DB44∕T 1136-2013 饲料中乳酸菌活菌的检验方法(广东省).pdf

ICS.65. 120 B 20 备案号45748-2015DB44 广东省地方标准DB44/ T 1136一2013饲料中乳酸菌活菌的检验方法Method for detection of lactic acid bacteria in feed 2013-05-08发布2013-08-15实施广东省质量技术监督局发布1 目IJ=i 本标准按照GB/T1. -2009给出的规则起草。本标准的附录A为规范性附录.本标准由广东省质量技术监督局提出.本标准起草单位广东省微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)。OB44/T 1136-2013 本标准主要起草人:朱红惠、羊宋贞、冯广达、李燕旋、王永红、张鲜妓、邓名架.2 DB44/T门36-2013饲料中乳酸菌活菌的检验方法1 范围本标准规定了含乳酸菌饲料中乳酸菌(肠球商、乳杆菌、片球菌)活酶的微生物学检验方法。本标准适用于含乳酸菌饲料中乳酸菌(肠坐监乳杆菌、片球菌)活酶的检验.2 规范性引用文件下列文件中的的修改单适用于本标准.GB/ T 6682 3. 1 3. 2 3. 3 3.4 3. 5 3. 6 3. 7 3. 8 3. 9 3. 10 4 培养基和试剂4. 1 实验室用水应符合GB/T4. 2 0.85%灭菌生理盐水。4. 3 MRS培养基2见附录A.1. 250mL、500mL、4.4 肠球菌琼脂(胆汁七叶背叠氮销琼脂)培养基.见附录A.2 4. 5 革兰氏染色液:见附录A.35 试样的制备5. 1 饲料的来样和试样制备按GB/T14699. 1规定执行.5.2 来样应在无菌操作下进行.引用文件，其随后所有用文件，其最新版本3 4 DB44/ T 1136-2013 5.3 采样工具，如铲子、匙、采样器、试管、广口瓶、剪子等，应是无菌的.5.4 样品包装为袋、瓶或罐装者，取完整未开封的.样品是固体，应边取边混合:样品是流体，通过振摇即可混匀。6检验程序2 样品25g(或25mL)加225mL无菌生理盐水10倍系列稀释并选择3个合远的稀释度每个稀释度吸取O.lmL加入到MRS平阪:il1行除布厌氧，字L轩菌计数每个稀释度吸取O.lmL加入到肠球商琼脂培养基EA半板边行涂布厌氧，36C士C.(随机挑取5个幽落镜怆后Hff:杆菌ti1总曲数的比例)36C士C 48h士2h挑取事L股菌乳杆菌、片球础和肠球菌接种于MRS琼JJ旨i1f!i基(可边做)报告圈1饲料中乳酸菌活菌的检验方法流程图片球菌数=DB44/ T 1136-2013 7 操作步骤7. 1冷冻样品可先使其在2C- 5 C条件下解冻，时间不超过18h.也可在温度不超过45C的条件下解冻，时间不超过15min. 7. 2团体和半团体样品z以无菌操作称取25g样品，置于装有225mL 0.85%无E自生理盐水的无菌均质杯内，子8000r/min-IOOOO r/min均质1min- 2 min.制成1:10样品匀液;或置于225mL O. 85% 无菌生理盐水的无商均质袋中，用拍击式均质器拍打1min- 2 min制成1:10的样品匀液。7. 3液体样品:液体样品应先将其充分摇匀后以无菌l吸管吸取样品25mL放入装有225mL 0.85%无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分振摇，制成1:10的样品匀液。7. 4用jmL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1mL.沿管壁缓慢注于装有9mL 0.85%无菌生理盐水的无菌试管中(注意吸管尖端不妥触及稀释液).振摇试管或换用l支无菌i吸管反复吹打佼其混合均匀，制成1:100的样品匀液。7. 5另取JmL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做10倍递增样品匀液，每递烟稀释一次，即换用1次JmL灭菌吸管或吸头.7. 6乳酸菌计数7. 6. 1乳酸菌总数选择2个-3个适宜的稀释度，每个稀释梯度2个平板，分别吸取0.1mL稀释液于MRS琼I旨平板上，使用L形棒地行涂布。36C:!:JC.厌氧培养48h士2h后，计数平板上的革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性的所有菌落数。从样品稀释到平板涂布要求在15min内完成。7. 6. 2肠球菌计曼史根据待检样品肠球菌活菌数的估计，选择2个-3个连续的适宜稀释度，每个稀释梯度2个平板，分别吸取0.1mL稀释液子肠球菌琼脂平板上，使用L形榨进行涂布。36C士jC.厌氧培养48h士2h 后计数，局球菌在肠球菌琼脂平板上的菌部特征为商荡中等偏小，直径2mm土lmm.边缘整齐，表面光滑的棕黑色菌落(外边缘为棕色，中心黑色).具有棕色晕轮.从样品稀释到平板涂布要求在15min 内完成.7. 6. 3乳杆菌计数随机挑取7.6.J乳酸菌总数平板上5个或以上菌落，分别做革兰氏染色镜检，根据乳杆菌占总数的比例计算乳杆菌的数量。逃取7.6.1中的同一稀释梯皮的2个平行平板，求平均ell得到该样品中乳杆菌的数量.例如1.乳酸商总数平板10-稀释梯度上计数结果为100CFU.随机挑取5个菌落镜检有3个商落形态为乳杆菌，那么乳杆菌数为:10 X JOOx (3/5) =6X 10 CFU/mL或CFU/g7.6.4片球菌蚊按照7.6.1乳酸菌总数结果减去7.6.2肠球菌与7.6.3乳杆菌计数结果之和ell得片球茵茵数.7. 7菌落计数可用肉Ul!观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量.菌落计数以菌落形成单位CFU表示.选取菌落数在30CFU-300 CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计数商落总数。低于30CFU的平板记录具体菌落数，大于300CFU的可记录为多不可计。每个稀释皮的菌落数应采3 5 6 0844/ T 1136-2013 用两个平板的平均数-7.8结果的表述7.8.1若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算二个平板菌落数的平均值，再将于均伯乘以相应稀释倍数，作为每g(mL)样品中古自落总数结果.7.8.2若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式(1)计算:N =I:C /(n,+O.ln,) d. (1) 式中忡一一样品中菌落数:LC-平板(含适宜范围菌落数的平板)古自落数之和:n，-一第一稀释度(低稀释倍数)平板个数:n，一一第二稀释度(高稀释倍数平板个数.d-一稀释因子第一稀释度)0 7.8.3若所有稀释度的平板菌落数均小于30CFU.则应按稀释度最低的平均荫落数乘以稀释倍数计算.7. 8. 4若所有稀释度(包括液体样品尿液平扳均无菌落生长，则以小于l乘以最低稀释倍数计算.7. 8. 5若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU-300 CFU之间，其中一部分小子30CFU 或大于300CFU 时，则以绿接近30CFU或300CFU的平均凶落数乘以稀释倍数计算。7. 9菌落数的报告7. 9. 1前落数小于100CFU时，按四舍五入原则修约，以整数报告。7.9.2菌落数大于或等于100CFU 时，第3位数字采用四舍五入原则修约后，取前2位数字，后面用。代替位数;也可用10的指数形式来表示，按四舍五入原则修约后，采用两位有效数字。7.9.3称霆驭样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。8 结果与报告根据施落计数结果出具报告，报告单位以CFU/g(mL)表示。9 乳酸菌的鉴定(可选做)9. 1 纯培养挑取3个或以上单个菌落，肠球菌、手L杆菌、片到(自接种于MRS琼脂平板，望36C:!: 1 c厌氧培养48h土2ho 9.2鉴定9.2. 1 涂片镜检乳杆菌属菌体形态多样，呈长籽状、弯曲轩状或短杆状，无芽泡，革兰氏染色阳性:肠球幽属菌体球形或卵圆形.0.6m-2.0mXO.6m-2.5m.成对或短链状排列，无芽泡，革兰氏染色阳性:片球菌属菌体呈球形，直径为1.2m-2.0m.单个细胞罕见，一般成对生、不形成链状排列，无芽抱，革兰氏染色阳性.9.2. 2 乳酸菌菌种主要生化反应4 OB44/T 1136-2013 表1饲料中常用乳杆菌属内种的碳水化合物发酵试验结果葡甘松蜜til 核山i.1! 甘水海商种黯露籽精梨糖跻杨藻酸醉糖糖糖醉黯音糖盐干酣乳杆菌(LactobacjJlus casej) + + + + + + + + + 嗜酸乳杆菌(L.acidJophilus) d d + + d 植物乳杆菌L.pJantarum) 恒U . + + + + + + + 种7 户、O -= 产.产酸产酸乳酸片球菌(寸E/d 1.1 d 飞EC吨正戊精片球菌(P.-.: 又7 气二+,1 + + + 扣，则上菌株阳性户，说吧 t / . 圃，5 7 8 0844/ T 1136-2013 A. 1 MRS培养基A. 1. 1成分蛋白陈牛肉粉酵母粉葡萄糖吐温80K,HPO. 7H,0 醋殷铀.31,0 拧-tlll量三绞MgSO. 711,0 MnSO. 4H,0 琼脂粉A. 1.2串IH去附录A(规范性附录)培养基及试剂10. 0 g 5.0 g 4.0 g 20.0 g 1. 0 mL 2.0 g 5.0 g 2.0 g O. 2 g 0.05 g 15. 0 g 将上述成分加入到1000mL蒸ffij水IjI t加热溶解，调pll至6.2.分装后121C商压灭菌15min 20 min. A. 2 队肠球菌琼脂(胆汁七叶音叠氮纳琼脂)培养基A. 2. 1成分恨;蛋白陈牛肉粉酵母粉牛Il粉氯化饷拧核酸纳七l叶营拧核酸铁锁叠氮化纳琼脂粉A. 2. 2制法17. 0 g 3. 0 g 5. 0 g 10.0 g 5. 0 g 1. 0 g 1. 0 g 0. 5 g 0.25 g 15. 0 g 将上述成分加入到1000mL蒸铺水中，加热溶解，调pH至7.1.分装后121C高压灭曲15min-20 min. A.3革兰氏染色液A. 3. 1结局紫染色液DB44/T 1136-2013 A. 3. 1. 1成分结晶紫95%乙醇1%草酸钱水溶液A. 3. 1. 2审IJ5去将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸绞溶液混合。A.3.2革兰氏锁液A. 3. 2. 1成分E曲目跑化钢蒸饱水A.3.2.2和IJ5去1. 0 g 20 mL 80 mL 1. 0 g 2.0 g 300 mL 将腆与腆化仰先进行混合，加入蒸馆水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馆水至300mL. A.3.3沙黄复染液A. 3. 3. 1成分tI、黄95%乙醇蒸惚水A.3.3.2和15去将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馆水稀释。A.3.4染色法0.25 g 10 m L 90 mL A. 3. 4. 1将涂片在酒精灯火焰上固定，滴力日结晶紫染色液，染1min，水洗。3.4.2稍加革兰氏腆液，作用1min，水洗。儿3.4.3滴加95%乙醇脱色，约15530 5，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。A.3.4.4滴加复染液，复染mino水洗、待干、镜检.7 g 的FON-白的FF户咕咕。广东省地方标准饲料中乳酸菌活菌的检验方法DB44/ T 1136-2013 * 广东省标准化研究院组织印刷广州市海珠区南田路563号1104室邮政编码510220网址www.bz360.org电话[phone]南方医科大学广州广卫印刷厂no -