分子免疫学免疫球蛋白.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,免疫球蛋白,温州医学院微生物学教研室,张丽芳,分子免疫学免疫球蛋白,第1页,免疫球蛋白,抗体,发觉及特征,免疫球蛋白分子,结构,免疫球蛋白分子,功效,抗体,异质性,免疫球蛋白基因,遗传控制,抗体,制备,思索题,分子免疫学免疫球蛋白,第2页,抗体发觉及特征,1890年,，Behring发觉抗毒素,40年代,，Tiselius 和 Kabat,采取电泳技术研究抗体,1968年,WHO决定,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第3页,1890年，Behring发觉,白喉外毒素 动物（发病）提取血清,注射另外动物 血清+毒素,动物不发病 动物不发病,说明：血清中存在一个能中和毒素部分：,抗毒素（抗体Antibody，Ab）,刺激机体产生抗体物质：,抗原（Antigen，Ag）,白喉外毒素,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第4页,40年代，Tiselius 和 Kabat,分子免疫学免疫球蛋白,第5页,当初认为：抗体就是球蛋白 （丙球），丙球就是抗体。,以后发觉：抗体大部分局限在区，少部分延伸至其它区。,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第6页,1968年,WHO,决定,将含有抗体活性或化学结构与抗体相同,球蛋白统称为-,免疫球蛋白,（Immunoglobulin，Ig）,分泌型：血清抗体 膜型：B细胞膜上抗原受体,将机体受抗原刺激后出现能与抗原发生,特异性结合，具活性球蛋白-,抗体 （Antibody，Ab）,抗体是Ig，而Ig并非都是抗体,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第7页,二.免疫球蛋白分子结构,基本结构,立体结构,功效区,其它成份,水解片段,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第8页,（一）基本结构,组成,命名,分区,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第9页,组 成,由一对较长和一对较短多肽链组成,四条多肽链,长链,：,重链,（,Heavy Chain,，,H链,），,450-550 aa，55-57 KD,短链,：,轻链,（,Light Chain,，,L链,），,214 aa，24 KD,二硫键：H链和L链之间，两条H链之间,由,二硫键,连接，呈Y型,分子免疫学免疫球蛋白,第10页,Back,N端,C端,分子免疫学免疫球蛋白,第11页,命 名,H链,：,分五类,、链 IgD、IgM、IgG、IgE、IgA,L链,：,分两型 型和型,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第12页,分 区,N端：aa序列改变（110个残基）C端：则相对稳定（1）可变区（Variable region，V区）,近N端：V区=1/2 L链+1/4（1/5）H链 ,（2）恒定区（Constant region，C区）,近C端：C区=1/2 L链+3/4（4/5）H链 ,（3）铰链区,分子免疫学免疫球蛋白,第13页,分子免疫学免疫球蛋白,第14页,分子免疫学免疫球蛋白,第15页,高变区（hypervariable regio，HVR）,可变区中一些区域aa组成和排列尤其,易改变或具更高变易性。VL 28-35 49-56 91-98VH 29-31 49-58 95-102 HVR1 HVR2 HVR3 CDR1 CDR2 CDR3,CDR（互补决定区）：,Ig抗原结合部位和抗原 表位互补结合部位，决定抗体特异性。,可变区,分子免疫学免疫球蛋白,第16页,分子免疫学免疫球蛋白,第17页,分子免疫学免疫球蛋白,第18页,铰链区,位于CH1和CH2之间，富含脯aa，,富有弹性，可自由折叠 意义：能使V区与不一样距离抗原结合 补体结合位点易于暴露 IgM和IgE无铰链区,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第19页,立体结构,分子免疫学免疫球蛋白,第20页,分子免疫学免疫球蛋白,第21页,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第22页,Ig 功效区,L链：VL、CL,H链：IgG、IgA、IgD：VH、CH1、CH2、CH3 IgM、IgE：VH、CH1、CH2、CH3、CH4,分子免疫学免疫球蛋白,第23页,分子免疫学免疫球蛋白,第24页,功效区作用,VL、VH：抗原结合部位 HVR（CDR）与抗原表位结合 CH1、CL：遗传标志所在 IgG-CH2：补体结合位点，经过胎盘部位 CH3：与各种组织表面IgG Fc受体,（FcR）结合部位IgM：CH3：补体结合位点IgE：CH2、CH3：与肥大细胞、嗜碱性 粒细胞 （IgEFc受体FcR）结合部位,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第25页,Ig其它片段,J链（Joining Chain）,：,连接两个或两个以上Ig单体作用 SIgA：二聚体 IgM：五聚体,分泌片SP（Secretory Piece）,：,是SIgA上 一个辅助成份 上皮细胞合成，分泌到黏膜细胞表面 作用：具抵抗外分比液中蛋白水解酶 降解作用，稳定SIgA作用。,分子免疫学免疫球蛋白,第26页,分子免疫学免疫球蛋白,第27页,分子免疫学免疫球蛋白,第28页,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第29页,水解片段,木瓜蛋白酶 IgG 2Fab段 +Fc段 （抗原结合片段）（可结晶片段）,胃蛋白酶 IgG F（ab）,2,段 +pFc段 （抗原结合片段）碎片意义：F（ab）,2,段保持了与抗原结合生物学活性，,又降低了 Fc段生物学活性。可应用于生物,制品研究，如精巧抗毒素等。,分子免疫学免疫球蛋白,第30页,分子免疫学免疫球蛋白,第31页,分子免疫学免疫球蛋白,第32页,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第33页,三免疫球蛋白生物学特征,特异性,结合抗原,：,活化补体：IgM，IgG1，IgG2，IgG3-经典路径 凝聚IgA，IgG4，IgE -旁路路径,结合,Fc受体,：,Ig +Ag Ig Fc段活化,与细胞表面Fc受体结合,经过胎盘,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第34页,与Ag结合含有高度特异性，必须是超变区与抗原空间构象完全吻合。,与抗原结合后，可介导体内各种生理和病理效应（中和病毒、毒素，介导炎症反应），体外可产生凝集、沉淀现象用于检测等,Back,特异性结合抗原,分子免疫学免疫球蛋白,第35页,结合Fc受体,介导,I型超敏反应,调理,吞噬作用,发挥,ADCC作用,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第36页,介导I型超敏反应,：,IgE因为其Fc段结构特异性，,可在游离情况下与对应Fc受体结合,肥大细胞 IgEFcR,嗜硷性粒细胞一旦Ag与IgE结合，触发细胞脱颗粒，产生I型超敏反应。,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第37页,调理吞噬作用：抗原与抗体结合后，能增强吞噬细胞吞噬活性,。,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第38页,发挥ADCC作用,靶细胞抗原+IgG,IgGFc段活化,+,FcR,中性粒细胞，单核细胞，M，NK,发挥对靶细胞直接杀伤作用,分子免疫学免疫球蛋白,第39页,分子免疫学免疫球蛋白,第40页,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第41页,经过胎盘,IgG：唯一经过胎盘免疫球蛋白 母体IgG CH2 滋养层细胞内吞 主动外排 胎儿体内吞噬囊泡中有IgGFc受体而无其它Ig受体，且IgG与FcR结合后得以防止被酶水解,分子免疫学免疫球蛋白,第42页,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第43页,三.抗体,异质性,抗原A/B-机体-抗体A/B,(识别不一样抗原),Ig可变区（CDR）差异,抗原A-机体-抗体A（IgM/IgG）,（识别同一抗原）,Ig恒定区差异,抗体异质性抗体分子多样性,分子免疫学免疫球蛋白,第44页,抗体恒定区异质性,Ig 类型,抗体异质性产生原因,外源性Ig,多样性,内源性Ig,血清型,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第45页,1）类与亚类：类：IgG、IgM、IgA、IgD、IgE 亚类：IgA：IgA1、IgA2（1、2）IgG：IgG1IgG4（1、4）,还未发觉 IgM，IgD，IgE有不一样亚类,2）型与亚型：型：和，：=2：1（人）亚型：1-4 四个亚型,Ig 类型,分子免疫学免疫球蛋白,第46页,Ig,多样性,自然界各种不一样抗原（表位）诱导,机体产生各种不一样特异性抗体,同一个抗原（表位）诱导机体产生特,异性相同、类型不一样抗体,分子免疫学免疫球蛋白,第47页,Ig,血清型,Ig含有双重性：,与对应抗原发生特异性结合抗体特征,可诱导机体产生特异性抗体抗原特征,类型：,同种型,、,同种异型,、,独特型,分子免疫学免疫球蛋白,第48页,Back,同种型（Isotype）,存在同种抗体分子中抗原表位,同一个属全部个体Ig分子共有抗原特异性标志,具种属特异性，为种属型标志，存在IgC区,。,分子免疫学免疫球蛋白,第49页,同种异型（Allotype）,同一个属不一样个体间Ig分子所含有不一样抗原特异性，因而可在同种异体间诱导免疫反应。,为个体型标志，存在IgC区、V区。,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第50页,独特型（Idiotype，Id）,同一个体不一样抗体形成细胞所产生Ig分子V 区抗原性不一样（CDR 序列）。,A1 B1 Ab1 A2 机体 B2 Ab2（HVR序列）A3 B3 Ab3 B4 Ab4（抗-Ab1）,B5 Ab5（抗-Ab2）,B6 Ab6（抗-Ab3）,独特型抗原表位（Id）-抗独特型抗体（AId）,分子免疫学免疫球蛋白,第51页,Back,独特型表位独特位，存在IgV区,分子免疫学免疫球蛋白,第52页,五免疫球蛋白基因遗传控制,Ig基因,定位和基因库,Ig基因片段,重排,Ig基因,多样性,Ig基因,生物合成,Ig,类型转化,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第53页,Ig基因定位,免疫球蛋白基因定位,编码肽链 基因符号 基因定位（人）,H 链 IGH 第14号,链 IG 第 6 号,链 IG 第16号,分子免疫学免疫球蛋白,第54页,基因库,H链：,VH：V,H,，D,H,，J,H,（可变区基因、多样性基因、连接基因）,CH：5-C-C-C,3,-C,1,-C,1,-C,2,-C,4,-C-C,2,-3,L链：链：V，J C 链：V,J -C （JC两群基因并不分开）,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第55页,人类H链基因重排,V区,：,V,H：,功效基因片段约51个，编码靠N段,CDR1，CDR2和3个骨架区（FR1-3）,D,H,：,功效基因片段约30个，编码CDR3,J,H：,功效基因片段约6个，编码FR4,基因重排：首先 D与J基因连接形成D-J基因，,然后与V基因连接形成V-D-J基因,C区,：经过RNA剪接来实现Ig类型转化,FR3,FR2,FR1,FR4,CDR1,CDR2,CDR3,分子免疫学免疫球蛋白,第56页,人类L 链基因重排,VL 编码CDR1，CDR2区,JL 编码CDR3区,CL 编码恒定区,链：V：,功效基因片段50个,J：,功效基因片段5个,C:,功效基因片段1个,链：V：50-100个基因片段,J -C：基因不可分，有4个基因组,链重排失败，再进行链重排,FR3,FR2,FR1,FR4,CDR1,CDR2,CDR3,分子免疫学免疫球蛋白,第57页,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第58页,基因重排,分子免疫学免疫球蛋白,第59页,分子免疫学免疫球蛋白,第60页,L V,H,C,m,1.胚系基因,2.基因重排,3.重排基因,4.RNA转录本,5.mRNA剪切,6.成熟mRNA,7.Ig,m,前体多肽,V,1,V,2,V,3,Vn,D,1,D,2,D,3,Dn,J,1,J,2,J,3,J,4,C,m,C,d,C,g,C,e,C,a,V,1,V,2,D,2,J,3,J,4,C,m,C,d,C,g,C,e,C,a,V,1,V,2,D,2,J,3,J,4,C,m,C,d,C,g,C,e,C,a,V,2,D,2,J,3,J,4,C,m,C,d,V,2,D,2,J,3,C,m,C,d,V,2,D,2,J,3,C,d,C,m,J,4,J,4,V,2,D,2,J,3,C,m,V,2,D,2,J,3,C,d,L V,H,C,d,Ig 重 链 基 因 重 排,分子免疫学免疫球蛋白,第61页,日本-利根川,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第62页,Ig基因多样性形成机制,组合,造成多样性,连接,造成多样性,体细胞高频,突变,造成多样性,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第63页,组合造成多样性（combinatorial diversity）,众多V区基因片段组合和轻重链组合，众多V、D、J基因中，重排时每个片段只能取一个，就存在各种组合。,VH：51个基因片段，编码CDR1、CDR2部分aa DH：30个基因片段，编码CDR3中大部分aa,JH：6个基因片段，编码其余CDR3部分 aa,和第 四个骨架区,VH链：51 x 30 x 6=9180 种,V：50个基因片段 J：5个基因片段,V链：50 X 5=250 种,V：30个基因片段 J：4个基因片段,V链：30 X 4=120 种,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第64页,连接造成多样性,(junctional diversity),CDR3区位于V、J和V、D、J片段连接处，两片段之间可插入或丢失数个核苷酸，增加了互补决定区（CDR3）,多样性,。,N-氨基酸,插入,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第65页,V、D、J片段连接多样性,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第66页,N-氨基酸插入,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第67页,体细胞高频突变造成多样性(somatic hypermutation),成熟B 细胞重排V区基因，往往在抗原刺激下发生点突变，突变频率非常高（每次细胞分裂，大约每1000个bp中就有一对发生突变，而其它体细胞突变频率为10,-10,bp。）。,称为体细胞高频突变。,有些人计算多样性可达4.8 X 10,7,，故针对外界众多抗原分子，体内可产生数以亿计不一样抗体分子。,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第68页,免疫球蛋白生物合成,Ig主要由脾、淋巴结和其它淋巴组织内桨细胞所产生。重链和轻链分别合成，然后装配。,Ig合成过程：转录、mRNA剪切、合成重链和轻链；在粗面内织网装配四肽链；转运、加糖基、分泌胞外。,B细胞在抗原刺激后，最初只合成IgM，,后合成IgG。,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第69页,免疫球蛋白类型转换,指一个B细胞克隆在分化过程中V区基因不变，而CH基因片段不停发生重排，即识别抗原特异性不变，但Ig分子类和亚类发生改变。Ag 机体 B细胞 先IgM（VDJC）后IgG（VDJC）V区：V-D-J基因不变，识别抗体能力不变 C区：C转换为C，从IgM-IgG,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第70页,六抗体制备,1.,多克隆,抗体（Polyclonal antibody,PAb）,第一代 抗体,2.,单克隆,抗体（Monoclonal antibody，McAb）,第二代抗体,3.,基因工程抗体,（gentic engineering antibody,）,第三代抗体,分子免疫学免疫球蛋白,第71页,多克隆抗体,1 2 B1 Ab1 3 机体 B2 Ab2 B3 Ab3 蛋白质抗原 各种抗体混合物 存在于血清与体液中,由含各种抗原表位抗原刺激机体产生免疫,血清，含各种抗体混合物，称多克隆抗体。,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第72页,单克隆抗体（McAb）,由识别一个抗原表位B细胞克隆所产生均,一抗体。特点：纯度高，特异性强。,两位科学家在1975年首创杂交瘤技术制造 McAb，并于1985年获诺贝尔奖。,1974年，Koehler在Milstein位于剑桥试验开始博士后研究，两人为研究抗体多样性，反抗体形成细胞与骨髓瘤细胞进行融合试验。,分子免疫学免疫球蛋白,第73页,原 理,小鼠骨髓瘤细胞（浆细胞瘤细胞）能在体外无限,制增殖和分泌无活性Ig（单一）。小鼠脾细胞（富含B细胞）含有产生特异性抗体,能力，但不能无限制繁殖传代。采取融合剂将两种细胞融合成杂交瘤细胞，含有,亲代双方特征：,即能人工培养使之无限止繁殖，又可产生特异性抗体。,因为每一个B细胞克隆只针对一个抗原表位，产生,相对应抗体，经过筛选单个外细胞，在体外增殖,而形成细胞克隆只产生完全均一（类、亚类、,型等）单一特异性Ab，即McAb。,分子免疫学免疫球蛋白,第74页,抗原免疫小鼠脾细胞,小鼠骨髓瘤细胞,（产生抗体,，,（不含 HGPRT和TK,体外不能长久存活）体外能长久存活）,混合后加,融合剂,（PEG或仙台病毒等）,HAT培养基中培养,次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷（T）,为合成核酸原料，氨基喋呤（A）能,阻止正常合成核酸路径,未融合脾细胞或 未融合瘤细胞或,杂交瘤细胞,自相融合脾细胞 自相融合瘤细胞,（死亡）（死亡）,（存活）,分子免疫学免疫球蛋白,第75页,分子免疫学免疫球蛋白,第76页,分子免疫学免疫球蛋白,第77页,应 用,单克隆抗体因为纯度高、效价高、特异性强，广泛应用于诊疗、治疗、研究。,但当前临床应用均为鼠原性McAb，对人来说是异物，含有抗原性，从而限制了体内应用，尤其是抗体导向治疗肿瘤方法。因而，有了第三代Ab，即基因工程抗体,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第78页,基因工程抗体,概念,嵌合抗体,：第一代基因工程抗体,改型,抗体：第二代基因工程抗体,小分子抗体,：第三代基因工程抗体,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第79页,基因工程抗体概念,依据研究者意图，在基因水平对Ig分子进行切割，拼接或修饰，甚至是人工合成后导入受体细胞表示大，产生新型抗体。因为可用人体aa序列代替一些鼠源性抗体aa序列，保留其结合抗原特异部位，再经修饰而成。故又称：人源化抗体。且：可从最小抗原结合位点（高变区）Fv片段到F（ab）片段，甚至整个Ig分子，因而免疫原性大大地降低。,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第80页,嵌合抗体,鼠VH基因+人CH基因,嵌合基因,鼠VL 基因+人CL基因,插入载体 真核或原核表示 人-鼠嵌合蛋白,特点：降低了Fc段生物学活性（鼠源性）,但在临床上应用时发觉：嵌合抗体会诱发强烈抗可变区抗体,分子免疫学免疫球蛋白,第81页,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第82页,改型抗体,鼠HVR（CDR）基因-嵌入人Ab可变区基因-嵌合基因-人Ig恒定区 基因-插入载体真核系统（原核系统）-表示 CDR移植抗体,特点,：更深入降低了鼠源性抗体成份,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第83页,小分子抗体,Ig-酶解-提取Fv片段（VH+VL）或Fab段：,抗原结合特异性不变,非常适合临床诊疗，肿瘤,导向治疗,用噬菌体表示技术表示人抗体片段,人抗体多肽基因（VL，VH）+噬菌体（M13/Fd）,外衣壳蛋白III基因N端融合，转染E.coli，噬菌,体表面出现抗体多肽。,分子免疫学免疫球蛋白,第84页,仅含V区结构，免疫原性较弱。,分子量小，易经过血管壁，可有效克服肿瘤灶组织反抗体生理阻抗。,无Fc段，不与非靶细胞FcR结合，易达肿瘤病灶，适合临床诊疗，肿瘤导向治疗。,与靶细胞抗原结协力较弱。,半衰期短，影响抵达肿瘤局部抗体浓度。,小分子抗体特点,分子免疫学免疫球蛋白,第85页,将人Ab 全部H链，L链Fab片段全部与 噬菌,体外衣壳蛋白基因融合，那么就可在噬菌体表,面建立一个表示人抗体Fab多肽基因,噬菌体,文库,。,深入可从噬菌体文库中筛选出特异性多肽，,从而到达制备完全人源抗体目标。,当前，RSV，TNF，HIV，汉滩病毒噬菌体 Fab抗体已获成功，正在进入临床使用。,Back,分子免疫学免疫球蛋白,第86页,思索题,1.,Ig基本结构，功效和水解片段2.Ig多样性形成机制,3.小分子抗体特点4.单克隆抗体、基因工程抗体、嵌合,抗体、,改型抗体，CDR、ADCC,等概念,分子免疫学免疫球蛋白,第87页,