轮状病毒及其胃肠炎研究进展.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,*,轮状病毒及其胃肠炎研究进展,轮状病毒及其胃肠炎研究进展轮状病毒及其胃肠炎研究进展前 言 小儿腹泻病是世界性的公共卫生问题,是引起小儿死亡的主要原因,世界卫生组织把腹泻病的控制列为全球性战略。,轮状病毒（Rotavirus,RV）是小儿腹泻病最常见的病因之一。,1973年 澳大利亚 首次在腹泻病患儿中发现了轮状病毒,我国1978年,云南省979年 腹泻病患儿中发现该病毒,前 言,小儿腹泻病是世界性的公共卫生问题,是引起小儿死亡的主要原因,世界卫生组织把腹泻病的控制列为全球性战略。,轮状病毒（Rotavirus,RV）,是小儿腹泻病最常见的病因之一。,1973年 澳大利亚 首次在腹泻病患儿中发现了轮状病毒,我国1978年,云南省97,9,年 腹泻病患儿中发现该病毒,前 言,婴幼儿轮状病毒（Human Rotavirus,HRV）是引起世界范围内婴幼儿重症腹泻的最主要病因。发达国家和发展中国家20%-70%5岁以下的婴幼儿都感染过轮状病毒,发展中国家每年大约有800,000患儿死于轮状病毒腹泻。,前 言,营养状况对HRV发病危险影响不大,改善卫生条件对轮状病毒的预防并不十分有效。对于HRV引起的腹泻,国内外尚未报道有特效治疗方法。目前,发展HRV疫苗控制HRV腹泻受到一致的重视。,前 言,但轮状病毒流行株呈现多样性,随不同年份、不同地区可有所改变。由此,HRV流行的趋势及,疫苗研究等受到了广泛的关注。,RV的分子结构,HRV流行的趋势,NSP4研究进展,发病机制,治 疗,诊 断,临床表现,轮状病毒及其胃肠炎研究进展,疫苗的研制,免疫机制,一 轮状病毒的分子结构,轮状病毒（Rotavirus）归类于呼肠孤病毒科(Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus),病毒体呈圆球形,有三层衣壳,每层衣壳呈二十面体对称。,内衣壳的壳微粒沿着,病毒体边缘呈放射状,排列，形同车轮辐条。,注：轮状病毒（Rotavirus，,在拉丁语中“Rota”的意思是车轮）,在电镜下呈球形，其直径为65-75nm的20面体。轮状病毒为三层蛋白质衣壳结构，包括核心、内衣壳、外衣壳。由内、外衣壳沿病毒边缘排列，包绕形成典型的车轮辐条结构。,核 心,内衣壳,外衣壳,分子结构,完整病毒大小约7075nm，无外衣壳的粗糙型颗粒为5060nm。具双层衣壳的病毒体有传染性。病毒体的核心为双股RNA，由11个不连续的节段组成。RNA节段平均长度为6603300个碱基对，各编码一种蛋白质，即6种结构蛋白和5种,非结构蛋白。,分子结构,分子结构,6种结构蛋白：,VP1,VP2,VP3,VP4,VP6,VP7,分子结构,5种非结构蛋白,（,non structure protein NSP）：,NSP1,NSP2,NSP3,NSP4,NSP5,分组,感染对象,感染特点,A,人和动物,婴幼儿腹泻的主要病原体,B,人和动物,水源暴发流行,主要感染青壮年,C,人和动物,青少年中偶有流行,D,动物,E,动物,F,动物,G,动物,分子结构,根据病毒主蛋白VP6抗原性的差异，可将轮状病毒分为AG组。,根据病毒糖蛋白,VP4,、,VP7抗原性,的差异,又可将,轮状病毒分为,P血清型和G血清型。,HRV血清型是由病毒外壳蛋白VP4和VP7的抗原性不同区分的。VP7蛋白是由RV基因组的第7、第8或第9基因所编码的病毒外壳蛋白,其分子量为34kD,占毒粒蛋白总量的30%,仅次于VP6蛋白。VP7蛋白是高价免疫血清能检测到的主要中和抗原,因此决定病毒的G血清型,(,因为它是一种糖蛋,白Glycoprotein,),。,分子结构,分子结构,至今根据VP7蛋白中和抗原与高价免疫血清反应的差异发现了14个VP7蛋白血清型（G1-G14）。通过对这14个血清型VP7基因序列的测定及比较分析由这些核苷酸序列推断的氨基酸序列表明：,同一血清型中的不同毒株间,氨基酸的同源性很高,(,91%-100%,);,不同血清型的毒株之间,其VP7蛋白氨基酸序列的同源性则低得多,(,往往低于85%,)。,因此,用中和试验和核酸序列测定方法来确定轮状病毒血清型的相关性是一个比较准确的,方法。,分子结构,VP7蛋白上有9个高变区,在同一血清型毒株之间这些区域高度保守,而不同型别的毒株之间差异较大。根据这一特点利用高变区的序列设计引物进行RT-PCR,再根据PCR产物的不同而判定毒株,的G型别（即VP7基因型）。,分子结构,VP4蛋白由第4基因编码,以棘突形式分布于病毒外壳上,由于VP4蛋白能诱导产生中和抗体,而且这种抗体与VP7蛋白诱导的中和抗体无关,所以近年来又建立了VP4蛋白的血清分型系统（P血清型，,Protease senstive）。,分子结构,近年来,HRV命名工作组,(,Rotavirus Nomenclature Working Group,)将,基因型和血清型之间的不同型别一致起来,建议基因型写在血清型后方,并用括号表示,(,如Wa株为PIA8,),若血清型没有确定,则为P。,分子结构,血清型,基因型,二 婴幼儿轮状病毒流行的趋势,交叉中和试验,14个G血清型,（G1-G14）,20个P血清型,（P1-P20）,感 染 人,10个G血清型:G1.G2.G3.G4.G5.G6.G8.G9.G10.G12,8,个P血清型:P1A.P1B.P2A.P3.P3B.P4.P5.P8,G1-G4是世界范围内婴幼儿腹泻的主要病因,全球不同地区流行病学调查表明：P1A8G1、P1B4G2、P1A8G3、P1A8G4是人类最常见的优势株。但近年轮状病毒流行呈现出新的趋势，即轮状病毒流行呈多样性,(,表现为不同年度流行优势株转变、异常毒株的出现、混合感染比例增加,),和G9型毒株在全球流行。,流行趋势,1,轮状病毒流行的多样性,2 G9型毒株全球流行情况,3,基因突变、基因重配及基因重组在轮状病毒,毒株多样性中的作用,4,轮状病毒血清型与其临床表现和轮状病毒腹,泻暴发流行的关系,流行趋势,（一）轮状病毒流行的多样性,大量轮状病毒流行研究显示：除了在世界范围内流行优势株,(,G1-G4,),外,其它不常见的血清型在不同时区有报道。,此外,在同一地区不同的年,度RV血清型可发生变化。,流行趋势,国家(地区),时间(年),流 行 株,意大利,1981-1992,G1为主（未能分型毒株占,27%,）,1990-1994,P8G4为主,其次为,P8G1,型,西非几内亚,1996-1997,G2P6为主,1998,G1为主，出现了一些不常见的毒株如,P9,、,G3,混合感染较为突出，,16%,不能分型,芬兰,1988-1990,G1到,G4,血清型的转变,日本东京,1991年以前,主要为,G2、,G3,和,G4,1991年以后,G1为主,中国重庆,1998-1999,G1为主,1999-2000,G3为主,孟加拉国,1999,G4为主,其次为,G1,和,G2,混合感染显著。,流行趋势,国家,(地区),时间(年),流 行 株,尼日利亚,1993-1995,南部地区：G3为主，,北部地区：混合感染较为突出,G2,、,G4,、,G8,未检测出。,巴西,1997-1998,P4G2为主,但不常见的毒株,P8G9,、,P6G9,、,P4G9,比例增加。,英国,1995-1999,主要是,P8G1,、,P4G2,、,P8G3,、,P8G4,不常见的毒株出现,P8G2,、,P6G9,、,P8G9,。,阿根廷,1996-1998,出现不常见的,RV,株,G1P4,混合感染较前增多,爱尔兰,1995-1997,主要为,P8G1、,P4G2,、,P8G4,，,P4G4为不常见株，混合感染占,18.8%,。,流行趋势,国家,(地区),时间(年),流 行 株,马拉维,1997.7-1998.1,P6G8为主，2%混合感染，,9%,不能分型。,非洲,1975-,1992,G1为主，未能分型达,26%,，提示出现了除,G1-G4,外的毒株。,美国,1996-,1997,依次为：,P8G1,(,66.,4%)、,P4G2,(,8.,3%)、,P8G3,(,6.,9%)、,P8G4,(,1.,4%),9.,2%为不常见毒株：,P6G9,(,5.,5%)、,P8G9,(,1.,7%)、,P6G1,(,1.,4%)、,P4G1,(,0.,3%)、,P8G2,(,0.,3),5.,5%未能分型,2.,3%为混合感染。,东印度,1998-,2000,出现了不寻常的毒株：,P1G4,、,P8G2,、,P6G2,、,P4G4,、,P6G4,且有,78%,不能分型。,流行趋势,国家,(地区),时间(年),流 行 株,中国,1998-2000,年依次为：,G1,(,占,72.6%,),、G3,(,14.,2,%,),、,G2,(,12.,1%,),、,G4,(,2.,9%,),、,G9,(,0.,9%,),及未能确定其血清型,(,0.,7%,),，除了一些常见的,RV,株,P8G1,、,P4G2,、,P8G3,、,P8G4,外出现了新的,RV,株,P6G9,、,P6G3,、,P6G1,、,P9G1,、,P4G3,、,P4G4,、,P8G2,。,昆明地区,2002-2004,G血清型主要是G3、G1型,2002,以,G1型为主,2003,以,G3型为主,2004,均为,G3型,流行趋势,（二）G9型毒株全球流行情况,自1983年美国在世界范围内首次报道G9型HRV感染人以来,在1992年-1998年期间,在泰国、孟加拉国、马拉维、印度、巴西、意大利、,法国、澳大利亚发现了G9型HRV株。,流行趋势,国家,(地区),时间,(年),流 行 株,日本,1987-1996,G1-G4型,1995起,开始出现,G9,型毒株,泰国,1996-1997,出现,G9,型毒株,有逐年增加的趋势。,加纳,1999,P6G2、,P6G8,为主要的,RV,流行株,但出现了过去不常见的,G9,型毒株,尼日利亚,1998.1-,1999春,流行的,HRV,株为,G9,、,G8,型,而,G2,、,G4,减少,印度,1996-1999,G9型较为流行,可能成为常见的,RV,流行株,韩国,新加坡,1998-1999,G9是首居第一位的血清型，分别具有,52.,9%和,71.,4%的检出率。,流行趋势,目前，世界各地轮状病毒流行研究表明G9型有可能成为第五个常见的流行优势株。,国家(地区),时间,(年),流 行 株,我国,1,994,钱渊等首次报道我国有,1,例,G9,型,HRV,感染腹泻患儿,表明我国可能有,G9,型,HRV,存在。,1999-2000,方肇寅等的研究显示,1999-2000,年,G9,型,HRV,呈显著增长趋势,P-G,结合关系鉴定为,P6G9,(,92%,),和,P8G9,(,8%,),。,流行趋势,轮状病毒基因组为包含11个基因片段的双股RNA（dsRNA），由于其基因片段分节段，故在不同的毒株间易发生,:,基因突变（gene mutation）,基因重配（gene reassortment）,基因重组(gene rearrangement),（三）基因突变、基因重配及基因重组在 轮状病毒毒株多样性中的作用,流行趋势,基因突变,、,基因重配,和,基因重组,被认为是轮状病毒毒株变异性较高的三个重要因素。基因突变通常是引起轮状病毒基因多态性的主要原因。轮状病毒与其它的RNA病毒一样,基因组具有较高的突变率,因为RNA复制中会出现错配,基因突变的结果最终导致进化中的轮状,病毒发生变异。,流行趋势,简单的基因片段插入;,可以改变轮状病毒的表现型;,以基因重配介导的蛋白质的相互作用将会影响其血清型;,将会引起新的轮状病毒抗原的出现。,流行趋势,基因重配在轮状病毒毒株多样性中起了关键性的,作用,尤其是在混合感染的情况下。,基因重组主要也与轮状病毒的演变和新的毒株的出现有关，基因重组将导致RV蛋白质的某一区域结构发生改变，发生改变的蛋白质结构区域可通,过基因突变发挥作用。,流行趋势,研究发现,台湾10年来流行的轮状病毒株的VP1和VP7基因发生了较大变化，他们认为这是轮状病毒株之间基因重配的表现。,流行趋势,研究表明,英国1995-1999年流行毒株呈多样性表现，这主要是流,行度毒株之间发生了基,因重配。,Iturriza,等,Zao,等,巴西,1996年P8G5型毒株的出现是Wa株和猪轮状,病毒株基因重配的结果。,流行趋势,Ramachandran等,研究显示,G9型HRV之间的较,大变化来自基因重组可能大于基因内自然突变积累作用，新发生的G9型HRV可能起源于不同国家，他们通过与当地HRV混合感染基因重组,和基因突变多年积累而产生的。,综上所述，基因突变、基因重配及基因重组在轮状病毒毒株多样性中起到了一定作用，尤其是基因重配。,流行趋势,（四）轮状病毒血清型与其临床表现和 轮状病毒腹泻暴发流行的关系,轮状病毒腹泻的严重程度与轮状病毒血清型的相关性研究一直是一个热点。Bern等及Yolken等人发现感染G2型的患儿的症状比感染其它型别毒株的患儿严重，但并没有对此进行,系统的统计学比较。,流行趋势,对Palermo地区401名急性轮状病毒性肠炎患儿进行了相关研究,结果研究发现电泳短型,(,亚组,),HRV株引起的临床症状要比电泳长型,(,亚组,),HRV株严重,即G2型HRV株引起的临床症状较其它型别严重。,轮状病毒胃肠炎患儿,的临床的严重程度,HRV毒株的毒力,血清型,(G或P型),可能,有关,可能,相关,流行趋势,Cascio等假设,昆明的研究结果发现,电泳长型（亚组）和短型（亚组）对胃肠道的影响有差异，电泳长型RV胃肠炎住院患儿多于短型，电泳长型的症状更为严重。,流行趋势,认为,这主要与新的毒株,(,G2型,),的出现有关，在此10年之前Palermo地区几乎没有发,现G2型毒株，G2型毒株的出现使得Palermo地区,婴幼儿对此毫无免疫力。,越来越多的研究发现新出现的HRV流行株可引起婴幼儿腹泻暴发,其临床症状严重。,流行趋势,Cascio等,报道,1999年在荷兰P6G9型HRV导致一起医院婴幼儿腹泻暴发。此次腹泻暴发持续5个月,临床表现为急性水样便,明显脱水症状。该暴发,提示婴幼儿可能缺乏相应的免疫保护。,流行趋势,Marc-Alain Widdowson等,1998年引发伦敦一家医院暴发腹泻的HRV被鉴定为P6G9株。以往研究表明：引起新生儿隐性感染的轮状病毒无论其VP7型别是1、2、3或是4,其VP4型别都属于P2型,因此认为P2型的轮状病毒是自然减毒株,已考虑用其作为疫苗株,(,代表株为M37,),。,流行趋势,1997年首次报道在北京医院产科母婴同室病房P2型HRV株引发了一起新生儿严重腹泻的暴发流行,18例患儿中5例重度脱水,重症患儿每日大,便湿重可达120-150g。,流行趋势,钱渊等,发现,G3P2毒株可引起少数新生儿较严重的腹泻,核苷酸分析表明：病毒基因在编码VP4、VP7、NSP4等蛋白时出现特殊的氨基酸差异,这些氨基酸差异特别稳定,可影响轮状病毒的毒力,致使新生儿和婴幼儿感染这些毒株后出现,不同的临床表现。,流行趋势,Kirkwood等,的研究,由于无法解释电泳长型,(,亚组,),感染引起的临床症状严重程度的不同,他们推测可能还与HRV毒株本身内在的因素有关,如RV的毒力肽段NSP4有关。,流行趋势,Cascio等,综上所述，轮状病毒腹泻的临床表现的严重程度可能与新出现的轮状病毒血清型有关，尤其是轮状病毒腹泻的暴发流行，但同时可能还与其它的因素有关。总之，轮状病毒血清型及其临床症状的严重程度是否有直接关联需进一步研究。,流行趋势,三 轮状病毒非结构蛋白NSP4研究进展,传统的发病机制认为RV感染后破坏小肠绒毛上皮细胞的绒毛结构,从而引发渗透性腹泻和水、盐分泌及吸收失调性腹泻。然而,腹泻可发生在绒毛脱落之前,这提示早期腹泻与其它的因素相关。,1996年首次提出轮状病毒非结构蛋白NSP4可能是一种肠毒素，并认为NSP4在RV的致病机理有着重要的作用。近年来，NSP4与RV的致病性的研究已成为世界范围内的一个热点。,NSP4研究进展,Ball等,（一）NSP4的分子结构,NSP4蛋白是轮状病毒的一个非结构蛋白,NSP4由RV基因组中的第十基因片段编码,初始产物含175个氨基酸,分子量为20kD,在氨基端糖基化后的分子量为28kD,(,糖基化后成为穿越内质网的穿膜蛋白,),。,NSP4研究进展,NSP4的氨基端含三个疏水表位，两个N型糖基化位点在第一个疏水表位，对这些糖基化的表位的生化合成研究证实，该蛋白具有一个不可切割的信号序列。NSP4的拓扑成像学研究证明，其氨基末端固定在内质网膜内，而其羧基端延伸至感染细胞的细胞浆内。病毒颗粒是通过向内质网膜出芽而成熟,的，而NSP4介导了这一病毒的成熟过程。,NSP4研究进展,证实NSP4是一种跨内质网膜,(,endoplasmic reticulum,ER,),的糖蛋白,其氨基末端固定在内质网膜内,而其羧基端延伸至感染细胞的胞浆内,可作为胞浆中的RV内层颗粒(inner capsid particle,ICP)的细胞内受体,它能通过VP6蛋白结合病毒颗粒ICP,并将这些亚病毒颗粒通过出芽的方,式运至内质网膜内并获得暂时性包膜。,NSP4研究进展,Taylor等的研究,的研究也证实了这一点,同时发现NSP4亲水区第114至135位氨基酸组成的肽段(NSP4,114-135),具有肠毒素活性。,NSP4研究进展,认为NSP4亲水区第114至140位氨基酸,组成的肽段具有肠毒素功能。,Ball等,Zhang等,目前利用缺失突变和单克隆抗体技术已确认了NSP4的两个功能区：一个是ICP结合区，另一个是VP4结合区，分别位于,1,61-175位及132-148位,氨基酸。,NSP4研究进展,NSP4研究进展,OBrien等,Taylor等,采用圆二色谱法也证实该区域存在随机构型,可能与结合ICP有关。,通过有限蛋白水解(limited proteolysis),及质谱分光测定法(mass spectrometry)研究VSA11株NSP4的胞浆区结构,发现C端存在28个氨基酸的蛋白敏感区。,（二）NSP4与RV的致病性,NSP4蛋白质在轮状病毒形态发生中的作用,1,NSP4与Ca,2+,转运在,RV致病中的作用,2,NSP4与Na,+,离子和右旋葡萄糖同向转运在,RV致病中的作用,3,NSP4与宿主细胞之间的作用,4,NSP4基因突变与RV毒力的关系,5,NSP4研究进展,1、NSP4蛋白质在轮状病毒形态发生中的作用,轮状病毒的形态发生是一个独特的过程,细胞质中不成熟的病毒双层颗粒,(,DLPS,),在穿越内质网时,内质网上定位的病毒蛋白NSP4、VP7包装到双层颗粒。,NSP4研究进展,V4结合结构域,结合V4蛋白,V2、V6结合结构域,结合双层颗粒,病毒粒子形成暂时的三层包膜颗粒,进入,内质,网腔,外层的暂时性脂膜和,NSP4蛋白脱落，V4、V7蛋白重排形成三层膜的病毒颗粒,内质网腔,细胞质内,NSP4研究进展,VP7蛋白表达的阻遏，不影响病毒蛋白的表达和分配，但病毒颗粒积累在内质网腔中，不能形成完整的病毒粒子。,用RNAi技术,沉寂了NSP4或VP7蛋白的表达,使子代病毒颗粒数目减少了75%80%,Tomas等,NSP4蛋白表达的阻遏影响了病毒蛋白在细胞内的表达和病毒蛋白在细胞中的定位，从而使病毒双层颗粒或三层颗粒很少形成。,NSP4蛋白质是一个内质网定位,蛋白，作为双层颗粒（DLPS）,受体，驱动DLPS进入内质网,VP7使病毒颗粒脱去暂时性的包膜，,形成完整的三层包膜病毒粒子,推 测,推 测,NSP4研究进展,RV形态成熟的过程,及对细胞的溶解作用,RV侵入细胞,2、NSP4与Ca,2+,转运在,RV致病中的作用,钙离子（Ca,2+,）在RV的复制和致病中发挥着重要的作用。,病毒转录的激活,病毒颗粒的释放,Ca,2+,参与,NSP4研究进展,在细胞外介质中，Ca,2+,对RV外壳蛋白结构具有稳定作用,当病毒侵入细胞后,细胞内较低的Ca,2+,浓度即可使病毒外衣壳蛋白发生溶解及转录酶激活。RV蛋白的合成对Ca,2+,的稳态具有调节作用,而Ca,2+,的稳态则可促进RV形态的成熟,同时在诱导细胞死亡中也起了一定的作用。,NSP4研究进展,NSP4与Ca,2+,转运的研究最早开始于90年代初。,NSP4研究进展,Tian等,在昆虫细胞中表达NSP4的研究中发现,NSP4除了对细胞具有细胞毒作用外，,还可升高细胞内Ca,2+,（Ca,2+,i）浓度。,Tian等对此现象进一步的研究：用纯化的NSP4作用于昆虫细胞表面时,细胞内的Ca,2+,浓度显著升高,且这种调节作用可被磷酯酶C,(,phospholipase C,PLC,),抑制剂所阻断,但未对此现象的产生机制进行深入的阐述,故在当时NSP4对Ca,2+,转运的作用未引起人们的关注。,NSP4研究进展,1996年Ball等在NSP4引发新生鼠腹泻的研究中首次提出了NSP4对Ca,2+,转运的调节作用的机理：NSP4是通过启动一个信号转导途径引起细胞内钙离子浓度升高,Cl,-,离子分泌增加,最终产生腹泻。继此之后的大量相关研究一致认为NSP4通过信号转导途径调节Ca,2+,转运。,NSP4研究进展,Ball等,1nmol的外源性NSP4即可使钙离子从细胞内钙库释放并伴随细胞外Ca,2+,内流进入细胞,从而使细胞内Ca,2+,浓度升高。当NSP4的量为4.60.8nmol时,NSP4对钙离子转运的调节作用最强,这提示NSP4对钙离子转运的调节作用与剂量大小有关。,NSP4研究进展,Dong等的研究显示,然而,细胞内钙离子升高的同时,Na,+,离子的浓度不受影响,表明NSP4是选择性的使细胞外钙离子进入细胞。若先用磷酯酶C的抑制剂、胰蛋白酶或糜蛋白酶作用于RV感染的细胞,NSP4升高细胞内Ca,2+,浓度的作用被中和。此外,NSP4能快速导致1,4,5-三磷酸肌醇（1,4,5-IP3）短暂升高。,NSP4研究进展,由此，Dong等认为是通过激活磷酯酶C和增加IP3的生成这一信号转导途径来调节Ca,2+,转运，而且细胞外无钙离子溶液对NSP4反应无明显影响，因此细胞内钙离子浓度升高主要为细胞内钙库释放造成。,NSP4研究进展,增加内质网膜的基础通透性,关于内源性NSP4对钙离子转运的调节作用，各研究组一致认为内源性NSP4是通过增加内质网膜的基础通透性而使细胞内Ca,2+,浓度升高。,激活磷酯酶C和增加IP3的生成,细胞内钙库释放,Ca,2+,浓度,选择性的使细胞外钙离子进入细胞,外源性,NSP4,内源性,NSP4,NSP4研究进展,3、NSP4与Na,+,离子和右旋葡萄糖同向转运在,RV致病中的作用,有关NSP4与Na,+,离子转运的相关研究甚少,且部分研究一致认为NSP4对Na,+,离子转运无影响。最近Halaihel等在体外实验中首次发现NSP4对兔肠道上皮细胞刷状缘膜上的Na,+,离子和右旋葡萄糖同向转运,(,Na+-D-glucose symporter,SGLT1,),有抑制作用。,NSP4研究进展,而且该抑制作用具有特异性和非竞争性。在Na,+,离子和右旋葡萄糖转运单位上有三个与NSP4肽段结合的位点。Halaihel的发现提示体内RV感染的过程中,NSP4有可能同样对SGLT1产生抑制作用，,从而导致水的重吸收障碍,NSP4研究进展,由此推测NSP4对SGLT1的抑制在RV感染所致腹泻的发病机理中起了一定的作用。该研究是RV发病机制的又一突破,但目前仍无定论,尚需进一步研究。,NSP4研究进展,4、NSP4与宿主细胞之间的作用,RV感染的过程是RV与宿主细胞相互作用的复杂过程。Tian等最早注意到NSP4对细胞膜具有破坏作用。Newton等在猴肾上皮细胞中表达重组RV疫苗株NSP4时也发现肾上皮细胞的胞浆膜的完整性受到损害及细胞的超微结构变化提示细胞死亡,且NSP4对肾上皮细胞的细胞毒作用与其剂量有关。,NSP4研究进展,发现纯化的NSP4或NSP4,114-135,肽段可改变肠上皮细胞的细胞膜的形态，且NSP4的第114位氨基酸至135位氨基酸是与细胞膜结合的功能区域。NSP4与细胞膜的结合具有选择性，即NSP4仅与弯曲度较大而面积较小的单层囊泡膜发生作用，却不与弯曲度较小而面积较大的单层囊,泡膜发生作用。,NSP4研究进展,Huang等,在大肠杆菌中表达NSP4时发现NSP4对细菌的细胞膜有破坏作用,进一步研究发现NSP4第48位氨基酸至91位氨基酸残基组成的肽段与膜的去稳定状态密切相关,他们推测这可能与该肽段具有带负电荷的两歧性分子的螺旋结构有关，,NSP4研究进展,Browne等,NSP4分子结构中的双螺旋低聚体化区域及NSP4,114-135,肽段对膜的稳定状态无直接作用,但可以提高NSP4,48-91,肽段对膜的破坏作用。该研究结果提示NSP4在膜的去稳定状态中起着关键的作用及NSP4对哺乳类动物细胞可能具有细胞毒作用。,NSP4研究进展,对NSP4与极化的上皮细胞,(,MDCK-1细胞,),之间的相互作用进行了研究：当NSP4作用于上皮细胞的顶端而非基底侧时，可降低跨上皮电阻及重新分布丝状肌动蛋白，同时增大细胞间隙的通透性；并发现将1nmol的NSP4与极化的上皮细胞温育20-30h后，跨上皮电阻大幅度降低，当去除NSP4后，上皮组织恢复了它的完整性和跨,上皮电阻。,NSP4研究进展,Tafazoli等,此外NSP4在上皮细胞紧密连接过程中阻止其相关蛋白ZO-1锚定,因而影响细胞紧密连接和极化上皮形成。由此可见，NSP4可特异性地破坏上皮细胞的细胞膜及细胞间的紧密连接,导致上皮细胞的完整性受到损害及细胞通透性改变。,NSP4研究进展,5、NSP4基因突变与RV毒力的关系,NSP4基因易突变,而NSP4与RV的毒力密切相关,由此,NSP4基因的突变将可能导致RV株的减毒。基于这一假设,加之RV无症状感染的现象引起人们的重视及轮状病毒疫苗的开发,许多学者对此进行了大量的研究,但各研究报道不一致。最早Hoshino等在RV感染猪的模型研究中发现了RV,的毒力与NSP4基因突变有关。,NSP4研究进展,经在猴肾细胞传代的减毒HRV89-12株与未传代的毒株之间只有一个碱基发生变化,导致NSP4 45位处的丙氨酸变为苏氨酸。由于无症状型和有症状型HRV株该位点处这两种氨基酸都存在,不能作为毒力标记,因而认为89-,12RV疫苗株的减毒与NSP4基因突变或NSP4的氨基酸序列变异无关。,NSP4研究进展,Ward等的研究显示：,对猪OSU株和Gottfrid株的毒力株及减毒株的NSP4氨基酸序列作了比较,提示NSP4的第131位-140位氨基酸的变异与RV的毒力至关重要,进而用杆状病毒表达系统分别表达毒力株OSU,(,OSU-v,),和减毒株OSU,(,OSU-a,),的NSP4,并进行比较。,NSP4研究进展,Zhang等,若OSU-V株NSP4第130位处的脯氨酸由OSU-a株NSP4该位点上的丝氨酸取代,则OSU-v株的NSP4失了原有致新生鼠腹泻能力。Zhang等认为NSP4导致腹泻的作用可能与NSP4的第114位至140位氨基酸残基组成的肽段的C端结构有关,而不是特定,位点上的氨基酸变化,NSP4研究进展,由此推测：只有当NSP4 的114位至140位处氨基酸的变异引起NSP4的分子结构发生改变时,NSP4的生物学活性才会受到影响,从而影响RV株的毒力。,NSP4研究进展,对HRV Wa株,(,Wa-v株,Wa-a株,),、M株,(,M-v，M-a,),及C组轮状病毒Cowden株,(,Cowden-v株,Cowden-a株,),的NSP4基因进行测序,并比较其对应的NSP4的氨基酸序列。,NSP4研究进展,Chang等,其研究结果显示：,故认为RV株毒力与NSP4基因突变所致的NSP4氨基酸变异存在一定关系。,HRV,NSP4氨基酸序列变异处,Wa-v株与Wa-a株,13，16，34位氨基酸处,M-v株与M-a株,53，104位氨基酸处,Cowden-v株与Cowden-a 株,50，97位氨基酸处,NSP4研究进展,发现用标准株SA11株建立的NSP4的cDNA1文库与随机获得的SA11株的NSP4的cDNA2文库之间有差异,即cDNA1文库中NSP4第47位处的天冬酰胺,(,Asn,),被cDNA2文库中NSP4,该位点上的组氨酸,(,His,),所代替。,NSP4研究进展,Tian等,进一步的研究发现NSP4-Asn和NSP4-His对钙离子转运的调节有差异,NSP4-Asn对钙离子转运的调节及细胞毒作用较NSP4-His更强。但Lee等认为无症状型和有症状型RV株的NSP4基因无差异,提示RV减毒与NSP4基因突变无关。,NSP4研究进展,对,南非地区新生儿病房中RV流行株G4P6,(,G4P6-v,G4P6-a,),的NSP4基因的核苷酸和对应的氨基酸序列进行比较,发现NSP4氨基酸序列有四处变异,(,82、114、138、169位氨基酸处,),同时也发现两种RV株的VP8*、VP7蛋白的氨基酸序列也有改变,提示RV毒力不仅与NSP4有关,可,能还与VP8*和VP7有关。,NSP4研究进展,Pager等,2002年至2004年中的轮状病毒阳性标本中选取30份标本扩增出NSP4cDNA500bp送测序,结果显示差异为第76位,137位和139位氨基酸变异位点集中在V-I,R-S,V-I,并用MEGA软件进行分析,结果显示NSP4变异同临床流行症状相关性不大,庞伟等人做的动物研究中证实并未发现NSP4的变异同致,病毒力有明显关系。,NSP4研究进展,NSP4变异与地域及VP7血清型无关,不能够根据VP7的血清型来推测NSP4的基因型。NSP4基因变异与轮状病毒腹泻临床症状严重程度不相关。,NSP4研究进展,目前没有研究证实NSP4特定位点的氨基酸突变与RV毒力的直接关系,NSP4与RV致病性有关的结构域尚未完全阐述清楚。以上的研究报道不一致,这可能与各研究中所采用的动物模型有关。,NSP4研究进展,此外,以上研究都仅局限于同一年龄段患儿RV无症状感染株和有症状感染株的NSP4基因的变异,而未对不同年龄段患儿RV无症状感染株NSP4基因的变异,尤其是对新生儿RV无症状感染株和年长儿无症状感染株的NSP4基因变异进行深入研究,推测以后在该领域将会有新的研究突破。,NSP4研究进展,四 轮状病毒感染的发病机制,轮状病毒感染的发病机制目前仍不十分明确,但是通过对轮状病毒感染动物模型的实验研究,为我们认识轮状病毒的作用机理提供了一定线索。,轮状病毒感染任何动物依赖于,宿主,和,病毒,两方面的因素。,轮状病毒感染宿主后以在小肠粘膜上皮细胞复制为特点,病理学改变表现为,:,绒毛变短萎缩,细胞溶解,固有层单核细胞浸润,内质网池膨胀,线粒体肿胀等。,这些组织病理学改变发生在感染后24,-,36小时。,发病机制,早期研究认为,肠上皮细胞的破坏引起的吸收功能不良直接导致腹泻的发生。随着研究的深入,有资料表明肠上皮细胞破坏后继发的吸收功能不良,尚不足以完全解释腹泻的进展,因为在对一些动物的研究发现,腹泻可以发生在肠粘膜发,生病理改变之前；,发病机制,并且在一些感染异源性轮状病毒的新生鼠中发现,这些鼠发生了腹泻,但肠粘膜组织结构没有明显变化；研究人员还发现给轮状病毒感染的幼猪口服,表皮生长因子对腹泻的病程没有明显作用。,发病机制,随着细胞分子水平研究的发展,病毒的蛋白质结构、毒力、致病性等方面的作用开始受到人们的关注。,VP4和VP7作为轮状病毒结构蛋白,在维持病毒的稳定性方面发挥着重要作用,VP4对于病毒吸附和进入上皮细胞非常重要。,发病机制,NSP1、NSP2可能与轮状病毒的复制有关,但具体功能尚未阐明。,NSP4作为轮状病毒非结构蛋白在作用机制方面成为研究的热点。,发病机制,研究已发现NSP4作为一种细胞内受体在病毒装配过程中,介导病毒颗粒进入内质网时获得瞬时包膜,同时NSP4刺激内质网贮存池释放钙离子,(,Ca,2+,),并且维持这一作用过程。更有研究表明NSP4作为轮状病毒诱导产生的肠毒素,在感染后24小时可能通过细胞溶解从感染的细胞中释放出来，,发病机制,一方面激活细胞内的Ca,2+,，Ca,2+,浓度的升高通过磷脂酶C的信号传导，产生氯离子的跨膜转运及酶转运的激活，促进肠腔内液体的分泌及吸收的减少，从而产生腹泻；,另一方面通过改变细胞内肌动蛋白的分布和细胞内连接进一步加重腹泻。,发病机制,NSP4致腹泻的方式与一些细菌毒素相似，不引起组织学改变，只影响肠道的分泌功能。给鼠注射纯化NSP4,114135,氨基酸残基组成的肽段可致幼鼠腹泻，证实了NSP4在腹泻发生中的重要作用。,发病机制,除了腹泻早期NSP4对粘膜的直接作用外,已有研究表明肠袢神经系统直接参与了腹泻的进展。固有的宿主介导的防御机制,可以通过病毒复制或NSP4诱导的Ca,2+,活化进一步激活,从而维持,腹泻的进展。,发病机制,在幼鼠感染48,-,60小时后,局部肠粘膜可以发现典型的反应性充血的病理变化：组织水肿、血管扩张,这可能与肠袢系统粘膜神经反射的激活有关。另有数据显示66%轮状病毒诱导的肠腔液体分泌是,通过肠神经系统分泌介导的。,发病机制,目前对于轮状病毒感染后，NSP4与肠袢神经系统激活以及释放神经活性物质之间是否存在联系等问题,在细胞水平上仍亟待解决,有待于进一步深入研究。,发病机制,五 轮状病毒感染与免疫机制,轮状病毒感染人体后的免疫机制目前尚未阐明。尽管轮状病毒感染动物模型与人体有一定不同,但是对这些模型的研究能为我们提供一些轮状病毒介导的机体免疫反应的线索。感染轮状病毒后,宿,主的免疫反应包括：,体液免疫 细胞免疫 粘膜免疫,对鼠模型研究发现在轮状病毒感染后,可以在小肠周围组织如：集合淋巴结、肠系膜淋巴结中发现轮状病毒,在这些部位最先出现的是大量不依赖于T细胞的B细胞。,免疫机制,Sarah等,在感染后四天，最先出现轮状病毒特异性IgM，而IgA在感染后10天排毒近乎停止时才出现。对人及兔的研究也发现，轮状病毒特异性 IgM在轮状病毒感染后早期先升高,(,感染后7天内,),随后逐,渐下降,此时IgA、IgG水平才开始升高。,免疫机制,研究了IgA敲除幼鼠也发现，这类幼鼠与IgA正常幼鼠相比，清除轮状病毒的能力无明显差异，这可能通过代偿性地增强轮状病毒特异性IgM、IgG亚群生成有关。,免疫机制,Neal等,这些都提示了轮状病毒感染早期肠粘膜表面B淋巴细胞介导了重要的免疫反应，轮状病毒特异性IgA对于感染早期轮状病毒清除作用不大。对儿童感染轮状病毒研究显示轮状病毒特异性IgA 在,预防再次感染方面具有重要作用。,免疫机制,免疫机制,Velazquez等,动态研究了200例墨西哥从出生至2岁儿童的血清轮状病毒 IgA、IgG水平,结果显示,:,血清中抗轮状病毒 IgA滴度1,:,800时,婴儿感染轮状病毒和发生相关性腹泻的危险性均较低；,IgG滴度1,:,6400时其感染轮状病毒的危险明显较低,但无抗腹泻作用。,研究表明轮状病毒特异性IgA可以作为预防轮状病毒感染及发生腹泻的免疫标志。,CD8,+,细胞的效应器功能和CD4,+,细胞的细胞毒T细胞,在动物模型中已证实参与轮状病毒清除及再感染的免疫保护作用。,免疫机制,牛感染轮状病毒后,小肠粘膜淋巴细胞亚群数目增