等。,*,125I 和131I原子的化学性质比较活泼,标记方法简便,不论多肽、蛋白质或小分子半抗原均可进行碘标记。,*,有些半抗原不能直接用碘标记,常常接上一个酪氨酸再以碘标记,以减少标记抗原免疫化学活性的损失。,常用的偶联试剂,：碳化二亚胺类,、,烷基氯甲酸酯类、二异氰酸盐类及亚氨酸酯等。,RIA法的特点,优点：灵敏、特异、简便易行、用样量少等，常可测至皮摩尔。本法虽然也用放射性物质，但一般都是在测试样品时再加入标记的同位素示踪物，此示踪物的放射性强度极低，一般不会引起辐射损伤。,缺点：有时会出现交叉反应、假阳性反应，组织样品处理不够迅速，不能灭活降解酶和盐及pH有时会影响结果等。,展望,在本法的基础上，近年来又发展了其他免疫分析法，用其他有特殊性质的物质代替放射性同位素来标记抗原，同样利用标记与未标记抗原与抗体的竞争性结合，然后用适宜方法测定。其中研究较多的是荧光免疫分析，采用荧光化合物标记抗原，结合分离后通过荧光值的测定进行定量分析。,单克隆抗体monoclonalantibody（McAb),1975年英国科学家Kohler和Milstein将产生抗体的淋巴细胞同肿瘤细胞融合,成功的建立了单克隆抗体技术,，,1984年获得诺贝尔医学和生理学奖,。,一，原理,每个B细胞仅识别一种抗原表位，肿瘤细胞在体外培养条件下可无限传代。,二，方法,Kohler和Milstein设计了如下,方法：,杂交瘤技术,1，动物免疫,用特定的外来抗原对动物进行一次或多次免疫,以刺激其能分泌对于该抗原的B淋巴细胞大量增殖,从而得到大量产生专一反应的B淋巴细胞。,2，细胞融合,B淋巴细胞在体外存活时间很短，骨髓瘤细胞不分泌任何免疫球蛋白,却能在体外长期存活。将这两种细胞的特性结合，得到既能分泌抗体又能在体外长期存活的细胞。,杂交过程中会产生混合物,需要筛选出其中唯一有用的杂交瘤细胞,3，,杂交瘤细胞的筛选 用HAT培养基,mAb的优点：,结构单一,纯度高,特异性强,制备成本低,应用,*健康诊断试纸,1早孕检测试纸 绒毛膜促性腺激素,2女性排卵试纸条 促黄体生成激素,3乙肝表面抗原检测试纸条,*抗肿瘤,把一些抗癌药物或放射性同位素附在单克隆抗体上,能命中肿瘤细胞,并且不损伤自身细胞,称为“导弹”疗法或“靶性药物”疗法。,*免疫抑制剂，检测淋巴细胞表面标志等。,