流式细胞术步骤.doc_咨信网zixin.com.cn

资源描述

利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡 1. 细胞按每孔4×105 个的密度接种于60 mm细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理细胞。 (设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为3组，2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L辛伐他汀组正常对照组(NC组)：胰岛素终浓度0.058mg/L A组：辛伐他汀终浓度2μmol/L+胰岛素终浓度 0.058mg/L； B组：辛伐他汀终浓度5μmol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L； C组：辛伐他汀终浓度10μmol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L；于37℃，5%CO2培养箱中孵育48h） 2. 胰酶消化收集细胞，并用1 mL PBS缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML管中。 3. 800 rpm离心5分钟，去除上清，加5 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次，最后重悬细胞于0.5mL PBS中。 4. 用低速振荡器边震动边加入5 mL预冷的70%乙醇，固定，4℃过夜。 5. 次日将固定好的细胞以1000 rpm的转速离心5分钟，弃上清，加入4 mL PBS清洗一次，用0.4 mL PBS重悬细胞。 6. 加入5 μL RNaseA（10 mg/ml）37℃消化1小时，加入终浓度50 mg/mL碘化丙啶（propidium iodide PI）4℃避光染色过夜（或者37℃避光染色1小时），在EPICS XL流式细胞仪上分析。利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化 1. 细胞按每孔4×105 个的密度接种于60 mm细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理细胞。 2．胰酶消化收集细胞，并用1 mL PBS缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML管中。 3 . 800 rpm离心5分钟，去除上清，加5 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次，最后重悬细胞于0.1mL PBS中，并转移到1.5 mL离心管中。 4. 按照1:100加入1UL一抗（如下图对应），置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。 5. 1500rpm，小型离心机离心5分钟，去除上清，加1 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复3次，最后将洗好的细胞重悬于0.1mL PBS中。 6.分别将荧光二抗DyLight 488、DyLight 567按照1:100比例加入细胞悬液中，室温孵育1小时。 7. 1500rpm离心5分钟，去除上清，加1 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复3次，最后重悬细胞于0.2mL PBS中。 8. 用锡箔纸包住避光，将细胞加入流式管中，在EPICS XL流式细胞仪上分析。 IR检测类型细胞 NC组 NC组 NC组 A组 B组 C组一抗无 IgG1 IR IR IR IR 二抗无 DyLight 488 DyLight 488 DyLight 488 DyLight 488 DyLight 488 目的空白对照同型对照实验组对照实验组1 实验组2 实验组3 GLUT4检测类型细胞 NC组 NC组 NC组 A组 B组 C组一抗无 IgG2a GLUT4 GLUT4 GLUT4 GLUT4 二抗无 DyLight 567 DyLight 567 DyLight 567 DyLight 567 DyLight 567 目的空白对照同型对照实验组对照实验组1 实验组2 实验组3 （因为IR 和GLUT4同样为鼠源抗体，并且分开进行检测，二抗颜色可进行调试。尽可能选择效果好的同一种二抗。可能使用一绿一红，也可能使用两个同样颜色的二抗）

展开阅读全文