细菌的生理生化反应教案.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细菌的生理生化反应,常见生化反应,生化反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。,糖酵解试验,过氧化氢酶试验,淀粉水解试验,V-P,试验,甲基红（,Methyl Red,）,试验,靛基质（,Imdole,）,试验,枸椽酸盐试验：,尿素酶（,Urease,）,试验,硝酸盐还原试验,三糖铁（,TSI,）,琼脂试验,动力试验,API系列,VITEK全自动化微生物鉴定系统,碳水化合物的代谢试验糖（醇、苷）类发酵试验,原理,：细菌含有发酵糖（醇、苷）的酶分解糖类产酸、产气、或仅产酸。,培养基,：含有0.5%,-1%,的糖（醇、苷）的液体、半固体、固体、或微量生化管。,方法,：纯菌种接种培养基，要求的温度，数小时至两周，微量管注意保持湿润，以免干燥。,结果,：能分解糖（醇、苷）类产酸时，培养基中的指示剂呈酸性反应。若能产气时，培养基可出现开裂气泡等现象,意义,：肠杆菌科尤为重要,糖酵解试验,根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂,溴甲酚紫,（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置,杜氏小管,观察。,糖酵解试验,方法：,取糖发酵管培养基，此时培养基应呈澄清、紫色，倒立小管内无气泡，接种细菌后置37温箱培养1824小时，观察结果。,结果：,1、确定细菌是否生长,2、产酸，则培养基指示剂（溴甲酚紫）变为黄色，以“+”表示。,3、产酸又产气，则培养基除变黄外，在倒置的小管中有气泡，用“”表示。,4、不发酵糖类，培养基仍为紫色，小管内无气泡，以“-”表示。,大肠杆菌,伤寒杆菌,副伤寒杆菌,葡萄糖,+,乳糖,-,-,糖酵解试验,糖酵解试验,葡萄糖：,+,-,麦芽糖：,-,+,糖酵解试验,甘露醇：,+,-,鼠李糖：,-,+,碳水化合物的代谢试验氧化-发酵试验（O/F）,原理,：细菌分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；可以进行无氧降解的，称为发酵型；不分解葡萄糖的称为产碱型,培养基,：,HL,二氏培养基,方法,：待测菌同时接种两只,HL,培养基，其中一只滴加无菌的液体石蜡，高度不少于1,cm，35,培养48,h,或更长,结果,：两只均无变化为产碱型；两只均产酸为发酵型；仅不加石蜡的产酸为氧化型,意义,：肠杆菌科与非发酵菌的鉴别；葡萄球菌与微球菌的鉴别，前者为发酵型，后者为氧化型,碳水化合物的代谢试验ONPG（半乳糖苷酶试验）,原理,：有的细菌可以产生,半乳糖苷酶，分解邻-硝基酚-,半乳糖苷生成黄色的邻-硝基酚,方法,：从,KIA,上取菌，于0.25,ML,无菌生理盐水中制菌悬液，加甲苯一滴，使酶释放。37,水浴5,min,加0.25,mlONPG,试剂，水浴20,min-3h,观察结果,结果,：呈现黄色为阳性，一般20-30,min,内显色,意义,：迅速及迟缓发酵乳糖的细菌为阳性，不发酵乳糖的细菌为阴性。本试验主要用于迟缓发酵乳糖的细菌的快速鉴,注意,：该试验不一定与分解乳糖相一致，决定于细菌产生的酶及其活性,碳水化合物的代谢试验七叶苷水解试验,原理,：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，后者与培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应生成黑色化合物，使培养基呈黑色,方法,：将待测菌接种于七叶苷培养基，培养后观察结果,结果,：培养基变黑为阳性，不变为阴性,意义,：,D,群链球菌与其他链球菌的区别，,前者为阳性；肺炎克雷伯、阴沟肠杆菌多,阳性,+,-,原理,：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，后者进一步生成甲酸、乙酸、乳酸等，使培养基的,PH,降至4.5以下，加入甲基红试剂后显红色即阳性。若产酸量少，或进一步转化为其他物质，则培养基的,PH,仍在6.2以上，加入甲基红试剂后显黄色，为阴性,培养基：,葡萄糖蛋白胨水,方法,：待测菌接种于培养基，2-4天后，,加入甲基红试剂，观察结果,结果,：呈现红色为阳性，橘红色为弱阳,性，黄色为阴性,意义,：大肠、沙门、志贺、变形、枸橼酸,杆菌、等为阳性；肠杆菌属、哈夫尼亚菌属为阴性,碳水化合物的代谢试验MR试验,原理,：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，后者脱羧产生乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱性环境中被氧化为二乙酰，进而与培养基中蛋白胨内精氨酸中的胍基作用，生成红色化合物，即为,V-P,试验阳性。,奈酚可加速此反应,培养基：,葡萄糖蛋白胨水,方法,：待测菌接种于培养基，35,48h，,加入甲液（6%,奈酚酒精溶液）,和乙液（40%,KOH,溶液）,结果,：20,min,内出现红色为阳性，如,无红色，且于35,4h,后仍如故即为,阴性,意义,：本试验常与甲基红一起试验，前者阳性则后者多阴性,碳水化合物的代谢试验VP试验,原理,：某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水中的色氨酸产生吲哚，当加入吲哚试剂-柯氏试剂（对二氨基苯甲醛）后则形成红色的玫瑰吲哚,培养基：,蛋白胨水,方法,：待测菌接种于培养基，35,培养,24-48小时，沿试管壁缓慢加入吲哚试剂,结果,：于两者接触面出现红色为阳性，无,色为阴性,意义,：肠杆菌科细菌的鉴定；大肠杆菌、产酸克雷伯为阳性,试剂,：柯氏试剂（对二氨基苯甲醛）与欧氏试剂的区别：前者含戊醇，后者含酒精，都含浓盐酸，前者主要成分为后者10倍，后者灵敏度更高,蛋白质和氨基酸的代谢试验吲哚（叮基质）试验,玫瑰红色,蛋白质和氨基酸的代谢试验明胶液化试验,原理,：细菌产生明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体变为液体,方法,：待测菌接种于明胶培养基，22,培养7天。若用35,孵育，因明胶在此温度下自行液化，故在观察前先置4,冰箱30,min,再观察,结果,：培养基呈液化状态为阳性,意义,：多数假单胞菌能液化明胶，肠杆菌科细菌如：沙雷菌、变形杆菌、阴沟杆菌等可液化明胶,蛋白质和氨基酸的代谢试验硫化氢试验,原理,：某些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，产生硫化氢，后者遇亚铁离子或铅则形成黑褐色的沉淀。,培养基,：醋酸铅培养基,方法,：待测菌接种于醋酸铅培养基，,35,培养24-48小时观察结果,结果,：培养基变黑为阳性，不变为,阴性,意义,：沙门菌属、爱德华菌属、亚利桑那菌属、枸橼酸杆菌属、变形杆菌属、腐败假单胞菌为阳性,原理,：某些细菌具有尿素分解酶，能分解尿素产生大量的氨，使培养基呈碱性,培养基：,尿素培养基,方法,：待测菌接种于培养基，35,培养18-24小时观察结果,结果,：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变为阴性,意义,：变形杆菌、摩根氏、雷氏普罗维登氏、克雷伯氏为阳性,蛋白质和氨基酸的代谢试验尿素分解试验,1 未接种,2 尿素酶阳性,3 尿素酶阴性,蛋白质和氨基酸的代谢试验苯丙氨酸脱氨酶（TDA）试验,原理,：某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基形成苯丙酮酸，加入三氯化铁试剂后产生绿色反应,培养基,：苯丙氨酸琼脂培养基,方法,：待测菌接种于培养基，35,培养18-24小时，加10%三氯化铁试剂3-4滴，观察结果,结果,：肠杆菌科变形杆菌、普罗维登氏菌、摩根氏菌阳性,蛋白质和氨基酸的代谢试验氨基酸脱羧酶试验,原理,：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺和二氧化碳，使培养基变碱，使指示剂显色,培养基,：氨基酸脱羧酶培养基和氨基酸对照培养基,方法,：待测菌接种于培养基，并加入无菌液体石蜡，35,培养18-24小时观察结果,结果,：对照管应呈黄色，测定管呈紫色，（指示剂为溴甲酚紫）测定管呈黄色为阴性；若对照管呈紫色则试验无意义,意义,：肠杆菌科细菌的鉴定,原理,：某些细菌能以枸橼酸盐为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱,培养基：,枸橼酸盐培养基,方法,：待测菌接种于培养基35,培养18-24小时，观察结果,结果,：培养基中的溴麝香草酚兰,指示剂由淡绿色变为深蓝色为阳性，,不变色为阴性,意义,：克雷伯菌属、沙门菌属常为阳性,有机酸盐和铵盐的利用试验枸橼酸盐利用试验,原理,：有的细菌可利用丙二酸盐为唯一碳源，将其分解生成碳酸钠，使培养基变碱,试剂：,1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺,方法,：待测菌接种于培养基35,培养18-24小时，观察结果,结果,：培养基由淡绿变为深蓝为阳性，无变化则为阴性,意义,：肠杆菌科属间鉴别,有机酸盐和铵盐的利用试验丙二酸盐利用试验,原理,：细胞色素氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素,C,氧化，再由氧化型细胞色素,C,使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物,培养基：,丙二酸盐培养基,方法,：菌落法、滤纸法、试剂纸片法。前二者浪费试剂，后者节省,结果,：10秒内呈深紫红色为阳性,意义,：肠杆菌科细菌与假单胞菌的区别，前者阴性，后者多阳性奈瑟菌属、莫拉菌属也为阳性,呼吸酶类试验细胞色素氧化酶试验,原理,：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和氧，出现气泡,试剂,：3%过氧化氢溶液,方法,：取菌置于洁净的试管或玻片上，然,后滴加3%过氧化氢数滴，观察结果,结果,：出现大量气泡的为阳性，不产生气,泡的为阴性,意义,：用于革兰氏阳性球菌的鉴别，葡萄,球菌和微球菌为阳性，链球菌和肠球菌为,阴性，肠球菌多假阳性,呼吸酶类试验过氧化氢酶（触酶）试验,原理,：硝酸盐还原成亚硝酸盐和氨，氨再转化为氨基酸和其他含氮化合物；硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸系统中的终末受氢体。有的细菌能使硝酸盐还原成亚硝酸盐，有的能使其还原为亚硝酸盐和离子铵，有的能使其还原为氮,培养基,：硝酸盐培养基,方法,：待测菌接种于培养基，35,培养18-24小时，将甲乙液分别加入培养基，立即观察结果,结果,：出现红色为阳性,呼吸酶类试验硝酸盐还原试验,意义,：肠杆菌科为阳性；铜绿、嗜麦芽能产生氮气；链球菌肠球菌阴性，葡萄球菌阳性,注意,：若加入试剂后无反应，可能是硝酸盐没有被还原，试验阴性硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物而致假阴性，此时要加入少许锌粉，若出现红色则为阴性，不产生红色则为假阴性，实际为阳性,呼吸酶类试验硝酸盐还原试验,没有颜色变化：,加入少量锌粉,变红阴性（硝酸盐未被还原）,不变阳性（亚硝酸盐已经分解成氨和氮）,原理,：,G,+,菌的细胞壁在稀碱溶液中易于破裂，释放出未断裂的,DNA,螺旋，使氢氧化钾菌悬液呈现粘性，可用接种环搅拌后拉出粘丝来，而,G,+,菌在稀碱溶液中没有上述变化。,方法,：取1滴 40,g/L KOH,水溶液（应新鲜配制）于洁净玻片上，取新鲜菌落少许，与,KOH,水溶液搅拌混匀，并每隔几秒钟上提接种环，观察能否拉出粘丝。,结果,：用接种环拉出粘丝者为阳性，仍为混悬液者为阴性。,应用,：主要用于,G,-,菌,与易脱色的,G,+,菌的鉴别。大多数,G,-,菌,于5,-10s,内出现阳性反应，有的则需30,-45s，,假单胞菌、无色杆菌、黄杆菌、产碱杆菌、莫拉菌等大多数在10,s,内呈阳性，不动杆菌、莫拉菌反应较慢，大多数菌株在60,s,内出现阳性，而,G,+,菌在60,s,以后仍为阴性。,呼吸酶类试验氢氧化钾拉丝试验,其他生化试验淀粉水解试验,某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。,原理,：某些细菌产生,DNA,酶，可使长链,DNA,水解，后者可被酸沉淀，长链,DNA,水解后形成的寡核苷酸链则溶于酸，所以在平板上加入酸后会在菌落周围形成透明环,培养基,：0.2%,DNA,琼脂平板,方法,：点种被测菌于上述平板，35,培养18-24小时；用1,mol/L,盐酸覆盖平板，观察结果,结果,：菌落周围出现透明环为阳性,意义,：金黄色葡萄球菌、沙雷氏菌、变形杆菌阳性,其他生化试验DNA酶试验,原理,：致病性葡萄球菌；结合凝固酶、游离凝固酶；纤维蛋白原变为纤维蛋白使血浆凝固,方法,：1 玻片法检测结合凝固酶 兔血浆,2 试管法检测游离凝固酶 0.5,ml,兔血浆 37,水浴3-4,结果,：玻片法中有明显颗粒样凝集而盐水对照无凝集为阳性；试管法以血浆凝固为阳性,意义,：致病性葡萄球菌；金黄色葡萄球菌多阳性,其他生化试验凝固酶试验,原理,：,B,群链球菌能产生,CAMP,因子，可促进葡萄球菌的,溶血毒素活性，在两菌的交界处溶血力加强，出现矢形溶血区,培养基,：,BAP,方法,：先以产,溶血毒素的金葡菌划一横线接种于,BAP，,再将被测菌与前一划线作垂直划线接种，两线不能相交，0.5-1,cm，37,培养18-24小时观察结果，设阴阳性对照,结果,：在两划线交界处出现箭头样溶血区为阳性,意义,：,B,群链球菌阳性，马红球菌出现反,CAMP,现象,其他生化试验CAMP试验,原理,：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，使细菌发生自溶,试剂,：10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁,方法,：,平板法：,滴加10%去氧胆酸钠一环于被测菌落上35,30min,观察结果。,试管法：,0.9,ml,被测菌培养物加入10%去氧胆酸钠0.1,ml,后置35,水浴10-30,min,观察结果,结果,：菌落消失，或培养物变透明为阳性,意义,：肺炎链球菌阳性,其他生化试验胆汁溶菌酶试验,主要用于厌氧菌的鉴定,产气夹膜梭菌卵磷脂酶阳性,中间类杆菌脂酶阳性,致病性葡萄球菌硷性磷酸酶阳性，如金黄色葡萄球菌等,其他生化试验脂酶、卵磷脂酶、碱性磷酸酶,鉴定细菌用的抑菌或敏感试验O/129试验,原理,：,O/129（,二氨基喋啶）对弧菌属有抑制作用，而对气单胞菌属无抑制作用,培养基,：碱性琼脂培养基,方法,：纸片法药敏 40,g,/,片,结果,：有抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药,意义,：弧菌、邻单胞菌敏感；气单胞菌属耐药,鉴定细菌用的抑菌或敏感试验杆菌肽试验,原理,：,A,群链球菌对杆菌肽几乎全敏感，而其他链球菌则耐药,培养基,：,BAP,方法,：同纸片法药敏0.04,U/,片,结果,：10,mm,敏感；10,mm,耐药,意义,：,A,群链球菌敏感,鉴定细菌用的抑菌或敏感试验奥普托欣Optochin试验试验,原理,：肺炎链球菌对,Optochin,敏感，其他链球菌无抑制作用,培养基,：,BAP,方法,：同纸片法药敏 5,g,/,片,结果,：抑菌环直径14,mm,敏感；14,mm,耐药此时加做胆汁溶菌试验证实,意义,：肺炎链球菌对,Optochin,敏感,三糖铁（TSI）琼脂试验,本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。,a.uninoculated b.little change/alkaline/-/-c.alkaline/acid/-/+d.acid/acid/+/+e.acid/acid/+/-,三糖铁（TSI）琼脂试验,沙门氏菌的TSI试验,动力观察：,Principle The lower agar concentration in the medium allows limited movement of motile bacteria from the area of the stab.Motility will be detectable as diffuse growth radiating from the stab line.,A special dye,a tetrazolium salt(,TTC,)may be added to make the radiating growth more visible as the reddish diffuse area.,MOTILITY TEST1.Pseudomonas aeruginosa（铜绿假单胞菌）：Motile 2.Staphylococcus aureus：Non-motile 3.Bacillus subtilis：Motile,