1、利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡
1. 细胞按每孔4×105 个的密度接种于60 mm细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理细胞。
(设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为3组，2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L辛伐他汀组
正常对照组(NC组)：胰岛素终浓度0.058mg/L
A组：辛伐他汀终浓度2μmol/L+胰岛素终浓度 0.058mg/L；
B组：辛伐他汀终浓度5μmol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L；
C组：辛伐他汀终浓度10μmol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L；
于37℃，5%CO2培养箱中孵育48h）
2. 胰酶消化收集细胞，
2、并用1 mL PBS缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML管中。
3. 800 rpm离心5分钟，去除上清，加5 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次，最后重悬细胞于0.5mL PBS中。
4. 用低速振荡器边震动边加入5 mL预冷的70%乙醇，固定，4℃过夜。
5. 次日将固定好的细胞以1000 rpm的转速离心5分钟，弃上清，加入4 mL PBS清洗一次，用0.4 mL PBS重悬细胞。
6. 加入5 μL RNaseA（10 mg/ml）37℃消化1小时，加入终浓度50 mg/mL碘化丙啶（propidium iodide PI）4℃避光染色过夜（或者37℃避光
3、染色1小时），在EPICS XL流式细胞仪上分析。
利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化
1. 细胞按每孔4×105 个的密度接种于60 mm细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理细胞。
2．胰酶消化收集细胞，并用1 mL PBS缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML管中。
3 . 800 rpm离心5分钟，去除上清，加5 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次，最后重悬细胞于0.1mL PBS中，并转移到1.5 mL离心管中。
4. 按照1:100加入1UL一抗（如下图对应），置于垂直混合液上室温孵育1-2小时。
5. 1500rpm，小型离心机离心
4、5分钟，去除上清，加1 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复3次，最后将洗好的细胞重悬于0.1mL PBS中。
6.分别将荧光二抗DyLight 488、DyLight 567按照1:100比例加入细胞悬液中，室温孵育1小时。
7. 1500rpm离心5分钟，去除上清，加1 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复3次，最后重悬细胞于0.2mL PBS中。
8. 用锡箔纸包住避光，将细胞加入流式管中，在EPICS XL流式细胞仪上分析。
IR检测
类型细胞
NC组
NC组
NC组
A组
B组
C组
一抗
无
IgG1
IR
IR
IR
5、
IR
二抗
无
DyLight 488
DyLight 488
DyLight 488
DyLight 488
DyLight 488
目的
空白对照
同型对照
实验组对照
实验组1
实验组2
实验组3
GLUT4检测
类型细胞
NC组
NC组
NC组
A组
B组
C组
一抗
无
IgG2a
GLUT4
GLUT4
GLUT4
GLUT4
二抗
无
DyLight 567
DyLight 567
DyLight 567
DyLight 567
DyLight 567
目的
空白对照
同型对照
实验组对照
实验组1
实验组2
实验组3
（因为IR 和GLUT4同样为鼠源抗体，并且分开进行检测，二抗颜色可进行调试。尽可能选择效果好的同一种二抗。可能使用一绿一红，也可能使用两个同样颜色的二抗）
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