高考生物大一轮复习-酶的制备及应用-中图版选修.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,高考生物大一轮复习 酶的制备及应用课件 中图版选修,第三章,酶的制备及应用,【,考纲考情,】,最新考纲及要求,三年考情,(,以山东高考卷为例,),2014,年,2013,年,2012,年,酶在食品制造和洗涤等方面的应用,T35,非选择题,无,无,制备和应用固相化酶,T35,非选择题,无,无,【,知识梳理,】,考点一,影响出汁率的物质及处理方法,1.,影响出汁率的物质：,(1),物质名称：果胶质。,(2),造成的问题：果肉的出汁率低，耗时长；果汁浑浊、黏度高，不易澄清和过滤。,2.,果胶酶与纤维素酶的比较：,种类,组成,作用,果胶酶,多聚半乳糖醛酸酶、果胶分解酶和果胶酯酶,分解果胶为可溶性的半乳糖醛酸,纤维素酶,C,1,酶、,C,X,酶、葡萄糖苷酶,纤维素,纤维二糖,葡萄糖,C,1,酶,C,X,酶,葡萄糖,苷酶,3.,处理方法,酶解法,(,以果胶酶为例,),：,(1),作用机理。,果胶质 小分子有机酸,(2),作用条件。,最适温度：,45,50,。,最适,pH,范围：。,(3),过程,(,以苹果汁为例,),：制备苹果汁配制酶液降解苹果汁,沉淀。,果胶酶,4.,果汁得率的计算方式：,R=V,1,/V,2,100%,(R,：果汁得率；,V,1,：澄清果汁体积；,V,2,：处理前果汁体积,),【,高考警示,】,(1),在苹果泥和果胶酶混合之前，一定要保证底物和酶达到所要求的温度或,pH,条件，以避免混合后条件的变化，确保实验结果的可靠性。,(2),同等条件下的酶促反应速率的快慢可以表示酶活性的高低，但酶活性与酶促反应速率仍然是两个完全不同的概念，其影响因素也不完全相同，如酶的浓度、反应物的浓度可以影响酶促反应速率，但不能影响酶的活性。,考点二,加酶洗衣粉,1.,加酶洗衣粉中的酶：,种类,碱性蛋白酶,纤维素酶,淀粉酶,脂肪酶,作用,催化污渍中的蛋白质水解,作用于纤维织物上的微纤维，避免出现发毛、缠球等现象,催化淀粉水解,催化脂肪,(,油渍,),水解,最适,条件,温度,35,50,50,60,40,60,pH,9,11,7,11,8,10,备注,品种多、,使用广,2.,关于加酶洗衣粉的探究实验：,(1),分析不同温度对加酶洗衣粉洗涤条件的影响实验。,实验变量：水温，必须设置温度梯度。,无关变量：水量与水质、洗衣粉用量、衣物质料与大小、浸泡与洗涤时间等，应保持不变。,(2),分析不同种类洗衣粉对同一污渍或不同污渍洗涤效果的实验。,实验原理：酶的催化作用具有专一性，复合酶洗衣粉加入的酶制剂种类较多，与单一加酶洗衣粉相比，对各种污渍都有较好的洗涤效果。,实验变量。,a.,自变量：不同种类的加酶洗衣粉。,b.,无关变量：其他条件相同且适宜,(,如温度、,pH,等,),。,c.,实验步骤：,步骤,烧杯编号,注入自来水,500 mL,500 mL,500 mL,加入物质,(,相同、等量,),奶渍布,奶渍布,奶渍布,控制水温,37,37,37,加入洗衣粉,(,等量,),蛋白酶,洗衣粉,复合酶,洗衣粉,脂肪酶,洗衣粉,用玻璃棒搅拌,5 min,5 min,5 min,观察实验现象,颜色浅,已消失,颜色浅,【,高考警示,】,酶活性不等同于酶促反应速度,同等条件下的酶促反应速度的快慢可以表示酶活性的高低，但酶活性与酶促反应速度仍然是两个完全不同的概念，其影响因素也不完全相同，如酶的浓度、反应物的浓度可以影响反应速度，但不能影响酶的活性。,考点三,固定化酶与固定化细胞,1.,直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较：,比较,项目,直接使用酶,固定化酶,固定化细胞,适用,方法,物理吸附法或,化学结合法,包埋法,营养,不需要,不需要,需要,缺点,酶易失活，难以回收，影响产品质量,只能催化一种化学反应,反应物不易于接触，反应效率下降,比较,项目,直接使用酶,固定化酶,固定化细胞,优点,催化效率高，低能耗，低污染,可以回收利用，提高产品质量,成本低，操作容易,实例,果胶酶,固定化葡萄糖异构酶,固定化酵母细胞,2.,固定化酶和固定化细胞技术：,(1),将酶或细胞固定化的方法。,包埋法：将酶或细胞包埋在不溶于水的多孔性载体中。,化学结合法：将酶分子或细胞相互结合，或将其结合到载体上。,物理吸附法：将酶分子吸附在载体的表面上。,一般来说，酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化，这是因为体积大的细胞难以被吸附或结合，而体积小的酶容易从包埋材料中漏出。,(2),固定化细胞常用的载体材料：明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。,3.,固定化酵母细胞并发酵产生酒精：,(1),实验注意事项。,海藻酸钠溶化时要用小火或间断加热，避免海藻酸钠发生焦糊。,将溶化好的海藻酸钠先冷却至室温，再与酵母细胞混合，避免高温杀死酵母细胞。,固定化酵母细胞时，应将海藻酸钠酵母细胞的混合液用注射器缓慢滴加到,CaC1,2,溶液中，而不是注射，以免影响凝胶珠的形成。,(2),海藻酸钠溶液的浓度对包埋酵母细胞数量的影响。,浓度过高，将很难形成凝胶珠。,浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数量少。,【,高考警示,】,(1),固定化技术对酶的影响：固定化酶改变了酶的存在状态，不改变酶的特性，因此利用固定化酶仍要严格控制温度、,pH,等环境条件，以利于酶发挥作用。,(2),正确理解固定化酶的优点：固定化酶能够连续使用，但不是永久使用。酶是具有生物活性的大分子，因此随着使用次数的增多，酶活性也会降低，如果酶活性降低到一定程度，就会失去使用价值。,类型一 有关酶应用的实验,【典例1】(浙江高考改编)利用紫甘薯制酒可提高其附加值。请回答：,(1)为提高紫甘薯的利用率，工厂化生产时，可加入果胶酶和淀粉酶，其中果胶酶可来自_等微生物。由于酶在水溶液中不稳定，因此常将酶固定在某种介质上制成_。,(2)果胶酶可将紫甘薯匀浆中的果胶分解成_。,一般来说，酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化，这是因为体积大的细胞难以被吸附或结合，而体积小的酶容易从包埋材料中漏出。,淀粉遇KI-I2溶液显蓝色，而流出液中显示红色，说明大分子淀粉在酶的作用下水解。,海藻酸钠溶化时要用小火或间断加热，避免海藻酸钠发生焦糊。,若流出液呈红色，表明有_生成，若各组呈现的颜色有显著差异，则流出液中淀粉水解产物浓度最高的是_组。,固定化酵母细胞时，应将海藻酸钠酵母细胞的混合液用注射器缓慢滴加到CaC12溶液中，而不是注射，以免影响凝胶珠的形成。,性在所设的温度条件下_。,当反应物达到一定浓度时，随反应物浓度增加，反应速度不再增加。,【典例1】(浙江高考改编)利用紫甘薯制酒可提高其附加值。,(3)如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，则说明海藻酸钠浓度_(填“过低”或“过高”)。,(3)过程(以苹果汁为例)：制备苹果汁配制酶液降解苹果汁,【加固训练】某实验小组的同学制备固定化酵母细胞的过程如下：,(1)请你改正其中两处错误的操作：,一般来说，酶更适合采用化学结合和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化，这是因为体积大的细胞难以被吸附或结合，而体积小的酶容易从包埋材料中漏出。,(4)测定微生物数量的方法：直接计数法，此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量，但不能区分细菌死活；,(2)分析不同种类洗衣粉对同一污渍或不同污渍洗涤效果的实验。,(3),紫甘薯匀浆流经,-,淀粉酶柱后，取适量流出的液体，经脱色后加入,KI-I,2,溶液，结果液体呈蓝色。表明该液体中含有,_,。,A.,淀粉,B.,糊精,C.,麦芽糖,D.,葡萄糖,(4),在发酵前，为使酵母菌迅速发生作用，取适量的干酵母，加入温水和,_,。一段时间后，酵母悬液中会出现气泡，该气泡内的气体主要是,_,。将酵母液接种到待发酵液后，随发酵的进行，酵母菌在,_,条件下产生了酒精和二氧化碳。,(5),下图表示发酵液,pH,对酒精浓度的影响。据图判断，最佳,pH,是,_,。,【,解题指南,】,(1),图中关键信息：,pH,为时酒精浓度最大。,(2),必备关键知识：植物、霉菌、酵母菌和细菌均能产生果胶酶，由霉菌发酵生产的果胶酶是食品加工业中使用量最大的酶制剂之一。果胶酶能将果胶分解成半乳糖醛酸。,【,解析,】,(1),果胶酶不是一种酶，而是一类酶的总称，霉菌等微生物中都能产生。固定化酶就是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂，固定化酶技术的优点：使酶既能与反应物接触，又能与产物分离；固定在载体上的酶可以被反复利用。,(2),果胶是植物细胞壁以及胞间层的主要组成成分之一，是由半乳糖醛酸聚合成的高分子化合物。果胶酶可分解果胶产生半乳糖醛酸。,(3),淀粉遇,KI-I,2,溶液呈蓝色，紫甘薯匀浆流经,-,淀粉酶柱后，大部分淀粉被分解，但是脱色后加入,KI-I,2,溶液，结果液体仍呈蓝色，说明该液体中仍有淀粉的存在。,(4),在发酵前，可以先制备酵母悬液：适量干酵母加少量温水,(,低于,40),在烧杯内调成糊状。为使其迅速发生作用，可加极少量蔗糖，混匀放置片刻，出现气泡即可。原理是酵母在合适的温度下，进行有氧呼吸，将蔗糖彻底分解成二氧化碳和水。发酵过程其实利用了酵母菌的无氧呼吸，在无氧的条件下，酵母菌分解蔗糖，产物是酒精和二氧化碳。,(5),从图中可知，,pH,为时，,10 d,后的酒精浓度最高，说明最佳,pH,为。,答案：,(1),霉菌固定化酶,(2),半乳糖醛酸,(3)A,(4),蔗糖,CO,2,无氧,【加固训练】(济南模拟)在工业生产果汁时，常常利用果胶酶破除果肉细胞壁以提高出汁率，为了研究温度对果胶酶活性的影响，某同学设计了如下实验：,.,将果胶酶与苹果泥分装于不同试管，在,10,水浴中恒温处理,10,分钟,(,如图,A),。,.,将果胶酶与苹果泥混合，再次在,10,水浴中恒温处理,10,分钟,(,如图,B),。,.,将步骤,处理后的混合物过滤，收集滤液，测果汁量,(,如图,C),。,.,在不同温度条件下,重复以上实验步骤，并,记录果汁量，结果如下表：,根据上述实验，请分析回答下列问题：,(1),果胶酶能破除细胞壁，是因为果胶酶可以促进细胞壁中,_,的水解。,(2),实验结果表明，当温度为,_,时果汁量最多，此时果胶酶的活,性在所设的温度条件下,_,。,温度,/,10,20,30,40,50,60,70,果汁量,/mL,8,13,15,25,15,12,11,(3),为什么此实验可以通过测量滤出的苹果汁的体积大小来判断果胶酶活性的高低？,_,。,(4),下列,A,、,B,、,C,图依次表示果胶酶浓度一定时，果胶酶的反应速度与反应物浓度、温度、,pH,之间的关系，据图完成下列问题：,图,A,中，反应物达到某一浓度时反应速度不再上升的原因是,_,。,图,B,中，曲线,ab,段表明,_,，,曲线,bc,段表明,_,。,将装有果胶酶与反应物的甲、乙两支试管分别放入,12,和,90,水,浴锅中，,20,分钟后取出转入,40,的水浴锅中保温，两支试管内的反,应是：甲,_,，,乙,_,。,图,C,表示果胶酶浓度、反应物浓度、温度等一定时，果胶酶催化反应的速度随,pH,变化的曲线，实验时可根据,_,来判定果胶酶的最适,pH,。,【,解题指南,】,解答本题时需要注意以下两点：,(1),弄清果胶酶的作用机理和影响酶活性的重要因素；,(2),分析表格中的数据变化规律和各要素间的因果关系。,【,解析,】,(1),果胶酶能够把果胶分解成可溶性的半乳糖醛酸。,(2),根据表格可知，,40,时果汁量最多，则此温度时酶活性在所设温度的条件下最大。,(3),果胶酶将果胶分解为小分子物质，这些物质可以通过滤纸，苹果汁体积越大，表明果胶酶活性越高。,(4),酶是生物体内具有催化能力的有机物，绝大多数是蛋白质，其催化效率受反应物浓度、温度、,pH,等的影响。,图,A,中，当反应物在低浓度范围内增加时，反应速度迅速上升；当反应物达到一定浓度时，随反应物浓度增加，反应速度不再增加。这是因为酶虽然具有高效性，但催化能力也有一定限度，当所有酶都发挥了最高效能后，反应物浓度再增加，反应速度也不增加，这时受酶浓度限制。,图,B,中，从,a,点到,b,点曲线上升，这是因为温度升高，酶活性升高。曲线,bc,段下降，因为温度超过最适温度，酶活性降低，甚至失活。,由于甲试管温度较低，所以酶活性较低，反应速度很慢，当转入,40(,酶的适宜温度,),的水浴锅中时，其反应速度迅速增加。乙试管在,90,高温下，酶结构被破坏，酶变性失活，当转入,40,的水浴锅中保温时，酶活性也不再恢复，故无催化反应。,图,C,表示当果胶酶浓度、反应物浓度、温度等一定时，果胶酶催化反应的速度随,pH,变化的曲线，实验时可根据果汁的量来判定果胶酶的最适,pH,。,答案：,(1),果胶,(2)40,最高,(3),单位时间内得到的果汁越多，说明此反应速度越快，即酶的活性越高，反之，则酶的活性越低,(4),受反应物中酶浓度的限制,果胶酶的活性随温度升高而增大,超过最适温度，酶的活性随着温度升高而降低,反应速度加快无催化反应果汁的量,【典例1】(浙江高考改编)利用紫甘薯制酒可提高其附加值。,加入物质(相同、等量),取适量不同稀释度的稀释液，用_法分别接种于固体平面培养基上，经培养后进行计数。,(4)固定化强度2%4%,催化效率高，低能耗，低污染,固定化强度(g/30个),催化脂肪(油渍)水解,(4)受反应物中酶浓度的限制,(2)让凝胶珠形成稳定的结构(3)过低,第一处：_。,固定化酶柱长度和淀粉溶液流速决定了酶柱中酶的含量,(2)果胶酶可将紫甘薯匀浆中的果胶分解成_。,同等条件下的酶促反应速度的快慢可以表示酶活性的高低，但酶活性与酶促反应速度仍然是两个完全不同的概念，其影响因素也不完全相同，如酶的浓度、反应物的浓度可以影响反应速度，但不能影响酶的活性。,配制CaCl2溶液：将无水CaCl2溶解在定量蒸馏水中，配制成一定浓度的CaCl2溶液。,浓度过高，将很难形成凝胶珠。,固定化酵母细胞并发酵产生酒精：,同等条件下的酶促反应速度的快慢可以表示酶活性的高低，但酶活性与酶促反应速度仍然是两个完全不同的概念，其影响因素也不完全相同，如酶的浓度、反应物的浓度可以影响反应速度，但不能影响酶的活性。,【,延伸探究,】,(1),上题表中果汁量最多的是不是就一定是果胶酶的最适温度？如何更精确地探究果胶酶的最适温度？,提示：,不一定。在产生果汁最多的温度附近设置更小的温度梯度,(,如,5,、,1,等,),进一步实验。,(2),题中的步骤,能否省略？为什么？,提示：,不能。步骤,保证了果胶酶和苹果泥混合前处于相同温度，避免混合时温度不同对实验结果的影响。,类型二 固定化技术,【典例2】(浙江高考改编)下面是关于固定化酶和细菌培养,实验的问题，请回答：,(1)某兴趣小组欲利用固定化酶进行酶解淀粉的实验(已知糊精遇,KI-I2溶液显红色)，分组见下表。,组别,固定化酶柱长度,(cm),淀粉溶液的流速,(mL,min,-1,),甲,10,0.3,乙,10,0.5,丙,15,0.3,丁,15,0.5,将吸附了,-,淀粉酶的石英砂装入柱中后，需用蒸馏水充分洗涤固定化酶柱，以除去,_,。按上表分组，将配制好的淀粉溶液加入固定化酶柱中，然后取一定量的流出液进行,KI-I,2,检测。若流出液呈红色，表明有,_,生成，若各组呈现的颜色有显著差异，则流出液中淀粉水解产物浓度最高的是,_,组。,(2),下列关于上述固定化酶实验的叙述，错误的是,_,。,A.,固定化酶柱长度和淀粉溶液流速决定了酶柱中酶的含量,B.,淀粉溶液流速过快会导致流出液中含有淀粉,C.,各组实验所用的淀粉溶液浓度应相同,D.,淀粉溶液的,pH,对实验结果有影响,(3),现有一份污水样品，某兴趣小组欲检测其中的细菌数，进行以下实验。将一定量的污水样品进行浓度梯度稀释。取适量不同稀释度的稀释液，用,_,法分别接种于固体平面培养基上，经培养后进行计数。该实验应注意，接种前，从盛有,_,的容器中将玻璃刮刀,(,涂布器,),取出，放在酒精灯火焰上灼烧，冷却后待用；分组时，需用,_,作为对照。,(4),在上述细菌培养实验中进行计数时，应计数的是接种了,_,。,A.,各个稀释度样品的培养基上的细菌数,B.,合理稀释度样品的培养基上的细菌数,C.,各个稀释度样品的培养基上的菌落数,D.,合理稀释度样品的培养基上的菌落数,【,解题指南,】,(1),题干关键词：,“,固定化酶,”“,细菌培养,”“,接种,”“,计数,”,。,(2),隐含信息：酶量对淀粉水解反应的影响、,pH,等环境因素对酶活性的影响、底物淀粉与酶接触面积对反应速率的影响、微生物培养时防止杂菌污染的方法等。,【,解析,】,本题主要考查固定化酶应用的相关知识。,(1),题表中固定化酶柱长度代表所用固定化酶量的大小，长度越大酶柱中所含酶越多；淀粉溶液的流速决定了反应物与酶柱中酶相互接触的时间长短，流速越小，淀粉与酶越能充分接触而反应。淀粉遇,KI-I,2,溶液显蓝色，而流出液中显示红色，说明大分子淀粉在酶的作用下水解。从表中可知，丙中酶柱较长，淀粉流速较小，最适合酶促反应，反应速率最快。,(2),设计实验应遵循对照原则、单因子变量原则，所以每组实验中淀粉溶液浓度应相同、溶液的,pH,均应保持在淀粉酶的最适,pH,条件下，所以,C,、,D,项正确。淀粉溶液流速过快，酶与底物不能充分反应，流出的可能是没有水解的淀粉，故,B,项正确。酶柱中酶的含量由酶柱长度决定，但是酶在反应前后保持不变，所以淀粉溶液流速不能决定酶的含量，因此,A,项错误。,(3),本实验所接种细菌为不同稀释度的菌液，而不是挑取菌落接种，应用稀释涂布平板法。微生物培养为防止杂菌污染需在无菌条件下进行，常用的消毒灭菌方法有：消毒法：煮沸、巴氏消毒法、化学试剂消毒法,(70%,酒精,),；灭菌法：灼烧灭菌、干热灭菌、高压蒸汽灭菌。,(4),测定微生物数量的方法：直接计数法，此法利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物数量，但不能区分细菌死活；间接计数法，常用的是稀释涂布平板计数法，需将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中微生物细胞分散开，为防止偶然性，应计数合理稀释度样品培养基上的菌落数，菌落易于观察。通过以上分析可知,D,项正确。,答案：,(1),未吸附的,-,淀粉酶糊精丙,(2)A,(3),稀释涂布平板,70%,酒精未接种的培养基,(4)D,【,加固训练,】,某实验小组的同学制备固定化酵母细胞的过程如下：,活化酵母细胞：称取定量干酵母与定量蒸馏水混合并搅拌，使酵母细胞活化。,配制,CaCl,2,溶液：将无水,CaCl,2,溶解在定量蒸馏水中，配制成一定浓度的,CaCl,2,溶液。,配制海藻酸钠溶液：用定量的海藻酸钠直接溶解在定量的蒸馏水中，配制成溶液。,海藻酸钠溶液和酵母细胞混合：将活化的酵母细胞迅速加入刚配制成的海藻酸钠溶液中，充分搅拌混合均匀。,固定化酵母细胞：用注射器以恒定的速度缓慢将海藻酸钠和酵母细胞混合液滴加到配制好的,CaCl,2,溶液中，观察凝胶珠的形成。,(1),请你改正其中两处错误的操作：,第一处：,_,。,第二处：,_,。,(2),刚形成的凝胶珠要在,CaCl,2,溶液中浸泡,30 min,左右，目的是,_,。,(3),如果制作的凝胶珠颜色过浅，呈白色，则说明海藻酸钠浓度,_(,填,“,过低,”,或,“,过高,”,),。,(4),研究发现，固定化强度强的酵母颗粒发酵效果好，且稳定性高、使用寿命长。某机构利用上述装置，将,2%,、,2.5%,、,3%,的海藻酸钠分别用,2%,、,3%,、,4%,的,X,溶液进行凝胶化处理，所得到的固定化酵母颗粒的强度及在,28,下发酵,48 h,后的酒精产量见表：,海藻酸,钠,(%),2,2.5,3,2,2.5,3,2,2.5,3,X,溶液,(%),2,2,2,3,3,3,4,4,4,固定化强度,(g/30,个,),930,950,990,1030,1100,1140,1170,1170,1160,酒精量,(%),6.7,6.5,6.5,6.7,6.4,6.2,6.7,6.4,6.3,可以看出，随着,X,溶液浓度的增加，,_,增加；凝胶固定化效果较好的海藻酸钠与,X,溶液的浓度分别是,_,、,_,。,【,解题指南,】,解答本题需要注意两点：,(1),明确固定化酵母细胞的操作细节。,(2),正确分析固定化酵母细胞的应用表格。,【,解析,】,(1),海藻酸钠的溶化应小火或间断加热，至完全溶化。溶化后冷却至室温再加入已活化的酵母细胞，否则会杀死酵母细胞。,(2),刚形成的凝胶珠要在,CaCl,2,溶液中浸泡,30 min,左右，目的是让凝胶珠形成稳定的结构。,(3),凝胶珠颜色过浅，呈白色，说明海藻酸钠浓度过低。,(4),从表中可以看出，随,X,溶液浓度的增加，酵母颗粒的固定化强度增加，且固定化效果较好的海藻酸钠的浓度是,2%,，,X,溶液的浓度是,4%,。,答案：,(1),海藻酸钠溶解应小火或间断加热至完全溶化,海藻酸钠溶液应冷却至室温再加入已活化的酵母细胞,(2),让凝胶珠形成稳定的结构,(3),过低,(4),固定化强度,2%,4%,【,延伸探究,】,判断凝胶珠是否合格可以采用本题,(3),中所述方法，此外还有哪些方法？,提示：,(1),用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。,(2),在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。,(3),如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻酸钠溶液的浓度偏高，制作失败，需要再进行尝试。,