目的基因的获得.ppt

*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,5,章,目的基因的获得,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,3,章,目的基因的获得,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第,3,章,目的基因的获得,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目的基因的获得,contents,3.1 从基因组DNA获得目的基因,碱抽提法提取总DNA,层析法获得细胞总RNA,核酸的定量和纯度测定,核酸电泳装置,电泳仪,核酸电泳装置,电泳槽、倒胶板,耗材,大肠杆菌总,DNA,的提取,1.Pellet 0.1 g or 2mL,菌液，,+TE buffer(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,pH 8.0)450,L+10%SDS 45,L+10 mg/mL PK 6,L,2.37,温浴,1 h(,至清澈透明,),3.,酚,/,仿 抽提,3,次,(,至无蛋白层,),4.,上清,+1/10,的,3 M NaAc,+,等体积异丙醇,5.75%,酒精洗涤沉淀,2-3,次,6.,干燥，,TAE,溶解,3.2,从基因文库中筛选目的基因,基因组文库的构建,cDNA,文库的构建,构建基因组文库筛选目的基因,Genomic libraries,：,a collection of clones,representative of the entire starting population,某种生物的基因组的全部遗传信息,切割成一定长度的,DNA,片段，再,通过克隆载体贮存在一个受体菌的,群体,之中，这个集合即为该生物的,基因组文库,构建时遗传信息供体是基因组,DNA,，因而无发育时期及组织器官特异性；,一个完全的基因组文库中包含着基因组,DNA,上的所有编码区及非编码区序列的克隆。生物有机体的每一个基因在文库中都有其克隆，该克隆的基因片段里包括着间隔序列，所以基因组文库可真实地显示基因组的全部结构信息。,基因组文库的大小,一个理想的基因组文库，包含完整基因组的所有,DNA,序列,理论上的克隆子数目基因组,DNA,总长度,/DNA,插入片段的平均长度,实际的克隆子数目：大于理论,11,11,载体能够容载的,DNA,片段大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。载体容量越大，构建文库所要求的,DNA,片段数目越少，所需的重组子越少。,11,12,12,12,Process constructing a genemic library,（基因组文库的构建流程）,物理切割法：超声波（,300bp,）或机械搅拌（,8kb,）。,酶切法：内切酶,Sau3A,进行局部消化。可得到,10-30kb,的随机片段。,13,13,（,1,）染色体,DNA,大片段的制备,直接连接、人工接头（,adapter,）或同聚物加尾。,如：,Sau,3A,与,Bam,HI,的酶切末端相同（二者是同尾酶）。,（,2,）载体分别与得到的基因组,DNA,大片段进行连接,（,3,）重组载体各自转导受体细胞，,扩大培养，得到基因组文库,*,（,4,）筛选重组子,形成一个含有所有片段的菌群，这个菌群就是一个基因组文库,靶,DNA,未测序或未定位时，可通过基因组文库筛选靶,DNA,。,Q,：什么是,adapter,？,Linker,？同尾酶？（第,2,、,5,章）,13,自学,引物,primer,连杆,linker,衔接头,adaptor,比DNA文库小的多，容易构建，文库的筛选比较简单易行；,2：cDNA与载体连接，形成重组载体,Improved method for cDNA cloning.,酶切法：内切酶Sau3A进行局部消化。,（1）染色体DNA大片段的制备,（2）载体分别与得到的基因组DNA大片段进行连接,实际的克隆子数目：大于理论,现在常用的酶：天然的酶改造过以利于生产全长cDNA,如：Sau3A与BamHI的酶切末端相同（二者是同尾酶）。,Character of cDNA library（cDNA文库的特点）,分离的目的基因可直接用于表达,1976年，发卡方法的严重缺陷：S1核酸酶的切割会使克隆的5端某些序列丢失。,EcoRI甲基化酶封闭EcoRI位点；,一种化学合成的寡核苷酸，含有一种以上的限制酶识别序列。,其与连杆的重要差别是衔接头的一端或两端已具有一种或两种限制性内切酶切割产生的粘性末端。,3 构建cDNA文库筛选目的基因,引导第二条cDNA的合成,连杆,Linker,一种按预先设计，化学合成的寡核苷酸片断。,一般由,8,12,个核苷酸组成，以中线为轴两侧互补对称。,其上有一种或几种限制性内切酶识别序列。,将连杆先连接到待连接的一种或两种,DNA,片段的末端，然后用合适的限制酶切割连杆，使待连接的两种,DNA,片段产生互补粘性末端，最后,DNA,连接酶催化，产生重组,DNA,分子。,衔接头,adaptor,一种化学合成的寡核苷酸，,含有一种以上的限制酶识别序列,。其与连杆的重要差别是衔接头的一端或两端已具有一种或两种限制性内切酶切割产生的,粘性末端,。,18,18,采用,噬菌体载体进行基因组文库的构建示意图,Sau,3AI,和,Bam,HI,是同尾酶。,18,19,19,基因组,DNA,的处理：,用两种酶对基因组进行部分酶切；,Eco,RI,甲基化酶,封闭,Eco,RI,位点；,Eco,RI,连杆,(linker),与平末端连接；,Eco,RI,酶切产生粘性末端；,噬菌体置换型,载体的处理：,Cos,位点退火，载体成环；,用,Eco,RI,酶切产生,1,个大片段，,2,个小片段；,去掉小片段，保留大片段；,连接反应：,大片段与基因组片段连接形成噬菌体基因组的串联体；,在,cos,位点酶切成噬菌体大小后包装进噬菌体头部；,感染宿主并在宿主中增殖。,Producing representative genomic libraries in cloning vectors (,1978,年，最早,用两种不常见的酶酶切基因组，进行克隆,。,),19,20,20,Creation of a genomic DNA library using the phage-vector EMBL3A.(1983,年，,采用一种酶对基因组进行切割。,该克隆策略方便高效。,),A convenient simplication can be achieved by using a single restriction endonuclease that cuts frequently,such as,Sau,3AI.,Sau,3AI and,Bam,HI create the same cohesive ends.,20,除了,噬菌体衍生载体之外，还有其他许多的高容量克隆载体（如,BAC,、,PAC,、,YAC,等）都可以用于基因组文库的构建。这些载体的优点是平均插入片段的大小远大于,置换载体，但文库较难制备，插入片段较大，不容易直接操作。,21,21,21,3,构建,cDNA,文库筛选目的基因,mRNA,cDNA,反,/,逆转录,DNA,转录,A,cDNA library is prepared,by reverse-transcribing a population of mRNAs and,then screened for particular clones.,cDNA,library,：,某种生物基因组,转录,的的全部,mRNA,经反转录产生的各种,cDNA,分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为,cDNA,文库,。,*,Character of cDNA,library,（,cDNA,文库的特点）,分离的目的基因可直接用于表达,比,DNA,文库小的多，容易构建，文库的筛选比较简单易行；,以,mRNA,为材料，反映的是该生物,特定发育时期、特定组织,(,或器官,),在某种环境条件下的基因表达情况,，,有一定的时效性；,只与编码序列有关，因此 不能反映内含子、启动子、终止子以及与核糖体识别等的序列的结构和功能特征,23,23,*,23,Process constructing a cDNA library,（,cDNA,文库的构建流程）,24,24,*,(i)isolate mRNA,（,提取总,RNA,并分离,mRNA,）,;,(ii)rst-strand DNA synthesis on the mRNA template,carried out with a reverse transcriptase,（用,Oligo(dT),（或随机引物）作引物，以,RNA,为模板，,逆转录酶合成,cDNA,的第一链,）,;,(iii)removal of the RNA template,（,去除,RNA/DNA,杂合链中的,RNA,，碱处理或,RNaseH,处理）,;,(iV)second-strand DNA synthesis using the first DNA strand as a template,carried out with a DNA-dependent DNA polymerase,such as,E.coli,DNA polymerase I,（,以,cDNA,第一链为模板，用,DNA,依赖性的,DNA,聚合酶合成,cDNA,第二链,）,.,1,：分离,mRNA,，通过反转录的方式合成,cDNA,24,25,25,*,2,：,cDNA,与载体连接，形成重组载体,在双链,cDNA,末端接上人工接头,，,即可与载体连接，转入受体菌。（通过接头形成粘性末端而连接）,或借助末端转移酶,给载体和双链,cDNA,的,3,端分别加上几个,C,或,G,，,成为粘性末端。（通过寡聚化形成粘性末端而连接）,3,：噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化（导入宿主中繁殖），得到,cDNA,文库,注：刚合成的,cDNA,双链的末端几乎不可能正好是内切酶的酶切位点，因此这里肯定不存在由粘性末端直接相连的例子。这一点与基因组,DNA,与载体的相连有所区别。,4,：从,cDNA,文库中筛选目的重组子,25,26,26,26,27,27,How to isolate mRNA,？,利用,mRNA,都含有一段,polyA,尾巴的特点，采用亲和层析柱将,mRNA,从总,RNA,（,rRNA,、,tRNA,等）中分离纯化。,mRNA,只占总,RNA,的,1%-2%,。,合成,12,20,个,dT,组成,oligo,（,dT,）作为引物与,mRNA poly,（,A,）尾巴杂交，用反转录酶引导可合成,cDNA,第一链。,27,28,28,cDNA,克隆中使用的反转录酶,AMV,：来源于,禽类,的成髓细胞瘤病毒,MMLV,：大肠杆菌中克隆的莫罗尼氏,鼠,白血病病毒,天然来源的酶缺乏持续合成能力，但具有内在的,RNA,酶活力，容易使,RNA,模板降解，不利于生产全长的,cDNA,天然来源的酶，发挥功能的最适温度是,37,，且通常会在富含二级结构的序列出转录终止,这些结构往往出现在,5,端或,3,端的非翻译区（这样就不容易形成全长,cDNA,）,29,29,现在常用的酶：天然的酶,改造,过以利于生产全长,cDNA,现在,常用突变了的反转录酶,（老鼠病毒来源的），它们缺乏,RNaseH,活性，因此更有利于生产全长,cDNA,如：,Life Technologies,公司生产的改造后的,Super-ScriptII,可以在,50,下进行反转录。,Development of cDNA cloning strategies,An early cDNA cloning strategy,involving hairpin-primed second-strand DNA synthesis and homopolymer tailing to insert the cDNA into the vector.(,早期的策略：,发卡方法,：引导,cDNA,第二链的合成,),30,30,Improved method for cDNA cloning.The first strand is tailed with oligo(dC)allowing the second strand to be initiated using an oligo(dG)primer.(,改进的策略：,寡聚加帽法,：对,cDNA,第一链同聚物加尾后，设计相对应的引物合成,cDNA,第二链,),*,30,早期,cDNA,策略,31,31,mRNA,的分离,Oligo(dT),引物与,mRNA,退火，,cDNA,第一链合成,降解,mRNA,模板，,cDNA3,末端形成双链发夹结构,以发夹结构为引物，合成,cDNA,第二链,用,S1,核酸酶去掉发卡结构,缺点：,S1,核酸酶的作用，会使,cDNA5,端的序列部分丢失,31,32,32,合成的,cDNA,双链通过,同聚物加尾,的方式与载体相连后导入宿主细胞中,1976,年，发卡方法的严重缺陷,：,S1,核酸酶的切割会使克隆的,5,端某些序列丢失,。因此后来有了另一种方法。,32,33,33,改进的,cDNA,克隆策略,寡聚,T,引物在,mRNA,多腺苷酸尾部退火,首条,cDNA,链的合成,在,cDNA,第一条链的末端,(3,端,),加上,oligo(dC),末端转移酶,合成相应的寡,oligo(dG),引物,引导第二条,cDNA,的合成,33,34,34,Improved method for cDNA cloning.The first strand is tailed with oligo(dC)allowing the second strand to be initiated using an oligo(dG)primer.,改进的,cDNA,克隆策略。第一条,cDNA,链用寡聚,C,加尾，使第二条链可以有寡聚,G,初始化。,34,举例,3,化学合成法,多用于合成短的,DNA,片段，,如引物、,DNA,探针等。,DNA,合成仪,磷酸二酯法,亚磷酸三酯法,寡核苷酸的连接,化学合成的产物,引物：合成目的基因的引物和测序引物,实际的克隆子数目：大于理论,形成一个含有所有片段的菌群，这个菌群就是一个基因组文库,其与连杆的重要差别是衔接头的一端或两端已具有一种或两种限制性内切酶切割产生的粘性末端。,生物有机体的每一个基因在文库中都有其克隆，该克隆的基因片段里包括着间隔序列，所以基因组文库可真实地显示基因组的全部结构信息。,Cos位点退火，载体成环；,MMLV：大肠杆菌中克隆的莫罗尼氏鼠白血病病毒,酶切法：内切酶Sau3A进行局部消化。,(iii)removal of the RNA template（去除RNA/DNA杂合链中的RNA，碱处理或RNaseH处理）;,如：Sau3A与BamHI的酶切末端相同（二者是同尾酶）。,（3）重组载体各自转导受体细胞，扩大培养，得到基因组文库,3：噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化（导入宿主中繁殖），得到cDNA文库,衔接头 adaptor,谢谢观看,谢谢观看,