医学微生物学-实验-脓汁和粪便标本中病原菌的检测.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,试验器材准备,第1页,革兰染色器材准备,第2页,医学微生物学试验综合性试验一,脓汁和粪便标本中病原菌检测（四）,斜面培养物观察,显微镜油镜使用,革兰染色法,肉汤接种法,第3页,斜面培养物观察,分别从斜面正面和后面观察。,从,普通平板,上挑取黄色或白色菌落接种斜面，菌苔颜色，还是原来菌落颜色，黄色或白色。,从,伊红美蓝,平板上挑取紫黑色或粉红色菌落接种斜面，菌苔已经没有原来菌落颜色。菌苔灰白色、表面湿润、光滑、不透明（紫黑）或半透明（粉红）。,为了讲解方便，以后试验，依然,沿用,首次分离得到菌落颜色，紫黑色或粉红色。,从斜面上取菌时，不论是涂片，还是接种，每次只取,半个小菌落,大小菌量；接种环或接种针在培养基表面轻轻刮一下即可。,第4页,显微镜油镜使用P,13,10物镜标本位置滴加香柏油100油镜浸泡油中,几乎与标本接触（工作距离0.13mm）细调整调焦，观察物像统计结果关闭电源。,油镜处理：擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭擦镜纸擦拭油镜。,显微镜罩上防尘罩,横放,在试验柜内。,(顺德校区）试验台两侧电源插座，只能插入一个插头，请选择离你最近电源插座。,（校本部）试验台中间，三个位插座，中间那位插孔没有电，不能使用，只能用两侧插座。,第5页,细菌显微镜检验法,显微镜：光学显微镜,目镜：10倍,物镜：油镜头（90或100倍）,放大倍数：1090或100900或1000,镜油：香柏油或石蜡油,香柏油折射率（n1.515），玻片折射率（n1.52），石蜡油（n1.46），空气（n1.00）。,油,镜使用完成必须擦拭,油,镜头。,第6页,100倍浸油物镜使用方法,油镜放入光路之前，一定要在标本观察部位上加一滴浸油。,旋转物镜转盘，使油镜进入光路，用微调旋钮对好焦距。,假如浸油内有气泡，会影响观察，可稍微旋转物镜转盘，使油镜往返经过1,2次浸油，排除油内气泡。,第7页,油,透镜,光线,载玻片,第8页,奥林巴斯 CX21型 生物显微镜,（,试验柜内，,每人一台）,注意：只能横放，不得竖放。,第9页,细菌染色法,单染色法：只用一个染料染色，,如美蓝或复红，能清楚观察菌体大小、形态与排列，,不能判别细菌。,复染色法（判别染色）：采取两种或两种以上不一样染料进行先后染色，可将细菌染成不一样颜色，方便判别细菌。,革兰染色,抗酸染色,特殊染色,第10页,革兰染色gram stain,目标要求：,学习并初步掌握革兰染色法。,了解革兰染色法原理，及其在细菌分类判定中主要性。,革兰染色法是丹麦细菌学家Christain Gram于1884年创建一个细菌染色方法，已经有120多年历史，仍在广泛使用，是细菌学中最为经典染色法,。,第11页,革兰染色法原理三种学说,通透性学说,：G,+,菌细胞壁结构比较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，酒精不易透入，反而可使细胞壁脱水而形成一道屏障，阻止染料向细胞外渗。G,-,菌细胞壁比较疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖均含有大量脂质，易被酒精溶解，致使细胞壁通透性增高，细胞内结晶紫碘复合物轻易被酒精脱出。,等电学说,：G,+,菌等电点(pH23)比G,-,菌(pH45)低，普通染色时染液酸碱度在pH7.0左右，电离后阳性菌带负电荷比阴性菌多，所以与带正电荷结晶紫染料结合牢靠，不易脱色。,化学学说,：G,+,菌细胞内含有某种特殊化学成份，普通认为是核糖核酸镁盐与多糖复合物，它与染料媒染剂复合物结合，使已着色细菌不易脱色。,第12页,革兰染色意义,判别细菌：把细菌分成G,+,和G,-,两大类。,选择抗菌药品：G,+,球菌,对青霉素敏感,G,-,杆菌,耐药。,了解细菌致病机理：G,+,菌大多产生外毒素,G,-,菌产生内毒素。,革兰染色步骤,涂片 干燥 固定 染色,第13页,加生理盐水3,4ul，2滴。,菌苔少许（1mm小菌落半量）与盐水混匀，涂成1cm,2,。,涂毕环移至涂膜,中央侧立，菌膜,破裂,接种环灭菌。,涂片,甲，乙黄色，紫黑。丙，丁白色，粉红。,第14页,涂片,干燥,固定,第15页,革兰染色法(gram stain),涂片 干燥 固定,结晶紫 初染1分钟水洗,卢戈碘液媒染1分钟水洗,95乙醇脱色约20秒钟水洗,稀释复红复染1分钟水洗,吸干,镜检。,取菌适量,涂片均匀,水洗轻缓,脱色适当。,影响革兰染色关键步骤是涂片太厚、脱色困难。,第16页,革兰阳性菌,革兰阴性菌,第17页,革兰阴性菌,革兰阳性菌,第18页,细菌大小与形态,球菌 coccus：直径约1um。不一样种类球菌排列方式不一样，有不一样名称。如葡萄球菌、链球菌等。,杆菌 bacillus：长短粗细很不一致。中等大小杆菌直径约1um，长2,3um。,螺形菌 spiral bacteria：菌体弯曲；一个弯曲为弧菌(vibrio)，菌体长2,3um；数个弯曲为螺菌(spirillum)，菌体长3,6um。,第19页,脓汁标本直接镜检,方法:取标本直接涂片,革兰染色镜检。,初步诊疗汇报:,“查见革兰阳性葡萄串状排列球菌，疑似葡萄球菌”。,“查见革兰阳性链状排列球菌，疑似链球菌。”,第20页,甲黄色,乙白色,丙紫黑,丁粉红。,标识：组号，颜色,35培养46小时,细菌浓度1.510,8,/ml,液体培养基接种法P,10,第21页,细菌在液体培养基生长情况,均匀浑浊：,比如金黄色葡萄球菌,大肠杆菌。,表面生长形成菌膜：,比如枯草杆菌。,沉淀生长：,比如链球菌。,第22页,安全警告,此次试验操作，可产生几十至几百个微生物气溶胶颗粒。,气溶胶粒径100um沉降很快,50um在0.4s内扩散开,5um经过呼吸道直接抵达肺泡。,Pike博士对试验室感染统计分析结果发觉，不明原因感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引发。,试验时应坐着，,在酒精灯半径20厘米范围内操作，,保持平静、有序，尽可能少说话、少走动，以免感染病原菌。,第23页,器材准备,第24页,油镜使用P,13,10物镜标本位置滴加香柏油100油镜浸泡油中,几乎与标本接触（工作距离0.13mm）细调整调焦，观察物像统计结果关闭电源 擦镜纸拭去香柏油 擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3）混合液擦拭擦镜纸擦拭油镜。,革兰染色法P,15,甲，乙黄色，紫黑。,丙，丁白色，粉红。,肉汤接种法P,10,甲黄色,乙白色,丙紫黑,丁粉红。,第25页,思索题,怎样使用油镜?,革兰染色法关键步骤是什么?为何?,染色时为何通常要用新鲜细菌培养物?,第26页,第27页,试验小结,用普通平板，从浓汁标本中分离得到,黄色,、,白色,两种菌落，这两株细菌，显微镜油镜下均为G,+,球菌，排列不规则，呈葡萄串状，是经典葡萄球菌。结合菌落色素，这两株葡萄球菌可能是金黄色葡萄球菌和白色葡萄球菌。,电镜,油镜,葡萄,第28页,葡萄球菌三个种判别,试验,金黄色,葡萄球菌,表皮,葡萄球菌,腐生,葡萄球菌,血浆凝固酶,+,-,-,甘露醇发酵,+,-,-,新生霉素敏感性,S,S,R,A蛋白,+,-,-,注：敏感（Sensitive S）,耐药（Resistant R）。,第29页,用伊红美蓝平板,从粪便标本分离、取得紫黑色和粉红色半透明两种菌落。,紫黑色,菌落是能分解乳糖非致病菌大肠埃希菌。,粉红色,菌落是,不能分解乳糖致病菌,。显微镜下，均为G,-,杆菌，散在排列，从形态上不能判别是什么细菌。,电镜,油镜,第30页,惯用器材摆放次序：电源插座试管架酒精灯污物盘。,试管架上器材：按接种针、接种环、油性笔和打火机次序，分别放置在试管架中间两行，靠近电源插座一侧。,器材使用以后，必须放回原处，依次摆整齐。,第31页,革兰染色瓶,染色架,石蜡油,拭镜纸,吸水纸,乙醇乙醚,微生物学公共器材柜-1,（西侧边台中段）,第32页,试验室器材 整齐有序,第33页,