覆盖对连作半夏根际土壤微生物多样性的影响.pdf

第 42 卷第 9 期2023 年 9 月中 国 野 生 植 物 资 源Chinese Wild Plant ResourcesVol.42 No.9Sept.2023覆盖对连作半夏根际土壤微生物多样性的影响罗敏1，2，章文伟1，徐广1，2，罗川1，卢胜鄂1，任星宇1，邓才富1*（1.重庆市药物种植研究所 重庆 南川408400；2.重庆中医药学院，重庆 璧山402760）摘要 目的：探讨了覆盖措施对连作半夏根际土壤微生物多样性的影响，旨在为寻求半夏连作障碍的缓解措施提供理论依据。方法：设置了常规栽种（T1）、稻草覆盖（T2）、玉米秆覆盖（T3）、对照未栽种（CK）4个处理，采用末端限制性片段长度片段多态性（TRFLP）技术分析土壤细菌、真菌菌群结构及多样性。结果：不同覆盖措施间，半夏根际土壤细菌、真菌的多样性分别表现为T2 T3 CK T1、T1 T3 T2 CK；细菌群落中214 bp菌种在连作后消失，经秸秆覆盖后重新出现并成为优势菌种；真菌群落中317 bp菌种成为连作后的优势菌种，经秸秆覆盖后原优势菌种恢复其优势地位。RDA分析表明，不同处理半夏根际土壤中细菌、真菌群落结构均与土壤氮具有极显著相关性。结论：连作半夏根际土壤细菌多样性水平下降，真菌多样性水平升高，土壤微生物出现从“细菌型”向“真菌型”转化的趋势；玉米秆或稻草覆盖对连作半夏土壤微生物菌群的改变具有调节作用，对连作土壤微生态失衡具有一定缓解效果；土壤中氮含量对根际土壤细菌和真菌群落结构具有显著影响，土壤氮是影响微生物生长和发育的重要环境因素。关键词 半夏；覆盖；根际土壤；微生物多样性中图分类号：R931.2 文献标识码：A 文章编号：1006-9690（2023）09-0025-06Effects of Mulching on Soil Microbial Diversity in Continuous Cropping of Pinellia ternataLuo Min1，2，Zhang Wenwei1，Xu Guang1，2，Luo Chuan1，Lu Shenge1，Ren Xingyu1，Deng Caifu1*（1.Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation，Nanchuan 408400，China；2.Chongqing College of Traditional Chinese Medicine，Bishan 402760，China）Abstract Objective：This study explored the effects of mulching measures on rhizosphere soil microbial diversity of continuous cropping Pinellia ternata，aiming to provide a theoretical basis for seeking mitigation measures of continuous cropping obstacles in P.ternata.Method：Four treatments，including conventional planting（T1），straw mulching（T2），corn stalk mulching（T3）and control without planting（CK）were set，and terminal restriction fragment length polymorphism（T-RFLP）was used to analyze soil bacterial and fungal community structures.Result：Among different mulching measures，the diversity of rhizosphere soil bacteria was T2 T3 CK T1，and the diversity of fungi was T1 T3 T2 CK.The 214 bp original dominant strain in bacterial community disappeared after continuous cropping，and reappeared when straw mulching and became dominant bacteria.In the fungal community，317 bp strain became the dominant strain after continuous cropping，and the original dominant strain restored its dominant position after straw mulching.RDA analysis showed that the bacterial and fungal community structures in rhizosphere soil of P.ternate under different treatments were highly significantly correlated with soil nitrogen.Conclusion：The level of bacterial diversity in rhizosphere soil of continuous cropping P.ternata decreased，and the level of fungal diversity increased.Soil microorganisms showed a trend of doi：10.3969/j.issn.1006-9690.2023.09.005收稿日期：2021-10-21，录用日期：2023-08-20基金项目：重庆市基础与前沿研究计划项目（cstc2016jcyjA0169）；重庆市科研机构绩效激励引导专项（2016cstc-jbky-01305；23JK78-2312）。作者简介：罗敏（1987-），女，硕士，副研究员，研究方向为药用植物生态环境及药材质量控制。E-mail：*通讯作者：邓才富（1971-），男，土家族，研究员，研究方向为中药材规范化生产质量控制研究与评价。E-mail： 25中 国 野 生 植 物 资 源第 42 卷transformation from bacterial type to fungal type.Corn stalk or straw mulching had a certain regulatory effect on the change of soil microbial flora in continuous cropping P.ternata，and had a certain mitigation effect on the imbalance of soil microbial ecology in continuous cropping.Soil nitrogen content had a significant impact on the rhizosphere soil bacterial and fungal community structure.It was an important environmental factor affecting the growth and development of microorganisms.Key words Pinellia ternata；Mulching；Rhizosphere soil；Soil microbial diversity半夏来源于天南星科（Araceae）植物半夏 Pinellia ternata（Thunb.）Breit.的干燥地下块茎，是一味应用广泛的大宗传统中药材，为我国药材市场上的主流品种。半夏入药历史悠久，已有两千多年的临床用药历史，且倍受历代医家推崇。据中国医学科学院统计，在558种传统中药处方中，半夏为最广泛应用的30种中药之一，其使用频率居第22位1。半夏野生资源近于枯竭，人工栽培虽在多省有发展，但多年连续种植半夏导致土壤环境恶化，人工种植发生严重的连作障碍，成为制约半夏产业发展的重要原因。随着栽种药用植物年龄增加或重茬、连作，植物生长欠佳，中药材质量和产量大幅度下降，如三七、人参、当归、地黄等2-5，已成为制约中药材产业发展的老大难问题。目前缓解中药材连作障碍的主要方法包括合理耕种模式、土壤管理及生物防治等。研究表明，通过调整根际微生态环境可以从根源上抑制病原菌的生长，从而缓解连作问题6-8。因此，本研究以连续种植2年的半夏根际微生物为研究对象，探究覆盖措施对半夏根际土壤微生物多样性的影响，以期为寻求半夏连作障碍的缓解措施提供科学参考。1材料与方法1.1供试材料半夏种源购买自贵州省毕节市，经重庆市药物种植研究所邓才富研究员鉴定为天南星科植物半夏。1.2试验设计试验地位于重庆市南川区三泉镇铁桥种植基地，海拔620 m，前茬作物为厚皮菜。试验设4个处理：常规栽种（T1）、稻草覆盖（T2）、玉米秆覆盖（T3）、对照未栽种（CK），各3次重复；每小区起垄栽种，垄宽1.3 m，长1.0 m，半夏行距15 cm，株距8 cm，覆土5 cm。第1年春季栽种，出苗、倒苗2次；第2年春出苗前实施覆盖措施（年前未采挖，覆盖前人工拔草），玉米秆（截成垄面宽度）、稻草密集在垄面覆盖一层，约厚2 cm；大田管理同常规管理。供试土壤样品为试验地小区连作2年的半夏根际土壤，于第 2 年秋季采集；CK 于同地块未栽种区五点法采集；土壤采集后捡去植物残体等，装入封口袋，避光存储，带回室内分析。1.3TRFLP分析采用末端限制性片段长度片段多态性（TRFLP）技术分析土壤细菌、真菌菌群结构，具体方法如下。1.3.1土壤微生物群落总DNA提取采 用 Fast DNA Spin Kit for Soil（Qbiogene，Carlsbad，CA，USA）提取半夏根际土壤总 DNA，方法参照试剂盒说明书。1.3.2土壤细菌16S rDNA及真菌ITS区PCR扩增土壤细菌 16S rDNA 扩增引物为 27F（5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3）与1492R（5-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3）9。反应体系：25 L PCR Master Mix，1 L DNA模板，引物（10 pmolL-1）各0.5 L，加入ddH2O至终体积50 L。反应程序：94预变性4 min，再94变性30 s，后55退火30 s，温度72延伸1 min，共进行30个循环，再72延伸10 min，最终于4恒温保存。取2.0 L PCR扩增产物，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，自动凝胶成像系统（Gel Doc Documentation System，Bio-Rad，USA）拍照检测。土壤真菌ITS区PCR扩增引物为ITS1（5-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3）与 ITS4（5-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3）10。反应体系：25 L PCR Master Mix，1 L DNA 模板，引物（10 pmolL-1）各 0.5 L，加入 ddH2O 至终体积 50 L。反应程序：94预变性4 min，94变性30 s，后55退火30 s，温度72延伸1 min，共进行30个循环，再72延伸10 min，最终于4恒温保存。取2.0 L PCR扩增产物，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，自动凝胶成像 系 统（Gel Doc Documentation System，BioRad，USA）拍照检测。1.3.3PCR 产物酶切处理细菌采用限制性内切酶 HhaI和 Hae对纯化后的PCR产物进行酶切。反应体系：限制性内切酶 26第 9 期罗敏，等：覆盖对连作半夏根际土壤微生物多样性的影响（10 U）1 L，相应缓冲液1 L，PCR产物7 L，超纯水补足至10 L。反应条件：限制性内切酶在37水浴中温育12 h，酶切完毕后65水浴20 min终止反应。真菌采用限制性内切酶 HhaI 对纯化后的PCR产物进行酶切。反应体系：限制性内切酶（10 U）1 L，相应缓冲液1 L，PCR产物7 L，超纯水补足至10 L。反应条件：限制性内切酶在37水浴中温育 12 h，酶切完毕后 65水浴 20 min 终止反应。将酶切产物送至擎科生物有限公司（成都）进行基因扫描测序。1.3.4数据整理选择 TRF的一般原则是：峰高 80，相对误差不超过10%。TRFLP图谱中限制性片段（TRF）范围细菌在 35550 bp，荧光值超过 100 RFU，在平行试验的图谱中重复再现的峰纳入统计分析，并去除OTU 丰度 1%的 TRF。TRFLP 图谱中每 1 个限制性片段（TRF）为1个OTU，TRF段大小 1 bp被认为是同一个OTU。1.4统计分析TRFLP图谱中OTU的数目及其丰度用PCORD程序进行多样性指数计算，包括多样性指数（Shannon diversity，H）、均匀度指数（Shannon evenness，E）及丰富度指数（Species richness index，SR）11。土壤理化性质、TRFLP 测定结果均为 3 次重复的平均值。使用SPSS 20.0统计软件，数据采用统计描述、方差分析（One-way ANOVA）、Duncan 检验和 Pearson 相关分析。采用 CANOCO4.5 中的冗余法（Redundancy analysis，RDA）分析群落结构与土壤理化性质11。2结果与分析2.1连作半夏根际土壤细菌和真菌TRFLP多态性分析采用TRFLP 技术对细菌群落结构分析如图1所示。采用 Hha I和 Hae 酶切得到 5种 TRFs优势片段。常规栽种T1处理170 bp、190 bp菌种占优势地位；稻草覆盖T2处理170 bp、214 bp菌种占优势地位；玉米秆覆盖T3处理170 bp、190 bp和214 bp菌种占优势地位；未栽种CK处理 214 bp菌种占优势地位。与未栽种CK相比较，连作后常规栽种T1未出现 214 bp菌种，连作后 214 bp菌种消失了，而经稻草覆盖 T2 和玉米秆覆盖 T3 处理后又出现该菌种，并成为优势菌种。采用 TRFLP技术对真菌群落结构分析如图 2所示。采用 Hha I 酶切得到 6 种 TRFs 优势片段。常规栽种T1处理317 bp菌种占优势地位，稻草覆盖T2处理214 bp和317 bp菌种占优势地位，玉米秆覆盖T3处理317 bp、383 bp菌种占优势地位，未栽种区域CK处理214 bp、383 bp菌种占优势地位。常规栽种T1、稻草覆盖T2和玉米秆覆盖T3均有317 bp菌种为优势菌种，与未栽种区域CK相较，说明半夏连作后317 bp菌种不断繁殖扩大，逐渐成为优势菌种。而通过稻草覆盖和玉米秆覆盖之后，原优势菌种214 bp 和 383 bp 菌种逐渐扩大并有占据优势的趋势。2.2连作半夏根际土壤细菌和真菌多样性分析以T-RFLP图谱为基础，连作半夏不同覆盖措施下根际土壤细菌和真菌多样性分析结果如表1和2所示。由表1可知，连作后常规栽种T1与未栽种区域 CK 相较，半夏连作 2年后其根际土壤细菌的Shannon多样性指数和均匀度均呈下降趋势，但二图1连作半夏不同措施下根际土壤细菌群落的TRFLP多态性分析Fig.1TRFLP polymorphism analysis of rhizosphere soil bacterial community under different continuous cropping Pinellia ternata treatments图2连作半夏不同措施下根际土壤真菌群落Hha I酶切的TRFLP多态性分析Fig.2TRFLP polymorphism analysis of fungal community in rhizosphere soil under different measures of continuous cropping Pinellia ternata treatments 27中 国 野 生 植 物 资 源第 42 卷者间差异不显著。由表2可知，连作后常规栽种T1与 CK 相较，半夏连作 2 年后其根际土壤真菌的Shannon多样性指数、均匀度指数和丰富度指数均呈上升趋势，且连作后常规栽种T1的根际土壤真菌Shannon多样性指数和丰富度指数均显著高于未栽种区域CK（P T3 CK T1，经稻草和玉米秆覆盖之后，连作半夏根际土壤细菌菌群的Shannon多样性指数和丰富度指数明显升高，高于常规栽种T1和未栽种区域CK，且与常规栽种T1间差异达显著水平（P T3 T2 CK，且稻草覆盖T2与玉米秆覆盖 T3均显著低于常规栽种 T1。以上标明，通过覆盖稻草或玉米秆后，连作半夏根际土壤微生物菌群发生了改变，细菌多样性水平升高，真菌多样性水平有所下降，逐渐调节了土壤微生物菌群的转化趋势。2.3连作半夏根际土壤细菌和真菌群落与土壤养分的关联分析运用RDA分析进行不同处理半夏根际土壤细菌群落结构与土壤养分参数的相关性分析，获得二者关系图，如图3所示。冗余分析图中箭头表示环境因子，箭头所处的象限表示环境因子与排序轴间的正负相关性，箭头连线长度代表某个环境因子与样本分布相关程度的大小。连线越长，相关性越大，代表这个环境因子对研究对象的分布影响越大；反之越小。箭头连线与排序轴的夹角代表着某个环境因子与排序轴的相关性大小，夹角越小，相关性越高；反之越低12。分析结果显示，第1排序轴的特征值为0.751，第2排序轴特征值为0.024。由图3可知，第1排序轴与N关系最为密切，均达到极显著水平（P 0.01）。本试验中 N 对细菌群落结构的影响最显著（P 0.05，蒙特卡罗算法）。运用RDA分析进行不同处理半夏根际土壤真菌群落结构与环境参数的相关性分析，获得二者关系图，如图4所示。分析结果显示，第1排序轴的特征值为0.856，第2排序轴特征值为0.009。由图4可知，第1排序轴与N关系最为密切，均达到极显著水表1连作半夏不同措施下根际土壤细菌多样性指数Tab.1Bacterial diversity index of rhizosphere soil under different continuous cropping measures处理T1T2T3CKShannon多样性指数/H2.774 0.31 b2.957 0.27 a2.901 0.51 a2.808 0.47 ab均匀度指数/E0.652 0.047 a0.632 0.021 a0.953 0.046 a0.654 0.065 a丰富度指数/SR31 b62 a52 a31 b注：表中同列不同小写字母代表差异显著（P 0.05）。表2连作半夏不同措施下根际土壤真菌多样性指数Tab.2Diversity index of fungi in rhizosphere soil of continuous cropping Pinellia ternata处理T1T2T3CKShannon多样性指数/H2.971 0.21 a2.742 0.34 bc2.801 0.11 b2.688 0.15 c均匀度/E0.994 0.051 a0.992 0.011 a0.981 0.012 a0.912 0.031 a丰富度/SR51 a42 ab42 ab31 b注：表中同列不同小写字母代表差异显著（P 0.05）。图3连作半夏根际土壤细菌菌落与土壤养分的冗余分析Fig.3Redundancy analysis of bacterial colony and soil nutrient in rhizosphere soil of continuous cropping Pinellia ternata图4连作半夏根际土壤真菌菌落与土壤养分的冗余分析Fig.4Redundancy analysis of fungi colony and soil nutrient in rhizosphere soil of continuous cropping Pinellia ternata 28第 9 期罗敏，等：覆盖对连作半夏根际土壤微生物多样性的影响平（P 0.01）。本试验中N对真菌群落结构的影响最显著（P 0.05）。3讨论与结论3.1连作对半夏根际土壤细菌和真菌多样性的影响土壤微生物多样性及其组成的改变会打破根际土壤微生态系统功能，破坏土壤健康，土传病害等加剧，进而影响作物的产量和品质13-15。连作障碍的发生与根际微生态系统的失衡密切相关，长期连作可导致根际微生物群落结构和功能多样性的改变16，17，且病原菌增加，益生菌减少，影响了土壤的生产力16，18。本试验结果表明，半夏连作后，其根际土壤细菌和真菌菌群的多样性水平发生了变化，细菌的多样性水平呈下降趋势，而真菌的多样性水平则呈现相反的变化趋势。相关研究表明，连作会导致微生物区系组成发生变化，由细菌型土壤向真菌型土壤转变；细菌型土壤是土壤肥力提高的一个生物指标，而真菌型土壤是地力衰竭的一个标志19。随着连作年限的增加，土壤质量逐渐变差，细菌菌群结构简单、多样性水平下降，真菌则升高20。本试验的研究结果与之相一致。由此可见，半夏连作改变了土壤细菌、真菌的菌群结构及多样性水平，这可能是半夏连作障碍发生的主要原因之一。因此，进一步研究连作对土壤微生物功能及活性的影响，可为减缓连作障碍提供重要的科学依据。3.2覆盖对连作半夏根际土壤细菌和真菌多样性的影响相关秸秆覆盖的研究结果发现，与不覆盖的耕作方式相比，玉米秸秆覆盖会改变土壤中微生物的种类和结构，改善土壤质量，可在植物生长过程中持续提供营养物质21；稻草覆盖后土壤细菌丰富度和Shannon多样性指数增加，稻草覆盖措施是增加土壤细菌多样性的主要影响因素22，23，可显著增加土壤微生物数量24。本研究覆盖试验结果表明，通过覆盖玉米秆或者稻草后，连作半夏根际土壤微生物群落结构发生了改变，与连作后常规栽种相比较，细菌菌群的多样性水平显著提高，而真菌菌群多样性水平明显下降，这说明秸秆覆盖措施对连作后土壤微生物菌群的改变具有一定调节作用，这一发现或许能够为进一步研究连作障碍的缓解措施提供思路与前期基础。另外，相关研究表明，土壤微生物群落与土壤氮含量呈极显著相关25。本实验中也发现土壤氮对根际土壤细菌和真菌群落结构具有显著影响，说明土壤氮是影响微生物生长和发育的重要因素，那么是否可以进一步研究土壤氮对微生物的影响机制，进而通过调节土壤氮含量来调控土壤微生态环境，以此来缓解连作导致的土壤微生态失衡问题；以上推测将有待综合多学科进行深入研究与解释。综上所述，半夏连作后，根际土壤细菌多样性水平下降，土壤真菌多样性水平升高，土壤微生物出现从细菌型向真菌型转化的趋势；玉米秆或者稻草覆盖对连作半夏土壤微生物菌群的改变具有一定调节作用，细菌多样性水平显著提高，真菌多样性下降，且能够恢复原优势菌种；秸秆覆盖对连作土壤微生态失衡具有一定缓解效果；土壤中氮含量对根际土壤细菌和真菌群落结构具有显著影响，土壤氮是影响微生物生长和发育的重要环境因素。参考文献:1 潘平，李伟平，熊明星，等.我国半夏产业现状及可持续发展策略 J.中国药房，2013，24（31）：2881-2884.2 李明杰，冯法节，张宝，等.多元组学背景下地黄连作障碍形成的分子机制研究进展 J.中国中药杂志，2017，42（3）：413-419.3 孙雪婷，李磊，龙光强，等.三七连作障碍研究进展 J.生态学杂志，2015，34（3）：885-893.4 王瑞，董林林，徐江，等.基于病虫害综合防治的人参连作障碍消减策略 J.中国中药杂志，2016，41（21）：3890-3896.5 张新慧，张恩和，王惠珍，等.连作对当归生长的障碍效应及机制研究 J.中国中药杂志，2010，35（10）：1231-1234.6 瞿瑜婷，张前前，俞叶飞，等.根际微生态视角下药用植物连作障碍机制和缓解措施研究进展 J.浙江大学学报（农业与生命科学版），2022，48（4）：403-414.7 蒋丽，郭瑞齐，管仁伟，等.基于微生态平衡消减西洋参连作障碍策略 J.山东农业科学，2021，53（4）：151-156.8 崔利，郭峰，张佳蕾，等.摩西斗管囊霉改善连作花生根际土壤的微环境 J.植物生态学报，2019，43（8）：718-728.9 Matsumoto M，Sakamoto M，Hayashi H，et al.Novel phylogenetic assignment database for terminal restriction fragment length polymorphism analysis of human colonic microbiota J.J Microbiol Meth，2005，61：305-319.10尹承苗，王功帅，李园园，等.连作苹果园土壤真菌的 T-RFLP分析 J.生态学报，2014，34（4）：837-846.11秦红灵，袁红朝，张慧，等.红壤坡地利用方式对土壤细菌群落结构的影响 J.土壤学报，2011，48（3）：594-602.12童炳丽，刘济明，陈敬忠，等.米槁根际土壤真菌多样性及其与果实药用活性成分含量的相关性分析 J.菌物学报，2019，38（7）：1058-1070.13Dong L L，Yao H，Li Q S，et al.Investigation and integrated molecular diagnosis of root-knot nematodes in Panax notoginseng root in the field J.Eur J Plant Pathol，2013，137（4）：667-675.14Mazzola M，Manici M L.Apple replant disease：role of microbial 29中 国 野 生 植 物 资 源第 42 卷ecology in cause and control J.Annu Rev Phytopathol，2012，50（1）：45-65.15Zhou X G，Wu F Z.Dynamics of the diversity of fungal and Fusarium communities during continuous cropping of cucumber in the greenhouse J.FEMS Microbiol Ecol，2012，80（2）：469-478.16Nayyar A，Hamel C，Lafond G，et al.Soil microbial quality associated with yield reduction in continuous-pea J.Appl Soil Ecol，2009，43（1）：115-121.17Huang L F，Song L X，Xia X J，et al.Plant-soil feedbacks and soil sickness：from mechanisms to application in agriculture J.J Chem Ecol，2013，39：232-242.18Chen M N，Li X，Yang Q L，et al.Soil eukaryotic microorganism succession as affected by continuous cropping of peanut-pathogenic and beneficial Fungi were selected J.PLoS ONE，2012，7（7）：e40659.19Larkin R P.Characterization of soil microbial communities under different potato cropping systems by microbial population dynamics，substrate utilization，and fatty acid profiles J.Soil Biol Biochem，2003，35（11）：1451-1466.20林茂兹，王海斌，林辉蜂.太子参连作对根际土壤微生物的影响 J.生态学杂志，2012，31（1）：106-111.21李万星，李丹，靳鲲鹏，等.晋东南旱作区玉米秸秆不同覆盖方式下土壤微生物多样性变化 J.北方农业学报，2019，47（4）：40-46.22成艳红，黄欠如，武琳，等.稻草覆盖和香根草篱对红壤坡耕地土壤酶活性和微生物群落结构的影响 J.中国农业科学，2017，50（23）：4602-4612.23成艳红，王馨悦，林小兵，等.稻草覆盖和香根草篱措施下坡耕地红壤细菌群落结构特征及其影响因素 J.土壤，2021，53（3）：522-528.24蓝天琼，范巧佳，郑顺林，等.免耕稻草覆盖栽培川芎对土壤微生物与酶活性的影响 J.西南农业学报，2014，27（1）：76-81.25张莉，党军，刘伟，等.高寒草甸连续围封与施肥对土壤微生物群落结构的影响 J.应用生态学报，2012，23（11）：3072-3078.（上接第16页）5 陈伟，杨奕，马绍宾，等.滇重楼种子休眠类型的研究 J.西南农业学报，2015，28（2）：783-7866 袁理春，陈翠，杨丽云，等.温度和赤霉素对滇重楼种子二次发育的影响 J.种子，2003，22（5）：34-357 苏文华，张光飞.滇重楼光合作用与环境因子的关系 J.云南大学学报：自然科学版，2003，25（6）：545-548.8 陈瑶，周寒梅，何兵，等.GA3和IAA组合调控华重楼种子萌发机理初探 J.园艺学报，2020，47（2）：321-333.9 杨根林，谭凤琼，高云，等.不同处理方法对滇重楼种子萌发及成苗的影响 J.种子，2019，38（9）：81-84.10谭秋生，章文伟，徐广，等.多重处理对华重楼种子休眠解除的影响 J.亚太传统医药，2021，17（3）：62-65.11匡秀芬.龙陵县滇重楼林下栽培试验 J.林业调查规划，2013，38（1）：115-118.12陈发菊，白天宇，梁宏伟，等.一种促进华重楼种子快速萌发的方法 P.中国专利，CN113141810A，2021-7-23.13曾汉元，梁娟，周时旗.一种华重楼种子的快速育苗方法 P.中国专利，CN113179894A，2021-05-21.14Abdallah A D，Barhoumi Z，Smaoui A，et al.ABA，GA，and nitrate may control seed germination of Crithmum maritimum（Apiaceae）under salone conditions J.Comptes Rendus Biol，2009，332（8）：704-710.15Kucera B，Cohn M A，Leubner M G.Plant hormone interactions during seed dormancy release and germination J.Seed Sci Res，2007，15（4）：281-307.16黄玮，孟繁蕴，张文生，等.滇重楼种子休眠机理研究 J.中国农学通报，2008，24（12）：242-246.17孟繁蕴，汪丽娅，张文生，等.滇重楼种胚休眠和发育过程中内源激素变化的研究 J.中医药学报，2006，34（4）：36-38.18赵俊凌，罗承彬，李戈.不同层积处理滇重楼种子内源激素变化的研究 J.云南中医学院学报，2014，37（3）：28-29，41.19宋发军，罗忠，黄珍，等.赤霉素处理对重楼种子萌发相关生理指标的影响 J .中南民族大学学报（自然科学版），2016，35（3）：30-34.20张琳，李海峰，张德全，等.层积和赤霉素协同作用对解除滇重楼种子休眠的影响 J .中国药学杂志，2013，48（20）：1719-1723.21李宝，李玛，邱斌，等.温度对滇重楼种子萌发的影响 J.安徽农业科学，2017，45（26）：129-130.22李海峰，赵昱，袁朗白，等.滇重楼种子休眠破除及植株形态发生的研究 J.中国实验方剂学杂志，2013，19（5）：161-164.23古今，吴梅，李文春，等.滇重楼种子中萌发抑制物质活性的研究 J.现代中药研究与实践，2013，27（1）：10-12.24赵东兴，李春，赵国祥，等.云南地道药材滇重楼的研究进展J.热带农业科学，2014，34（1）：42-47.25王跃华，田孟良，蒋婷婷，等.华重楼种子外皮的化感作用研究 J.西南农业学报，2012，25（1）：340-342.26周浓，张玉莲，郭冬琴，等.滇重楼总黄酮提取工艺的正交试验法优选 J.时珍国医国药，2014，25（3）：581-583.27刘涛，谢世清，赵银河，等.滇重楼林下规范化种植生产标准操作规程（SOP）J.现代中药研究与实践，2014，28（2）：3-6.28周浓，李自勤，姜北，等.超声波对滇重楼种子萌发能力的影响 J.湖北农业科学，2012，51（1）：114-116.29李荣英，段立胜，唐德英.重楼种苗繁殖试验 J.时珍国医国药，2006，17（12）：2639.30李绍平，杨丽英，杨斌，等.滇重楼高效繁育和高产栽培研究J.西南农业学报，2008，21（4）：956-959.31张琳，李海峰，张德全，等.层积和赤霉素协同作用对解除滇重楼种子休眠的影响 J.中国药学杂志，2013，48（20）：1719-1724.32陈疏影，尹品训，王荔，等.变温层积对解除滇重楼种子休眠及其内源激素变化的研究 J.中草药，2011，42（4）：793-795.33汪佳维，王华磊，赵致，等.不同试剂及温度对解除滇重楼种子休眠的影响 J.河南农业科学，2020，49（3）：47-53.30