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如何进行活细胞、死细胞的双重染色 (2009-12-21)
钙黄绿素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶 (PI) 溶液，分别对活细胞和死细胞染色，可用于同时对活细胞和死细胞进行荧光染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管Calcein-AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光 (激发: 490 nm，发射: 515 nm)。因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光 (激发: 535 nm，发射: 617 nm)。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定Calcein-AM和PI的合适浓度。

I. 试剂
·Calcein-AM
·PI

II. 用荧光显微镜观察细胞形态
以HeLa细胞染色为例，请注意不同的细胞种类、不同浓度，有不同的观察条件。根据细胞条件，摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。

1. 染色溶液的配制
1) 用1 ml无水DMSO溶解1 mg Calcein-AM，制备成1 mmol/l的Calcein-AM储备液，-20℃下密闭冷冻保存。
2) 用1 ml ddH2O溶解1 mg PI，制备成1.5 mmol/l的PI储备液 (1 mg PI/1 ml H2O)，-20℃下密闭冷冻保存。
3) 将Calcein-AM储备液和PI储备液放置于室温。
4) 加10 µl Calcein-AM储备液和15 µl PI储备液至5 ml PBS中配制成染色溶液。Calcein-AM的终浓度为2 µmol/l，PI的终浓度为4 µmol/l。

2. 细胞染色
1) 染色HeLa细胞等贴壁细胞时，先用Trypsin-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。
2) 将细胞悬液离心3分钟 (1,000 rpm)。
3) 去除上清液，加入PBS缓冲液，细胞数量调整至10e5-10e6个/ml。再用移液器充分混匀。
4) 由于培养基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用PBS洗涤数次直到完全洗净。
5) 将200 µl细胞悬液移至小试管中，加入100 µl染色溶液，在37℃下孵育15分钟。
6) 在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。
7) 在荧光显微镜下，先用490±10 nm波长激发，观察黄绿色的活细胞，还可以同时观察到红色的死细胞，然后用545 nm波长激发，能够看到红色的死细胞。

3. 染色试剂的最佳浓度
Calcein-AM和PI的最佳浓度是根据不同的细胞种类而定，通过以下的操作，我们可以找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。
1) 通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70%乙醇中孵育30分钟制备死细胞。
2) 用0.1-10 µM PI溶液对死细胞染色，以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。
3) 用0.1-10 µM Calcein-AM溶液对死细胞染色，以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度。接着用该浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞可否被染色。

III. 注意事项
1) Calcein-AM的ester部位遇到湿气会分解，使用后请在-20℃下密闭冷冻保存，防止水分进入。Calcein-AM储备液用缓冲液或培养基等稀释时尽量现配现用。
2) PI溶液在冷冻的条件下可以保存一年。PI有致癌的可能性,请在使用时注意以下3点。
* 使用时一定要带手套、眼罩、口罩。
* 万一接触到皮肤的话，迅速使用大量水清洗。
* 处理方法
使用器具的洗涤液等废液请按照不同的处理方法来处理，或者按照如下的处理方法，分解后再丢弃。用UV照射或光照分解，用次氯酸钠氧化分解后，做中和处理。