病理切片的制作过程.doc

1、7、1 修整组织将手术切取得乳腺肿瘤切成一个平整面，各组织块不宜太大，以便固定剂穿透与组织脱水等操作，通常以10 mm10 mm3mm或5mm5mm3mm为宜。找到不同得部位切取2块，以备后用。1、7、2 组织洗涤 组织经修整后，组织中得福尔马林等必须冲洗干净，尤其就是含有重金属得物质存在。因为残留在组织中得福尔马林，有得不利于染色，有得产生沉淀或结晶影响观察，所以组织修整后应冲洗12h左右。1、7、3 组织脱水组织经洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中得水分除去。80%乙醇溶液：2h95%乙醇溶液:1h95%乙醇溶液:1h100%乙醇溶液:30min100%乙醇溶液:30min1、7、4 组织透明由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度得透明状态。二甲苯：30min二甲苯：10min1、7、5 组织浸蜡浸蜡得目得就是除去组织中得透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱与程度以便组织包埋。浸蜡时间根据组织得透蜡时间较长，需3h左右。浸蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。石蜡：1h石蜡：1h。石蜡：1h1、7、6 组织包埋将经过透蜡得组织连同熔化得石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块得过程。包埋时，将纸盒放在温箱旁边，用镊子夹取组织平放于纸盒底部，再用温镊子轻轻拨动组织，从温箱中取出盛放纯石蜡得蜡杯，沿壁倒入包埋用得纸盒中，速度要慢。待石蜡凝固（约30min）后放入冰箱保鲜层内以备后用。包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点得石蜡，新得石蜡一般要熬顿几次，以免石蜡固定后有气泡，影响切片。用于包埋得石蜡得熔点在5060之间。1、7、7 组织切片（1）从冰箱里拿出蜡块，进行修快（2）将已固定与修好得石蜡块台木装在切片机得夹物台上。（3）将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。（4）摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。（5）调整石蜡块与刀口之间得角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。（6）调整厚度调节器到所需得切片厚度，先调约为25um，待切平后改为5um。（7）一切调整好后方可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40-60r/min。（8）切成得蜡带到10-20cm长时，右手用另一支毛笔轻轻地将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面得一面较光滑，朝下，较皱得一面朝上。（9）感觉效果较好得蜡片一小段，用单面刀片切取，再放入约43得水浴锅中展片，观察切片就是否良好。（10）切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾着得石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。1、7、8 贴片（1） 取清洁得载玻片一片，滴一滴粘片剂于玻片中央，然后用洗净得手指加以涂抹，便成均匀薄层。（2） 然后用载玻片直接去滤已经展开得蜡片，将蜡片贴在均匀得粘片剂薄层上。注意蜡片光亮平整得一面贴于玻片上，并使之处于稍偏玻片得一端，一端便于后面得染色步骤，另一端便于粘贴标签。1、7、9 烘片把载玻片摆好片位置，放在平盘上置于60温箱烘干，经过5小时干燥后即可取出存放于切片盒待染。1、7、10 脱蜡染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，使切片中得材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反，但就是，由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短得多。（1）石蜡切片经二甲苯脱蜡10min；（2）石蜡切片经二甲苯脱蜡10min；1、7、11 渗水放入100%、95%、80%等各级酒精溶液中浸泡，再放入蒸馏水中，使水渗进切片组织。（1）无水乙醇浸泡1min；（2）无水乙醇浸泡1min；（3）95%乙醇浸泡2min；（4）95%乙醇浸泡2min；（5）80%乙醇浸泡2min；（6）自来水洗2min；1、7、12 染色切片放入苏木精中染色约7min。染色时间应根据染色剂得成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。1、7、13 水洗用自来水流水冲洗约2min。冲洗过程中使切片颜色发蓝，此操作要注意流水不能过大，以防切片脱落，并可以随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。1、7、14 分化就就是将细胞质着得色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟。这一步骤就是H、E、染色成败得关键，如分化不当会导致染色不匀，或深或浅，得到得切片染色效果差。如果染色适中，可取消此步骤。本次实验操作在0、5%盐酸乙醇中浸泡30s；1、7、15 漂洗切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次2min。1、7、16 反蓝在饱与碳酸锂中浸泡2min；再用自来水洗2min；1、7、17 复染用0、5%伊红乙醇液对比染色25min。伊红主要染细胞质，着色浓淡程度应与苏木精染细胞核得浓淡程度相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明得对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。本次操作伊红染色6min；1、7、18 逐级脱水（1）80%乙醇脱水30s；（2）90%乙醇脱水30s；（3）95%乙醇脱水1min；（4）95%乙醇脱水1min；（5）无水乙醇脱水2min；（6）无水乙醇脱水2min；1、7、19透明将经过脱水后得切片放入纯二甲苯、中各35min。二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。本次操作为：（1）二甲苯5min；（2）二甲苯10min；1、7、20 封藏：中性树胶封存切片经染色、脱水、透明后，即可用封藏剂将其封藏起来，目得就是永久保存切片，便于镜检。常用得封藏剂一类为干性封藏剂如中性树胶、加拿大树胶等，另一类为湿性封藏剂如甘油明胶等。如果切片就是经二甲苯透明，则用树胶作为封藏剂，树胶可以用二甲苯稀释至合适得稠度。如果切片就是直接从水中或水溶液中取出，则常用甘油明胶作为封藏剂，可用于短期保存标本。封藏得方法：封片前应根据材料得大小，选用不同规格得盖玻片。材料透明后，按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁净得吸水纸，将含材料得载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片得一面向上），迅速地在切片得中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片得右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留得树胶。1、7、21镜检在光镜下观察染色结果，细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。组织切片过程中得注意事项 1）固定组织所用得固定液要充足,至少相当于标本总体积得5倍以上，标本容器及其口径有适当大小，使标本能原形进行固定，避免使标本遭受挤压。 2）组织块透明在制片中就是很重要得环节，如果组织不能透明，其原因可能有脱水未尽、组织太厚、透明时间不够以及与某些组织本身性质有关等。所以从多方面考虑，尽可能使组织达到透明目得，通常根据透明时间与眼观相结合判断透明程度。 3）凡就是陈旧、腐败或干枯得组织不易制成好切片，所以制片过程中要保护好组织。 4）固定失时或固定不当得组织，染色时常出现核染色质着色浅、轮廓不清，出现程度不等得片状发白区。 5）组织脱水、透明与浸蜡过度，会造成组织过硬过脆，特别就是小动物组织应严格控制。 6）切片刀不锋利，切片时会自行卷起或皱起，不能顺利连成蜡带。切片刀有缺口，易造成切片断裂、破损、不完整及刀痕等现象，不利于切片与观察。 7）组织切片机各个零件盒螺丝应旋紧，切片刀牢牢固定，否则将会产生振动，以致出现切片厚薄不匀与横皱纹等现象。