实验六血糖及血清胆固醇测定.ppt

,生物化学与分子生物学实验,单击此处编辑母版标题样式,*,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,实验六血糖及血清胆固醇测定,实验六血糖及血清胆固醇测定实验六血糖及血清胆固醇测定一、酶法GOD-POD测血清葡萄糖含量,一、酶法GOD-POD测血清葡萄糖含量,实验目的,掌握葡萄糖氧化酶法测定血糖含量的原理和方法,掌握测定血糖的临床意义,邻甲苯胺法,酶法：,血糖的测定方法：,准确度、灵敏度高，稳定性好,葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法,GOD-POD,实验原理,偶联酶法测血糖,葡萄糖,O,2,H,2,O,2,葡萄糖酸,葡萄糖氧化酶,GOD,H,2,O,2,4-,氨基,安替比林,H,2,O,醌亚胺染料,过氧化物酶,POD,红色,红色醌亚胺染料在,500nm,处具有吸收峰,采用标准比照法可计算得到样品中葡萄糖,浓度,红色醌亚胺染料的生成量与葡萄糖含量,成正比,实验器材,试管1.55cm3、试管架,吸量管2mL1、洗耳球,微量加样器：,20,l,的,Pipetman,恒温水浴箱,离心机、离心管10ml2,实验试剂,葡萄糖测定试剂盒：原装试剂在,2,8,避光保存，有效期,15,个月。混合后,2,8,可稳定,1,个月，室温可稳定,3,天,葡萄糖标准液：,100mg/Dl(,5.55mmol/L),实验样品：新鲜无溶血血清,实验操作,1.酶工作液配置直接用试剂盒,2.,标本处理,抽取全血,3-,5 mL,37,保温,15,分钟,3000,转,/min,离心,10min,取上清液备用,3.取3支干净枯燥的小试管按表参加试剂,4.,各管加好后混匀，置,37,水浴,30,min,，光径比色杯，以空白试剂调零，在,500nm,波长下比色,先加体积少的，再加多的,管号,试剂,空白管,标准管,待测管,蒸馏水,(,L,）,10,标准葡萄糖,(,L,）,10,待测血清,(,L,）,10,酶工作液,(,mL,）,1.5,1.5,1.5,标准液吸取后应立即上盖，以防水分挥发,工作液混浊或有絮状物视为失效,本法特异性高，维生素,C,，谷胱甘肽，左,旋多巴引起负偏差,10,l,液体必须全部溶于,酶工作液中,注意,10L液体不易准确参加，实验时要仔细检查移液枪的密封性。此外，移液枪外壁不要沾有液体。,二、酶法COD-PAP测血清总胆固醇(TC),实验目的,掌握酶法测定血清总胆固醇含量的原理,熟悉酶法测定血清总胆固醇含量的操作方法,了解总胆固醇测定的临床意义,胆固醇酯酶,+FFA,胆甾烯酮,+H,2,O,2,胆固醇氧化酶,COD,实验原理,+4-,氨基安替比林,+,酚,醌亚胺,过氧化物酶,H,2,O,2,PAP,胆固醇酯,游离胆固醇,红色的醌型化合物在510nm处有吸收峰，颜色深浅与总胆固醇的浓度成正比。,采用标准比照法可计算其含量。,实验器材,小试管3、试管架,刻度吸量管2mL1、洗耳球,微量加样器,(20,l),恒温水浴箱,离心机、离心管10ml2,实验试剂,R1,液：磷酸盐缓冲液、对氯酚,R2,液：,4-,氨基安替比林、酶,胆固醇标准液：,实验步骤,1.,工作试剂配制：,R1 10ml+R2 1ml,混合，可保存,1,周,2.,标本处理,:,抽取全血3,5ml,37,保温,15,分钟,3000,转,/min,离心,10,min,取上清液备用,最适样品为当日空腹采集无溶血无乳糜的血清。,3.取3支小试管编号，按表参加试剂,管号,试剂,空白管,标准管,待测管,蒸馏水,（,l,）,10,标准液,（,l,）,10,样品,（,l,）,10,工作试剂,（,ml,）,0.6,0.6,0.6,充分混合，,37,水浴,15,分钟,蒸馏水,（,ml,）,1.0,1.0,1.0,光径比色杯，以空白试剂调零，在,510nm,波长下比色,本卷须知,最后加酶工作试剂，各管反响时间应一致,工作试剂防止葡萄糖和甘油三酯污染,假设需检测游离胆固醇含量，将酶试剂去掉胆固醇酯酶即可,实验结果与讨论,计算结果,记录结果,A,标,=,标准管吸光度,A,待,=,待测管吸光度,C,待,=,A,待,A,标,C,标,C,标,=,血液中葡萄糖或胆固醇浓度,C,标,=,标准液中葡萄糖或胆固醇浓度,血清葡萄糖测定临床意义,病理性高血糖：,常见于糖尿病；颅内压升高，如颅内出血，颅外伤等；脱水引起的高血糖，如呕吐、腹泻和高热等也可使血糖升高；胰岛 细胞瘤等,病理性低血糖：,常见于胰岛素分泌异常、肝功能严重衰退等；严重肝病患者，肝脏不能有效地调节血糖；糖原累积症。,危险阈值：,高胆固醇血症：,TC,增高：常见于动脉粥样硬化、高脂蛋白血症、梗阻性黄疸、肾病综合征、甲状腺功能低下、慢性肾功能衰竭、糖尿病等,TC,降低：常见于低脂蛋白血症、贫血、肝脏疾病、营养吸收不良、恶性肿瘤等。,血清总胆固醇测定临床意义,思考题,正常人的血糖为什么能维持在一定水平,?,胰岛素和肾上腺素对血糖有何影响,?,为什么,?,测定血清总胆固醇的临床意义有哪些？,返回目录,722,型分光光度计,能在可见光谱区域内对样品物质作定量分析。广泛应用于医药卫生、临床检验、生物化学、石油化工、环境保护、质量控制，是生物化学实验室常用分析仪器之一。,原理,不同的物质对光的吸收具有选择性，有其各自的吸收光谱。当某单色光通过溶液时，能量会被吸收而减弱，能量减弱程度和物质浓度有一定关系,“MODE键：,用于设置测试方式,“100%T键：,用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或零吸光度,“0%T键：,用于自动调整零透射比,“波长设置旋钮：,用于设置分析波长,722E,型,比色皿的使用方法,拿比色皿时，只能拿毛玻璃面，不能碰透光面，以免污染,使用前，一般先用水冲洗，再用蒸馏水润洗，还要用所盛溶液润洗,外壁的水用擦镜纸或吸水纸沾干，以保护透光面,所盛液体量约占总体积的,3/4,，即距管口,1cm,左右,722E,型分光光度计操作方法,1.预热仪器关盖，拉半档，T模式,2.,选定波长,5.调 T=100 (关盖，拉杆全推进，光路对着空白管,4.调 T=0%(关盖，拉半档，光路对着1、2格间的挡板,3.放入样品光面对着光路的方向,7.将模式调至“A，拉动拉杆至标准管和样本管，分别测定A值并记录,8.按回“T模式，推回半档的位置，拿出比色皿，关机,6.,重复,4-5,步至仪器显示数值稳定。,返回,光路,返回,光路,返回,本卷须知,每更换一次波长，重新调“0和“100%；,每次做完实验后，应立即洗净比色皿,为了防止光电管疲劳，不测定时必须将光路切断，,以延长光电管使用寿命,当仪器停顿工作时，切断电源，并用套子盖住仪,器，做好使用登记,朗伯比尔定律：,A=c l,：摩尔吸光系数,c,：溶液的浓度,l,：液层的厚度,A,：物质的吸光度,当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合于比色原理,-,朗伯,-,比耳,定律,实验结果与讨论,2.,计算结果,1.,记录结果,A,标,=,标准管吸光度,A,待,=,待测管吸光度,C,待,=,A,待,A,标,C,标,C,标,=,血液中葡萄糖浓度,C,标,=,标准液中葡萄糖浓度,C,标,=5.55 mmol/L,本法测得人血糖的正常值为：,3.89,思考题,1.,正常人的血糖为什么能维持在一定水平,?,2.,胰岛素和肾上腺素对血糖有何影响,?,为什么,?,3.本试验测定血糖的根本原理是什么?,在那些情况下需做血糖含量的测定?,Thank You,世界触手可及,携手共进，齐创精品工程,